JP2000270862A

JP2000270862A - プレチラクロールのハプテン化合物、抗体及び測定方法

Info

Publication number: JP2000270862A
Application number: JP11083170A
Authority: JP
Inventors: Shigehisa Ito; 茂壽伊東; Hirokazu Imazawa; 裕和今澤
Original assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Current assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2000-10-03

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、プレチラクロールのハプテン化合
物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のハプテン化合物は、プレチラク
ロール又はその部分にスペーサーアーム及び結合のため
の官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２−クロロ−
２’，６’−ジエチル−Ｎ−（２−プロポキシエチル）
アセトアニリド（以下、本明細書中「プレチラクロー
ル」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフ
ラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】プレチラクロールは、以下の式（３）：

【０００４】

【化４】

【０００５】で表される構造を有する、アセトアニリド
系の非ホルモン型吸収移行性の水稲用初期除草剤であ
る。より詳細には、プレチラクロールは、ノビエ（１．
５葉期まで）など一年生雑草からマツバイ、ホタルイ、
ヘラオモダカ、ミズガヤツリなど多年生雑草まで広範囲
の水田雑草に卓効を示す。雑草の幼芽部及び幼根部より
吸収されタンパク生合成を阻害し生育抑制により除草効
果を発揮するため、雑草の発芽時期に処理された場合に
高い効果を示す。低温条件下で雑草がだらだら発生する
場合でも安定した除草効果がある。土壌粒子への吸着は
強く土壌中の移動性は小さい。土壌中では比較的速やか
に微生物によって分解される。毒性として、特に眼およ
び皮膚に刺激性があることが知られている（農薬ハンド
ブック第３４２頁−第３４６頁及び第６０３頁、１９
９４年版、日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析
法」第５０４頁−第５０５頁、農薬残留分析法研究班
編集中央法規出版）。

【０００６】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。プレチラクロールについては、農薬登録保留基準値
が、例えば米で０．１ｐｐｍ等定められている（「最新
農薬の残留分析法」、同上）。さらに、水質に関して
も、公共用水域等に関する基準値が０．０４ｍｇ／ｌと
定められている（最新農薬の規制・基準値便覧、第３１
２頁、１９９５年版（社）日本植物防疫協会）。よっ
て、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに
含有される、プレチラクロールの量を迅速かつ正確に測
定することが必要である。

【０００７】従来、例えば農作物中のプレチラクロール
は、米から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィ
ー（ＧＣ）により分析されてきた。即ち、例えば、試料
をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶した後、ヘキサン
−アセトニトリル分配し、フロリジルカラムクロマトグ
ラフィーで精製後、ＧＣで測定する方法等が採用されて
いる。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順
と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、
測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点
がある。プレチラクロールの測定は短時間で膨大な数の
試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、
簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が
要求されてきている。

【０００８】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。

【０００９】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄｔｈｅｏｒｙｏｆ
ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒ
ｄａｍＮｅｗＹｏｒｋ，ＯｘｆｏｒｄＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１０】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、プレチラクロールのような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエ
ピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応
答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が
産生される。このように高分子化合物と結合させて初め
て免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言
う。

【００１１】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１２】プレチラクロールについては、その必要性
が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、プレチラク
ロールに反応する新規な抗体若しくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。

【００１４】本発明はその一態様において、プレチラク
ロールに反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。本発明は、また、プレチラクロールに反応性を有す
る新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン
化合物を提供することを目的とする。

【００１５】本発明は、さらに、プレチラクロールハプ
テンと高分子化合物との結合体を提供することを目的と
する。本発明は、さらにまた、前記抗体又はそのフラグ
メントを産生するハイブリドーマを提供することを目的
とする。

【００１６】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記プレチラクロールハプテン
と高分子化合物との結合体を使用することを含む、プレ
チラクロールの免疫学的測定方法を提供することを目的
とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、プレチラクロール又はその部分にスペー
サーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能
基を導入した、プレチラクロールの誘導体をハプテンと
して使用することにより、前記化合物に反応性を有する
抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００１８】本発明の対象となるプレチラクロールは、
以下の式（３）：

