JPH10262662A - ホキシムのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ホキシムのハプテン化合物、抗体
及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明の化合物は、以下の式（１） 【化１】 または式（２） 【化２】 ［式中、Ｘは、ＳまたはＯであり；そしてｎは１−１０
の整数である］で表される構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｏ,Ｏ−ジエチル
α−シアノベンジリデンアミノオキシホスホノチオアー
ト（以下、本明細書中「ホキシム」と言う）のハプテン
化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ホキシムは、以下の式（３）：

【化４】 で表される構造を有する、有機リン系化合物である。

【０００４】ホキシムは、日本では農薬登録されていな
いので農薬としての使用はされていないが、木材防虫
剤、防蟻剤等の殺虫剤として使用されている。外国では
穀物貯蔵庫、サイロ、船倉などの害虫駆除、家庭での衛
生害虫駆除、穀物、わた、とうもろこしなどで土壌害虫
駆除を目的として使われている（「最新農薬の残留分析
法」 第４８９頁−第４９０頁、農薬残留分析法研究班
編集 中央法規出版）。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。ホキシムについては、食品衛生法に基づき残留基準
値が、米・穀類（０．０５ｐｐｍ）、ばれいしょ（０．
０５ｐｐｍ）、野菜（０．０５−０．２ｐｐｍ）、綿実
（０．０５ｐｐｍ）等、定められている（「最新農薬の
残留分析法」、前述）。環境や食品に関する安全確保の
ためには、これらに含有される、ホキシムの量を迅速、
かつ正確に測定することが必要である。

【０００６】従来、ホキシムは、穀類等の試料から抽出
し、精製した後、高速液体カラムクロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）等により分析されてきた。例えば、試料を
アセトンで抽出して、フロリジルカラムクロマトグラフ
ィーで精製した後、ＨＰＬＣで分析する方法が採用され
ている。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手
間と時間を必要とし、分析に熟練を有すること、並び
に、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問
題点がある。ホキシムの測定は、特に輸入農産物等の残
留農薬の分析においては、短時間で膨大な数の試料の分
析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、
迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求され
てきている。

【０００７】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００８】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【０００９】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ホキシムのような低分子化
合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すこと
ができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化
合物に結合させることによって初めて一団のエピトープ
として行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こ
し、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生され
る。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原
性を生じる分子を総称して「ハプテン」という。

【００１０】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１１】しかしながら、ホキシムについてはその必
要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はも
とより、そのような抗体を作製するためのハプテンも本
発明前には得られていなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホキシムに
特異的に反応する新規な抗体を作製するための抗原を構
成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提
供することを目的とする。

【００１３】本発明は、また、前記ホキシム誘導体と高
分子化合物又は標識物質との結合体を提供することを目
的とする。当該結合体はホキシムに特異的に反応する抗
体を作製するための抗原となる。

【００１４】本発明は、さらに、ホキシムに強い親和性
を有する新規な抗体もしくはそのフラグメント、及びそ
の作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書
において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能
な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１５】本発明はその一態様において、ホキシムに
反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１６】本発明は、さらにまた、前記抗体またはそ
のフラグメントを産生するハイブリドーマを提供するこ
とを目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体またはそのフ
ラグメントを使用することを含む、ホキシムの免疫学的
測定方法を提供することを目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ホキシムにスペーサーアーム及び高分子
との結合に利用できる官能基を導入した、ホキシムの誘
導体をハプテンとして使用することにより、前記化合物
に特異的な抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至
った。

【００１９】本発明の対象となるホキシムは、以下の式
（３）：

【化５】 で表される化合物である。

【００２０】抗体作製のためのハプテンとして使用され
る誘導体は、前記ホキシムの

【化６】 の部分を

【化７】 ［式中、Ｘは、ＳまたはＯであり；そしてｎは１−１０
の整数であり、好ましくは２−７である］に変化させた
ものである。即ち、本発明のホキシム誘導体は、以下の
式（１）：

【化８】 または式（２）

【化９】 ［式（１）または（２）中、Ｘおよびｎは前述した通り
である］で表される構造を有する化合物である。

【００２１】本発明のホキシムにスペーサーアーム及び
結合に利用できる官能基を結合させた誘導体をハプテン
として適当な高分子化合物と結合させたものを抗原とし
て用いることによって、ホキシムに特異的な抗体を得る
ことができる。

【００２２】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ホキシムに反応する
抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物又は
該抗体を用いるホキシムの免疫学的測定方法に関する。

【００２３】ホキシムの誘導体の作製 式（１）または（２）で表されるホキシム誘導体は、公
知の方法に従って作製することができる。例えば、以下
に記載するような方法がある。

【００２４】I．式（１）の化合物の合成 ａ）ＸがＳの場合 式（１）において、ＸがＳである化合物は、例えば以下
の方法に従って行うことができる。

【００２５】先ず、以下の式（Ｚ１）：

【化１０】 で表されるジクロロチオリン酸エチルと、以下の式（Ｚ
２）：

【化１１】 ［式（Ｚ２）中、Ｒはカルボキシル基の保護基であり、
ｎは前述した通りである］で表されるエステルとを、有
機溶媒中、塩基の存在下で反応させて、以下の式（Ｚ
３）：