【００１９】

【化５】

【００２０】で表される構造を有する化合物である。本
発明の抗体は、例えば、プレチラクロールの部分にスペ
ーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘
導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させた
ものを抗原として用いることによって得ることができ
る。例えば、以下の式（１）：

【００２１】

【化６】

【００２２】［式（１）中、Ｒ¹およびＲ²は、同一であ
っても異なっていてもよい、枝分かれしていてもよい炭
素数１ないし５のアルキル基であり；そしてｎは、１な
いし１０の整数である］又は、以下の式（２）：

【００２３】

【化７】

【００２４】［式（２）中、Ｘ¹およびＸ²は、同一でも
異なっていてもよい、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択さ
れるハロゲン原子であり；そしてｍは、１ないし５の整
数である］で表される構造を有する化合物を、抗体作製
のためのハプテンとして使用する。

【００２５】式（１）中、好ましくはＲ¹およびＲ²がエ
チル基であり、そしてｎが４である。式（２）中、好ま
しくはＸ¹およびＸ²がＢｒであり、そしてｍが２であ
る。

【００２６】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、プレチラクロールに
反応する抗体及びその作製方法、並びに該ハプテン化合
物又は該抗体を用いるプレチラクロールの免疫学的測定
方法に関する。プレチラクロールハプテンの作製式（１）および式（２）で表されるプレチラクロールハ
プテンは、公知の方法に従って製造することができる。
限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用
いることができる。

【００２７】式（１）の化合物の製造方法先ず、以下の式（Ｚ１）：

【００２８】

【化８】

【００２９】［式（Ｚ１）中、Ｐ¹はカルボキシル基の
保護基であり；そしてｎが先に定義した通りである］で
表される化合物に、塩化チオニル等のハロゲン化チオニ
ルを加えて還流を行う。還流は好ましくは、３０分ない
し３時間行う。

【００３０】次いで、濃縮残渣を有機溶媒に溶解して、
塩基の存在下、以下の式（Ｚ２）：

【００３１】

【化９】

【００３２】［式（Ｚ２）中、Ｒ¹およびＲ²は、先に定
義した通りである］で表される化合物と反応させて、以
下の式（Ｚ３）：

【００３３】

【化１０】

【００３４】［式（Ｚ３）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｐ¹およびｎ
は先に定義した通りである］で表される構造を有する化
合物を合成する。Ｐ¹のカルボキシル基の保護基は公知
のものでよく、具体例として、例えば、メチル基、エチ
ル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシ
ベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロ
ロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジ
メチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエチル基等を挙げることができる。

【００３５】式（Ｚ３）の化合物合成のための有機溶媒
としては、例えば、アセトン、アセトニトリル、ヘキサ
ン、ペンタン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、
クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、
ジグリム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチ
ルリン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いる
ことができる。塩基としては、例えば、炭酸水素ナトリ
ウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、
炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、ト
リエチルアミン、Ｎ．Ｎ−ジメチルアニリン、リチウム
ジイソプロピルアミド等を用いることができる。

【００３６】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１２０℃で、１０分から１０時間、好
ましくは、３０分から２時間行う。次に、式（Ｚ３）の
化合物に、以下の式（Ｚ４）：

【００３７】

【化１１】

【００３８】［式（Ｚ４）中、Ｘ³はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又
はＩから選択されるハロゲン原子である］で表される構
造を有する化合物を、有機溶媒中、水素化ナトリウム、
ナトリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラ
ート等の縮合剤の存在下で反応させ、以下の式（Ｚ
５）：

【００３９】

【化１２】

【００４０】［式（Ｚ５）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｐ¹およびｎ
は、先に定義した通りである］で表される構造を有する
化合物を合成する。有機溶媒としては、Ｎ．Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロ
ロホルム、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニ
トリル、ジメチルスルホキシド等を用いることができ
る。

【００４１】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１５０℃で、１０分から１５時間、好ま
しくは３０分から５時間行う。さらに、式（Ｚ５）の化
合物からＰ¹で表されるカルボキシル基の保護基を除去
することにより、式（１）の化合物を得ることができ
る。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ加水分
解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができる。

【００４２】すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｚ５）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、０℃から溶
媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは３０分から２時間撹拌反応させること
により式（１）の化合物を得ることができる。

【００４３】また、酸加水分解の場合は、式（Ｚ５）の
化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロ
メタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテ
ル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶
媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させること
により式（１）の化合物を得ることができる。

【００４４】更に、Ｐ¹がベンジル基の場合、除去は水
素による加水素分解によっても行うことができる。更に
また、Ｐ¹がシリル原子を含む基の場合、脱保護はテト
ラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウム
フルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっ
ても行うことができる。

【００４５】式（２）の化合物の製造方法先ず、以下の式（Ｚ６）：

【００４６】

【化１３】

【００４７】で表されるグリコール酸の水酸基に保護基
を導入し、以下の式（Ｚ７）：

【００４８】

【化１４】

【００４９】［式（Ｚ７）中、Ｐ²は水酸基の保護基で
ある］で表される構造を有する化合物を得る。Ｐ²で表
される水酸基の保護基は、公知の保護基でよく、例え
ば、アセチル基、ホルミル基、エトキシカルボニル基、
ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジ
ル基、テトラヒドロピラン−２−イル基等を挙げること
ができる。水酸基の保護基の導入は、既知の方法を用い
て行うことができる。例えば、アセチル基を導入する場
合、反応は、還流下、０℃から１５０℃、好ましくは３
０℃から１００℃で、１０分から１０時間、好ましくは
３０分から３時間行う。

【００５０】次いで、式（Ｚ７）の化合物に、塩化チオ
ニル等のハロゲン化チオニルを加えて還流を行い、以下
の式（Ｚ８）：

【００５１】

【化１５】

【００５２】［式（Ｚ８）中、Ｘ⁴は、Ｃｌ又はＢｒか
ら選択されるハロゲン原子であり、そしてＰ²は先に定
義した通りである］で表される構造を有する化合物を得
る。

【００５３】還流は、好ましくは、１時間から３時間行
う。次いで、式（Ｚ８）の化合物の濃縮残渣を有機溶媒
に溶解し、塩基の存在下、以下の式（Ｚ９）：

【００５４】

【化１６】

【００５５】［式（Ｚ９）中、Ｘ¹およびＸ²は先に定義
した通りである］で表される構造を有する化合物と反応
させて、以下の式（Ｚ１０）：

【００５６】

【化１７】

【００５７】［式（Ｚ１０）中、Ｘ¹、Ｘ²およびＰ²は
先に定義した通りである］で表される構造を有する化合
物を得る。式（Ｚ１０）の化合物の合成のための有機溶
媒としては、例えば、アセトン、アセトニトリル、ヘキ
サン、ペンタン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタ
ン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチ
ル、ジグリム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサ
メチルリン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用
いることができる。塩基としては、例えば、炭酸水素ナ
トリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウ
ム、炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、
トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、リチウ
ムジイソプロピルアミド等を用いることができる。

【００５８】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１２０℃で、１０分から１０時間、好ま
しくは３０分から２時間行う。次いで、式（Ｚ１０）の
化合物に、以下の式（Ｚ１１）：

【００５９】

【化１８】

【００６０】［式（Ｚ１１）中、Ｘ⁵はＣｌ、Ｂｒ又は
Ｉから選択されるハロゲン原子である］で表される構造
を有する化合物を、有機溶媒中、水素化ナトリウム、ナ
トリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラー
ト等の縮合剤の存在下で反応させ、以下の式（Ｚ１
２）：

【００６１】

【化１９】

【００６２】［式（Ｚ１２）中、Ｘ¹、Ｘ²およびＰ
²は、先に定義した通りである］で表される構造を有す
る化合物を合成する。有機溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ベンゼン、トルエン、キシレン、ク
ロロホルム、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセト
ニトリル、ジメチルスルホキシド等を用いることができ
る。

【００６３】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１５０℃で、１０分から１５時間、好ま
しくは３０分から５時間行う。次に、式（Ｚ１２）の化
合物からＰ²で表される水酸基の保護基を除去すること
により、以下の式（Ｚ１３）：