【化１２】 ［式（Ｚ３）中、Ｒおよびｎは前述した通りである］で
表されるクロロチオリン酸誘導体を得る。

【００２６】式（Ｚ２）で表されるエステル化合物は、
公知の方法、例えば、Ｓｋｅｒｒｉｔｔらの文献（Ｊ.
Ａｇｒｉｃ. Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ. １９９２，４０，１
４６６−１４７０）に記載されている方法に従って、容
易に合成することができる。

【００２７】式（Ｚ３）の合成には有機溶媒としては、
例えば、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、ペンタ
ン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホル
ム、１,２−ジクロロエタン、酢酸エチル、エタノー
ル、ジグリム、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサ
メチルリン酸トリアミド等、またはこれらの混合溶媒を
用いることができる。塩基としては、例えば、炭酸カリ
ウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウ
ム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラー
ト、トリエチルアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、水
酸化ナトリウム、リチウムジイソプロピルアミド等を用
いることができる。反応は、マイナス１０℃から溶媒の
沸点の温度、好ましくは２０℃−３０℃で、１０−５０
時間、好ましくは、２０−３０時間行う。ジクロロチオ
リン酸エチルと式（Ｚ２）のアミノエステルはモル比
で、２.０：１.０−１.０：２.０、好ましくは １.
２：１.０−１.０：１.２の割合で使用する。

【００２８】Ｒで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えば、メチル基、エ
チル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキ
シベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル
基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブ
チルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイ
ソプロピルシリル基、トリメチルシリルエトキシメチル
基等を挙げることができる。

【００２９】次に、式（Ｚ３）のクロロチオリン酸誘導
体と以下の式（Ｚ４）：

【化１３】 で表されるオキシムを、有機溶媒中、塩基の存在下で反
応させて、以下の式（Ｚ５）：

【化１４】 ［式（Ｚ５）中、Ｒおよびｎは前述した通りである］表
される、ホキシム誘導体のエステル化合物を得る。

【００３０】有機溶媒および塩基は、上述した式（Ｚ
３）の化合物を合成する場合と同様のものを使用するこ
とができる。反応は、マイナス１０℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは ６０℃−８５℃で、０.５−５時
間、好ましくは、２−３時間行う。式（Ｚ３）のクロロ
チオリン酸誘導体と式（Ｚ４）のオキシムはモル比で、
２.０：１.０−１.０：２.０、好ましくは１.２：１.０
−１.０：１.２の割合で使用する。

【００３１】さらに、式（Ｚ５）のエステル化合物か
ら、Ｒで示されるカルボキシル基の保護基を除去するこ
とにより、ＸがＳである、式（１）の化合物を得ること
ができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ
加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができ
る。

【００３２】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｚ
５）のエステル化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベン
ゼン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有
機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、
トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ
−トルエンスルホン酸を加えて、０℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは室温から５０℃で、５分−１０時間、
好ましくは１−５時間撹拌反応させることにより式
（１）のカルボン酸化合物を得ることができる。

【００３３】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｚ
５）のエステル化合物を、好ましくはメタノール、エタ
ノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の
有機溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウムまたは水酸
化カリウム水溶液を加えて、０℃から溶媒の沸点の温
度、好ましくは室温から５０℃で、５分−５時間、好ま
しくは１−２時間撹拌反応させることにより式（１）の
ホキシム誘導体カルボン酸化合物を得ることができる。

【００３４】更に、Ｒがベンジル基の場合、除去は水素
による接触還元反応によっても行うことができる。

【００３５】更にまた、Ｒがシリル基の場合、脱保護は
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニ
ウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬に
よっても行うことができる。

【００３６】ｂ）ＸがＯの場合 式（１）において、ＸがＯであるホスホリル体化合物
は、例えば、ＸがＳであるチオホスホリル体化合物から
以下のようにして合成することができる。

【００３７】チオホスホリル体である式（１）の化合物
を、ジクロロメタン、クロロホルム、１,２−ジクロロ
エタン、ベンゼン、トルエン等の有機溶媒に溶解させ
て、同様の有機溶媒に溶解させた２−クロロ過安息香
酸、過酢酸、過酸化水素等を加えて、反応させる。これ
により式（１）の化合物のＰ原子に二重結合しているＳ
原子がＯ原子に置換され、ホスホリル体化合物が得られ
る。反応は、マイナス２０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくはマイナス１０℃−１０℃で、０.５−５時間、
好ましくは、１−２時間行う。

【００３８】ＩＩ．式（２）の化合物の合成 式（２）の化合物は、式（１）の合成方法において、式
（Ｚ２）のエステル化合物の代わりに、以下の式（Ｚ
６）：

【化１５】 で表される、トラネキサム酸ｔｅｒｔ−ブチルを用いる
ことにより得ることができる。

【００３９】式（Ｚ６）のトラネキサム酸ｔｅｒｔ−ブ
チルは、式（Ｚ２）のエステル化合物と同様に、公知の
方法、例えば、Ｓｋｅｒｒｉｔｔらの文献（Ｊ. Ａｇｒ
ｉｃ. Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ. １９９２，４０，１４６６
−１４７０）に記載されている方法に従って、容易に合
成することができる。

【００４０】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶
操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とする
ことができる。

【００４１】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４２】ホキシム誘導体と高分子化合物との結合体
の作製 上述のように合成されたホキシム誘導体を適当な高分子
化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。

【００４３】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ］と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ
及びＢＳＡが好ましい。

【００４４】ホキシム誘導体と高分子化合物との結合
は、例えば、活性化エステル法（A.E.KARU et al.:J. A
gric. Food Chem. 42 301-309 (1994)）、又は混合酸無
水物法（B.F.Erlanger et al.:J.Biol.Chem. 234 1090-
1094 (1954)）等の公知の方法によって行うことができ
る。

【００４５】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ドエステルを生成させる。

【００４６】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」という）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０−１０：１、より好ましくは、
１：１−１：１０、最も好ましくは１：１である。反応
温度は、０−１００℃、好ましくは５−５０℃、より好
ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、
好ましくは３０分−６時間、より好ましくは１−２時間
である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行
うことができる。

【００４７】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、
反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、
より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、ホキシム誘導体と高分子
化合物との結合体を得ることができる。

【００４８】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下
に行われる。塩基性化合物としてはショッテン−バウマ
ン反応において慣用されている化合物を使用することが
できる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミ
ン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジ
ン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡ
ＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等
が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００
℃、好ましくは０℃−５０℃において行われ、反応時間
は５分−１０時間、好ましくは５分−２時間である。得
られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マ
イナス２０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃に
おいて行われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは
５分−５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で
行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されて
いるいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキ
サン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメト
キシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベン
ゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸
メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリ
ン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられ
る。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステ
ルとしては、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸
メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ
蟻酸エチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテン
とハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い
範囲から適宜選択され得る。

【００４９】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をホキシム誘導体に結合させたものを、免疫学
測定方法において使用することができる。標識物質とし
ては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」
と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオ
レセインイソチオシアネート、ローダミン等の発色物
質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが
ある。

【００５０】ポリクローナル抗体の作製 ホキシム誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、
慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を
作製することができる。例えば、ホキシム誘導体−ＫＬ
Ｈ結合体をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に
溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュ
バント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したもの
を、免疫用抗原として動物に免疫することによって行
う。免疫される動物としては当該分野で常用されるもの
をいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウ
サギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。

【００５１】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。投与は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間
隔で複数回行うことができる。

【００５２】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ホキシムと反応するポリクローナ
ル抗体の存在を評価することができる。

【００５３】モノクローナル抗体の作製 ホキシム誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、
公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作製す
ることができる。

【００５４】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するホキシム誘導体と高分
子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００５５】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Ha
rbor Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学
（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９
８６年）に記載されている。

【００５６】以下、上述の本発明のホキシムに対するモ
ノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限
されないことは当業者によって明らかであろう。

【００５７】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５８】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５９】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００６０】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００６１】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法に
ついては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）
に記載されている。別の融合方法としては、電気処理
（電気融合）による方法を採用することもできる（大河
内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８
７）。その他の方法を適宜採用することもできる。ま
た、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えば
ミエローマ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いれ
ばよい。

【００６２】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使
用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキ
サンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製し
たＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６３】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ホキシムに対する抗体活性を測定す
る。

【００６４】さらに、測定によりホキシムに反応する抗
体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クロ
ーニングを行う。この細胞クローニング法としては、限
界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれ
るように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に
撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターに
よって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによっ
て１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙
げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。

【００６５】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗ホキシムモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、１０
％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用いら
れる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度
５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒温器中）
で培養するのが好ましい。

【００６６】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６７】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ホキシムモノクローナル抗体として使用する
ことができるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる
塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精
製することにより抗ホキシムモノクローナル抗体を得る
ことができる。さらに高度な精製が必要な場合には、イ
オン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることによ
り実施できる。

【００６８】以上のようにして得られた抗ホキシムモノ
クローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法などの
公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定す
ることができる。

【００６９】抗体によるホキシムの測定 本発明で使用する抗体によるホキシムの測定方法として
は、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩ
ＳＡ法（Engvall,E., Methods in Enzymol.,70, 419-4
39 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、
凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法等
の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハ
イブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆
Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３
月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬ
ＩＳＡ法が汎用されている。

【００７０】ホキシムの測定は各種ＥＬＩＳＡ法のう
ち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のよ
うな手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原で
あるホキシム誘導体と高分子化合物との結合体を担体に
固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗
原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングす
る。（ｃ）これに各種濃度のホキシムを含む試料及び抗
体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び遊離ホキシムに
競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び遊離
ホキシム−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原
−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した
検量線から試料中の遊離ホキシムの量を決定することが
できる。

【００７１】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００７２】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができ
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは
０.０５−５μｇ／ｍｌが適している。また、担体とし
て９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場
合には、３００μｌ／ウェル以下で２０−１５０μｌ／
ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条
件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュ
ベーションが適している。

【００７３】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体作製に使用したホキシム誘導体と高分子化合物との
結合体のみならず、式（１）または（２）で表される他
の誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式（１）または（２）においてＸがＳであ
るチオホスホリル体を抗原として抗体を作製した場合、
ＸがＯである対応するホスホリル体を固相化抗原として
用いることもできる。また、式（１）の化合物で、ｎの
数が相違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いる
こともできる。さらに、式（１）および（２）に含まれ
ない他のホキシム類似化合物も、固相化抗原として使用
することも可能である。

【００７４】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（ホキ
シム誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化した担
体において、ホキシム誘導体部分以外に後で添加する抗
体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱら
それを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例
えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるい
は、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、大日本
製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキン
グ剤として市販されているものを使用することもでき
る。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗
原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液
［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した
８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、
約４℃−室温で、１時間−５時間インキュベーションし
た後、緩衝液で洗浄することにより行われる。洗浄液と
しては特に制限はないが、例えば、６０ｍＭ ＮａＣｌ
を添加したホウ酸緩衝液を用いることができる。

【００７５】次いで（ｃ）工程において、ホキシムを含
む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗
原及び遊離ホキシムと反応させることにより、固相化抗
原−抗体複合体及び遊離ホキシム−抗体複合体が生成す
る。

【００７６】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のホキシムに対する抗体を加え、更に第二抗体と
して標識物質を結合した第一抗体に対する抗体を順次加
えて反応させる。

【００７７】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を用いるこ
とができる。

【００７８】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５００−１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用い
てもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００７９】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からホキシムの量を
算出することができる。

【００８０】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば基質として過酸化水
素、発色試薬として３,３',５,５'−テトラメチルベン
ジジンまたはｏ−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰ
Ｄ」と言う）を使用する。限定されるわけではないが、
発色溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの
硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３,
３',５,５'−テトラメチルベンジジンを使用する場合、
４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場
合、４９０ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に
結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する
場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし
て発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、
４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。

【００８１】遊離のホキシムを添加しない反応溶液の吸
光度に対して、ホキシムを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のホキシムを添加した反応液の阻害率により予め作成
しておいた検量線を用いて、試料中のホキシムの濃度を
算出できる。

【００８２】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のモノクローナル抗体ＰＯＸ５３−３は、間
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってホキシムを約１０−１
００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定するすることができる（実
施例８、図１）。

【００８３】あるいは、ホキシムの測定は、例えば以下
に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を担体に固相
化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のホキシムを含む試
料に、ホキシム誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプ
テンを加えた混合物を調製する。 （ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のホキシムの量を決定する。

【００８４】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００８５】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のホキシム及
び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸着さ
れる部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で
行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合
阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００８６】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ホキシム誘導体を酵素に結合する方法であ
れば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよい。例え
ば、前述した活性化エステル法を採用することができ
る。調製した酵素結合ハプテンは、ホキシムを含む試料
と混合する。

【００８７】なお、酵素等の標識化合物に結合させるハ
プテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固
相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したホキシム
誘導体自体のみならず、式（１）または（２）で表され
る他の誘導体、さらに、式（１）および（２）に含まれ
ない他のホキシム類似化合物も使用可能である。

【００８８】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のホキシムと酵素結合ハプ
テンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体との
複合体が生成する。ホキシムを含む試料は適当な緩衝液
で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応
は例えば室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液
で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテンを除去す
る。洗浄液は、例えば６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホ
ウ酸緩衝液を使用することができる。

【００８９】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からホキシムの量を算出することができる。

【００９０】本発明のモノクローナル抗体ＰＯＸ５３−
３は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってホキシムを約
４−８０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができる（実
施例１１、図２）。

【００９１】本発明の抗体のメタノール耐性 本発明の一態様であるモノクローナル抗体ＰＯＸ５３−
３はさらに、上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば約０−１０％の濃度のメタノール存在下においてホキ
シムを濃度依存的に認識できる（実施例１２、図３）。
ホキシムは有機溶媒に易溶性であり、一般に分析はメタ
ノール等の有機溶媒中で行われることを考慮すると、本
発明のモノクローナル抗体のこのような特性は非常に有
効である。

【００９２】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法または間接競合阻害
法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を
調べることができる。ＰＯＸ５３−３は、例えば直接競
合阻害ＥＬＩＳＡ法において類縁化合物、例えば、パラ
チオン、クロルフェンビンホス、フェニトロチオンとは
０.２％以下しか交差反応しない。したがって、ＰＯＸ
５３−３はホキシムとの反応特異性が高いことが明らか
になった（実施例１３ 表１）。

【００９３】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００９４】

【実施例】実施例１ ホキシム誘導体−１の合成

【化１６】

【００９５】ジクロロチオリン酸エチル（１）１．８ｇ
（１０ｍｍｏｌ）と４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル
１．６ｇ（１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１５０ｍｌ
に溶解させ、炭酸カリウム４．３ｇ（３０ｍｍｏｌ）を
加えて室温で２４時間撹拌した。反応液をセライトで濾
過して、濃縮後、シリカゲルカラム（ｎ−へキサン：酢
酸エチル＝４：１）で精製すると、透明液体として１．
６ｇ（収率５９％）の（２）を得た。

【００９６】クロロチオリン酸誘導体（２）２．８ｇ
（１０ｍｍｏｌ）とオキシム２．２ｇ（１５ｍｍｏｌ）
のアセトニトリル溶液１００ｍｌに、炭酸カリウム６ｇ
（４３ｍｍｏｌ）を加えて８５℃で２．５時間撹拌し
た。反応液を室温に戻した後にセライトで濾過した。そ
の濾液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ
−へキサン：酢酸エチル＝９：１）で精製すると、透明
液体として１．０ｇ（収率２４％）の（３）を得た。

【００９７】ハプテンエステル（３）１．０ｇ（２．４
ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ト
リフルオロ酢酸５ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。
反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィ
ー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製する
と、透明液体として０．８ｇ（収率９３％）の（４）を
得た。

【００９８】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．２４−１．５１（ｔ，３Ｈ）、１．７５−２．００
（ｍ，２Ｈ） ２．３２−２．５８（ｔ，２Ｈ）、３．００−３．４１
（ｍ，２Ｈ） ４．１８−４．４０（ｍ，２Ｈ）、７．４０−７．６２
（ｍ，３Ｈ） ７．８０−８．０３（ｍ，２Ｈ）

【００９９】実施例２ ホキシム誘導体−２の合成

【化１７】

【０１００】ジクロロチオリン酸エチル（１）４．１ｇ
（２３ｍｍｏｌ）と６−アミノカプロン酸ｔｅｒｔ−ブ
チル３．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１００
ｍｌに溶解させ、炭酸カリウム８．４ｇ（６１ｍｍｏ
ｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。反応液をセライ
トで濾過して、濃縮後、シリカゲルカラム（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝９：１から４：１）で精製すると、透
明液体として３．９ｇ（収率５８％）の（２）を得た。

【０１０１】クロロチオリン酸誘導体（２）３．４ｇ
（１０ｍｍｏｌ）とオキシム１．５ｇ（１０ｍｍｏｌ）
のアセトニトリル溶液１５０ｍｌに、炭酸カリウム４．
３ｇ（２７ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で３時間撹拌し
た。反応液を室温に戻した後にセライトで濾過した。そ
の濾液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ
−へキサン：酢酸エチル＝１９：１）で粗精製した。こ
の粗生成物をそのまま次の反応に用いた。

【０１０２】（３）を含んだ粗生成物を８０ｍｌのジク
ロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸５０ｍｌを加
えて室温で１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して、
シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エ
チル＝４：１から１：１）で精製すると、透明液体とし
て１．２ｇ（２段階の通算収率３０％）の（４）を得
た。

【０１０３】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１₃） １．２８−１．４８（重複，５Ｈ）、１．５１−１．７
３（重複，４Ｈ） ２．３０−２．４０（ｔ， ２Ｈ）、３．０３−３．２
１（ｍ， ２Ｈ） ３．２５−３．４１（ｍ， １Ｈ）、４．２０−４．３
８（ｍ， ２Ｈ） ７．４０‐７．６０（ｍ， ３Ｈ）、７．８１−７．９
４（ｍ， ２Ｈ）

【０１０４】実施例３ ホキシム誘導体−３の合成

【化１８】

【０１０５】チオホスホリル化合物（１）２００ｍｇ
（０．５２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン４００ｇに溶解
させて、氷冷下で２−クロロ過安息香酸１００ｍｇ
（０．５８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液５．８ｍｌ
を滴下した。氷冷下で２時間撹拌後に反応液を濃縮し
て、シリカゲルカラム（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝
４：１から１：１、そして酢酸エチル）で精製すると、
透明液体として４０ｍｇ（収率２１％）の（２）を得
た。

【０１０６】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．３０−１．４９（重複，５Ｈ）、１．４９−１．７
３（重複，４Ｈ） ２．２７−２．４１（ｔ， ２Ｈ）、２．９７−３．１
４（ｍ， ２Ｈ） ３．７０−３．８３（ｍ， １Ｈ）、４．２３−４．４
０（ｍ， ２Ｈ） ７．３４−７．６２（ｍ， ３Ｈ）、７．８１−７．９
３（ｍ， ２Ｈ）

【０１０７】実施例４ ホキシム誘導体−４の合成 Ａ．４−(アミノメチル)シクロヘキサンカルボン酸ｔｅ
ｒｔ−ブチル（４）の合成

【化１９】

【０１０８】４−(ベンジルオキシカルボニルアミノメ
チル）シクロヘキサンカルボン酸（２）の合成 ２５ｇ（１６０ｍｍｏｌ）の４−(アミノメチル)シクロ
ヘキサンカルボン酸（１）を２Ｎの水酸化ナトリウム溶
液８０ｍｌに溶解して氷冷した。この溶液を激しく撹拌
しながらクロロ蟻酸ベンジル（３６ｇ、２１０ｍｍｏ
ｌ）と２Ｎの水酸化ナトリウム溶液１０４ｍｌをそれぞ
れ２回に分けて交互に滴下した。滴下終了後、室温に戻
して一晩撹拌した。氷冷したジエチルエーテル（５０ｍ
ｌ×３回）で未反応のクロロ蟻酸ベンジルを抽出除去し
た後、氷冷下で濃塩酸を添加してｐＨを約２に調整し
た。ジエチルエーテル（５０ｍｌ×４回）で抽出し、集
めたジエチルエーテル抽出物を無水硫酸ナトリウムで脱
水した。次に、吸引濾過で硫酸ナトリウムを除き、減圧
濃縮した。その濃縮物を酢酸エチルに溶解し、ヘキサン
を加えると白色結晶として、４−(ベンジルオキシカル
ボニルアミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（２）
を得た（収量３０.６ｇ、収率６６％）。

【０１０９】４−(ベンジルオキシカルボニルアミノメ
チル）シクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（３）の合成 １０.６ｇ（３６ｍｍｏｌ）の４−(ベンジルオキシカル
ボニルアミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（２）
のジクロロメタン溶液（１５０ｍｌ）を食塩−氷でマイ
ナス１６℃に冷却して、その溶液中にイソブテンの気流
を５分間ゆっくりと流し込んだ。次に、濃硫酸０.４ｍ
ｌをシリンジでゆっくりと滴下して、再びイソブテンを
１０分間ゆっくりと流し込んだ。この溶液をそのまま一
日撹拌し続けた。反応液をそのまま減圧濃縮してシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エ
チル＝４：１）で精製して白色結晶として、４−(ベン
ジルオキシカルボニルアミノメチル）シクロヘキサンカ
ルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３）を得た（収量７.５
ｇ、収率５９％）。

【０１１０】４−（アミノメチル）シクロヘキサンカル
ボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４）の合成 ７.２ｇ（２０.１ｍｍｏｌ）の４−(ベンジルオキシカ
ルボニルアミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸ｔｅ
ｒｔ−ブチル（３）のメタノール溶液（２００ｍｌ）
に、１.０ｇのパラジウムカーボンを加えて水素存在下
で水素の吸収が終了するまで撹拌した。次に、反応溶液
を濾過後に減圧濃縮して、真空ポンプで完全に溶媒を除
くと白色固体として４−（アミノメチル）シクロヘキサ
ンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４）を得た（収量４.
４ｇ、収率１００％）。

【０１１１】Ｂ．ホキシム誘導体−４の合成

【化２０】

【０１１２】ジクロロチオリン酸エチル（１）４．１ｇ
（２２ｍｍｏｌ）と上記Ａで合成した４−（アミノメチ
ル）シクロヘキサンカルボン酸ｔｅｒｔーブチル４．２
ｇ（２０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１５０ｍｌに溶解
させ、炭酸カリウム８．０ｇ（５８ｍｍｏｌ）を加えて
室温で２４時間撹拌した。反応液をセライトで濾過し
て、濃縮後、シリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エ
チル＝９：１）で精製すると、透明液体として１．５ｇ
（収率２１％）の（２）を得た。

【０１１３】クロロチオリン酸誘導体（２）１．７ｇ
（４．８ｍｍｏｌ）とオキシム０．７ｇ（４．８ｍｍｏ
ｌ）のアセトニトリル溶液１００ｍｌに、炭酸カリウム
２．０ｇ（１４ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で３時間撹拌
した。反応液を室温に戻した後にセライトで濾過した。
その濾液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー
（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝４：１）で粗精製した。
この粗生成物をそのまま次の反応に用いた。

【０１１４】ハプテンエステル（３）を含んだ粗生成物
を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオ
ロ酢酸２０ｍｌを加えて室温で１．５時間捜拝した。反
応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー
（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製すると、
透明液体として０．６３ｇ（２段階の通算収率５５％）
の（４）を得た。

【０１１５】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１₃） ０．８０−１．０６（ｍ， ２Ｈ）、１．１９一１．５
５（重複，６Ｈ） １．７８−２．１２（重複，４Ｈ）、２．１３−２．３
４（ｍ， １Ｈ） ２．８６−３．０７（ｍ， ２Ｈ）、３．４８−３．６
７（ｍ， １Ｈ） ４．１９−４．３８（ｍ， ２Ｈ）、７．４１−７．６
１（ｍ， ３Ｈ） ７．８１−７．９７（ｍ， ２Ｈ）

【０１１６】実施例５ 免疫用抗原の作製 免疫用抗原として、ホキシム誘導体とＫＬＨまたはＢＳ
Ａとの結合体を以下のように活性化エステル法によって
作製した。

【０１１７】実施例１−４で作製したホキシム誘導体−
１から−４を．各々 ３． ５μｍｏｌを秤量し、ＤＭＳ
Ｏ ５０μｌに溶解した。次にこれらの溶液にＮ−ヒド
ロキシこはく酸イミド（５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ １０
μｌに溶解したものを添加した。さらに１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩（４μｍｏｌ）をＤＭＳ０ ２０μｌに溶解し添加し
た。室温にて１．５時間反応させた後、この反応溶液に
８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μｌに溶解
したＫＬＨまたはＢＳＡ１０ｍｇをさらに添加し、再び
室温にて１．５時間反応させた。反応終了後、ダルベッ
コのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ（−）」という）に
対して透析し、ホキシム誘導体−ＫＬＨ結合体、ホキシ
ム誘導体−ＢＳＡ結合体を各々調製した。

【０１１８】実施例６ 免疫感作 免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例５で調
製したホキシム誘導体−ＫＬＨ結合体１００μｇをＰＢ
Ｓ（−）５０μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジ
ュバントと乳化混合した後、マウスの腹腔内に接種し
た。さらに１カ月後に初回免疫の１／４量を追加免疫
し、さらにその１０日後に追加免疫と同量を最終免疫し
た。

【０１１９】実施例７ モノクローナル抗体の作製 細胞融合は、実施例６の最終免疫後３日目のマウスの脾
細胞を用いて行った。ステンレスメッシュで大きな固形
物を除去しながら、ＤＭＥＭ中に取り出した脾細胞をＤ
ＭＥＭにて３回洗浄した後、マウスのミエローマ細胞Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞数の比で５：１（脾
細胞：ミエローマ細胞）になるように混合し、遠心
（１,２００ｒｐｍ、５分間）して細胞残渣を集めた。
この細胞残渣に予め３７℃に加温しておいた５０％ポリ
エチレングリコール（分子量１,５００）１ｍｌを加
え、細胞を融合した。次いで、ＤＭＥＭ １０ｍｌを徐
々に添加し、ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」という）
１ｍｌを更に添加することにより、融合を停止した。Ｄ
ＭＥＭにて１回洗浄後、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥ
Ｍにヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を添加し
たＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウェルのポリスチレンプレ
ートに２×１０⁵細胞／ウェルで分注し、３７℃、５％
二酸化炭素存在下で１０日−１４日間培養した。培養
後、ウェル中の抗体活性の有無をそれぞれスクリーニン
グした。

【０１２０】抗体活性は、実施例５で調製したホキシム
誘導体−ＢＳＡ結合体を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定し
た。まずＰＢＳ（−）に溶解したホキシム誘導体−ＢＳ
Ａ結合体（４μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルのマイクロタ
イタープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で
１晩静置することにより、固相化した。次に３００μｌ
／ウェルでブロッキング緩衝液［１％ＢＳＡと６０ｍＭ
ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０）］に置換え、室温で１時間ブロッキングした。この
ウェルを洗浄液（６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸
緩衝液）で洗浄した後、ハイブリドーマの培養上清を１
００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応した。洗浄
液で３回洗浄した後、第二抗体希釈液 ［０.３％ ＢＳ
Ａと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．０）］で１０００倍希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１００μ
ｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応した。洗浄液で
３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質溶液 ［３，
３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（１００μｇ／
ｍｌ）、０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）］ で１０分間発
色し、１Ｎ硫酸で反応停止後４５０ｎｍの吸光度を測定
した。

【０１２１】抗体活性を示したウェル中のハイブリドー
マは、限界希釈法によって細胞クローニングし、モノク
ローナル抗体産生細胞とした。これらの結果、ホキシム
誘導体−ＢＳＡ結合体に反応するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを６株（ＰＯＸ１−２、ＰＯＸ
２−４、ＰＯＸ３−６、ＰＯＸ４−２、ＰＯＸ５１−
５、ＰＯＸ５３−３）を分離した。これらの抗体のサブ
クラスは、すべてＩｇＧ１だった。

【０１２２】これらのうち、ホキシム誘導体−１−ＢＳ
Ａ結合体を抗原として得られたＰＯＸ５３−３を平成９
年３月２１日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６１４６で
工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５ 茨城県
つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１２３】実施例８ 間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にお
けるＰＯＸ５３−３抗体のホキシムとの反応性 実施例７で得られた６株のハイブリドーマが産生するモ
ノクローナル抗体（以後モノクローナル抗体は、これら
を産生するハイブリドーマと同一名称を用いる）のホキ
シムとの反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって検
討した。

【０１２４】まず実施例７に示したＥＬＩＳＡ法と同様
に固相化し、ブロッキングしたマイクロタイタープレー
トへ、希釈液 ［１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍ
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］で適当な濃度に希釈し
たホキシム溶液を５０μｌ／ウェルで加え、その後、直
ちに同じ希釈液で適当な濃度に希釈した抗体溶液を５０
μｌ／ウェルで加えて混合し、室温で１時間反応した。
３回洗浄した後、実施例７に示したＥＬＩＳＡ法と同様
の方法で第二抗体と反応させ、発色後４５０ｎｍの吸光
度を測定した。

【０１２５】その結果、これら６種類のモノクローナル
抗体は、いずれもホキシムと反応した。そこでこれらの
モノクローナル抗体のうち、ＰＯＸ５３−３について得
られた各濃度における吸光度から以下の式：

【化２１】 を用いて阻害率を計算した。図１に示したように、ＰＯ
Ｘ５３−３を用いて約１０−１００ｎｇ／ｍｌの範囲で
ホキシムを測定することができた。

【０１２６】実施例９ モノクローナル抗体の精製 ＰＯＸ５３−３について抗体精製を行った。まず、ハイ
ブリドーマを１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用
いて培養し、その培養上清に５０％飽和となるように硫
安を加え、４℃で１時間撹拌した。生じた沈殿物にＰＢ
Ｓ（一）を加えて可溶化した後、ＰＢＳ（−）で透析
し、プロテインＧ（ファルマシア社製）カラムクロマト
グラフィーによって精製した。純度はＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で、少なくとも９０％以上であっ
た。

【０１２７】実施例１０ ホキシム誘導体とＨＲＰとの
結合体の作製 実施例５と同様の活性化エステル法により、実施例１お
よび３で作製したホキシム誘導体とＨＲＰとの結合体を
作製した。

【０１２８】まず、２種類のホキシム誘導体−１および
−３の１．２５μｍｏｌを各々ＤＭＳＯ ５０μｌに溶
解した。これらの溶液へＤＭＳＯに溶解したＮーヒドロ
キシこはく酸イミド（５．５μｍｏｌ）３μｌ、および
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）カル
ボジイミド塩酸塩（３．５μｍｏｌ）７μｌを加え、室
温にて１時間反応させた。これらの反応液に１Ｍ 炭酸
水素ナトリウム４０μｌを加え、更にＨＲＰ溶液（２０
ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを加えて混合し、室温にて３時
間反応した。得られた反応液を、ゲル濾過カラム（セフ
ァデックスＧ−２５）に通してＨＲＰ画分を得て、ＨＲ
Ｐ結合ハプテンとした。

【０１２９】実施例１１ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で
のモノクローナル抗体ＰＯＸ５３−３とホキシムの反応
性 次に実施例９で精製したモノクローナル抗体ＰＯＸ５３
−３と実施例１０で調製した２種類のＨＲＰ結合ハプテ
ンを用いて、ホキシムとの反応性を直接競合阻害ＥＬＩ
ＳＡ法で比較した。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法は、以下
の手順で実施した。

【０１３０】まず実施例９で精製したモノクローナル抗
体ＰＯＸ５３−３を４μｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭ 炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し、９６ウェ
ルのマイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで
加えた後、４℃で１晩静置することにより固相化した。
つぎに３００μｌ／ウェルでブロッキング緩衝液に置き
換え、室温で１時間ブロッキングした。一方、これとは
別に希釈液で適当な濃度に調整したホキシムと、ＨＲＰ
結合ホキシム誘導体（−１または−３）を混合した。こ
れらの混合液を先にブロッキングしたプレートに１００
μｌ／ウェルで加えた後、室温にて１時間反応した。洗
浄液で５回洗浄した後、実施例７に示したＥＬＩＳＡ法
と同様の方法で発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定し
た。

【０１３１】結果は図２に示したように、本願発明のモ
ノクローナル抗体ＰＯＸ５３−３は、抗原作製用のハプ
テンとして使用したホキシム誘導体−１（チオホスホリ
ル体）とＨＲＰとの結合体を使用した場合には、約８−
８０ｎｇ／ｍｌの濃度、また、ホキシム誘導体−３（ホ
スホリル体）とＨＲＰとの結合体を使用した場合には、
約４−４０ｎｇ／ｍｌの濃度のホキシムと反応した。従
って、ＰＯＸ５３−３は、抗原作製用のハプテンとして
使用した化合物とは異なる、ホキシム誘導体−３と標識
化合物との結合体を使用した場合の方が、高感度でホキ
シムを測定できることが明らかとなった。

【０１３２】実施例１２ モノクローナル抗体ＰＯＸ５
３−３とホキシムとの反応におけるメタノールの影響 実施例７に示した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、
ホキシム誘導体−３を標識ハプテンとして、メタノール
の測定系に与える影響を調べた。その結果、図３に示し
たように、メタノール濃度に依存して吸光度が低下する
ものの、１０％メタノールまではホキシムを測定可能で
あった。

【０１３３】実施例１３ モノクローナル抗体ＰＯＸ５
３−３のホキシム類縁化合物との交差反応性 直接競合阻害ＥしＩＳＡ法で、ＰＯＸ５３−３のホキシ
ム類縁化合物との交差反応性を調べた。競合反応時のメ
タノールの最終濃度は０％で行った。結果を、化合物未
添加時の反応を５０％阻害する化合物の濃度を各々ＩＣ
₅₀値として、表１に示す。

【０１３４】

【表１】

【０１３５】結果から明らかなとおり、ＰＯＸ５３−３
は類縁化合物のパラチオン、クロルフェンビンホス、フ
ェニトロチオンとはほとんど反応せず、ホキシムと特異
的に反応することが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体ＰＯＸ５
３−３の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるホキシムとの
反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体ＰＯＸ５
３−３の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、標識化合
物を変えた場合のホキシムとの反応性を示す。

【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体ＰＯＸ５
３−３の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における、ホキシム
との反応性に与えるメタノールの影響を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 三宅 司郎 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 弘中 孝史 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 山口 優樹 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 別府 佳紀 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 または式（２） 【化２】 ［式（１）および（２）中、Ｘは、ＳまたはＯであり；
   そしてｎは、１−１０の整数である］で表される構造を
   有する化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物又
   は標識物質との結合体。
3. 【請求項３】請求項１に記載の化合物と高分子化合物を
   結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いる
   ことにより、以下の式（３）： 【化３】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（３）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
4. 【請求項４】請求項２に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（３）の化合物と反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
   載の抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】ＰＯＸ５３−３である、請求項４又は５に
   記載の抗体又はそのフラグメント。
7. 【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体又はそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６１４６で寄託
   されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
9. 【請求項９】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体又はそのフラグメントを用いることを特徴とする、
   式（３）で表される化合物の免疫学的測定方法。
10. 【請求項１０】さらに、式（１）または（２）で表され
    る化合物と高分子化合物との結合体を使用することを含
    む、請求項９に記載の免疫学的測定方法。
11. 【請求項１１】さらに、式（１）または（２）で表され
    る化合物と標識物質との結合体を使用することを含む、
    請求項９に記載の免疫学的測定方法。
12. 【請求項１２】式（１）または（２）で表される化合物
    が、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体又は
    そのフラグメントを作製するための用いた化合物とは異
    なるものである、請求項１０または１１に記載の免疫学
    的測定方法。