【００６４】

【化２０】

【００６５】［式（Ｚ１３）中、Ｘ¹およびＸ²は、先に
定義した通りである］で表される構造を有する化合物を
得る。水酸基の保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸
加水分解等の公知の方法で行うことができる。

【００６６】すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｚ１２）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノ
ール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有
機溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナト
リウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリ
ウム又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、０℃から
溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分か
ら１０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させ
ることにより式（Ｚ１３）の化合物を得ることができ
る。

【００６７】また、酸加水分解の場合は、式（Ｚ１２）
の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロ
ロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテ
ル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶
媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５分か
ら１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させ
ることにより式（Ｚ１３）の化合物を得ることができ
る。

【００６８】更に、Ｐ²がベンジル基の場合、除去は水
素による加水素分解によっても行うことができる。次
に、式（Ｚ１３）の化合物に塩化チオニル等のハロゲン
化チオニルを加えて還流を行い、以下の式（Ｚ１４）：

【００６９】

【化２１】

【００７０】［式（Ｚ１４）中、Ｘ⁶は、Ｃｌ又はＢｒ
から選択されるハロゲン原子であり、そしてＸ¹および
Ｘ²は、先に定義した通りである］で表される構造を有
する化合物を得る。

【００７１】還流は、好ましくは３０分から２時間行
う。次に、式（Ｚ１４）の化合物に、有機溶媒中、塩基
の存在下、以下の式（Ｚ１５）：

【００７２】

【化２２】

【００７３】［式（Ｚ１５）中、Ｐ³は、水素原子又は
カルボキシル基の保護基であり；そしてｍは、先に定義
した通りである］で表される構造を有する化合物を反応
させて、以下の式（Ｚ１６）：

【００７４】

【化２３】

【００７５】［式（Ｚ１６）中、Ｘ¹、Ｘ²、Ｐ³および
ｍは、先に定義した通りである］で表される構造を有す
る化合物を合成する。反応は、還流下、０℃から溶媒の
沸点の温度、好ましくは１０℃から１００℃で、５分か
ら１０時間、好ましくは３０分から２時間行う。

【００７６】式（Ｚ１６）の化合物の合成のための溶媒
としては、例えば、メタノール、エタノール、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホル
ム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセ
トニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド及び水等を用いることができる。塩基
としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナト
リウムエチラート等が挙げられる。

【００７７】さらに、式（Ｚ１６）の化合物でＰ³がカ
ルボキシル基の保護基の場合、Ｐ³を除去することによ
り、式（２）の化合物を得ることができる。カルボキシ
ル基の保護基の除去は、先に式（１）の化合物の合成に
関して記載したように、アルカリ加水分解、酸加水分解
等の公知の方法で行うことができる。

【００７８】上述したような製造方法によって得られた
式（１）又は式（２）の化合物を、必要に応じシリカゲ
ルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行うことによ
り、さらに高純度の精製品とすることができる。

【００７９】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。プレチラクロールハプテンと高分子化合物との結合体の
作製上述のように合成されたプレチラクロールハプテンを適
当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは
固相化用抗原として使用する。

【００８０】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００８１】プレチラクロールハプテンと高分子化合物
との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡ
ＲＵｅｔａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈ
ｅｍ．４２３０１−３０９（１９９４））、又は混合
酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒｅｔａ
ｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４１０９０‐１
０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うこと
ができる。

【００８２】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。

【００８３】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００８４】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、反応時間は５分から２４時間、好ましく
は１時間から１６時間である。反応物を、透析、脱塩カ
ラム等によって精製して、プレチラクロールハプテンと
高分子化合物との結合体を得ることができる。

【００８５】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、ト
リエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホ
リン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、
ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等
の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２
０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃におい
て行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５
分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化
合物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好
ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５
分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混
合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使
用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテ
ル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシ
レン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等
のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非
プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法に
おいて使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばク
ロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチ
ル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げ
られる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステル
と高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択さ
れ得る。

【００８６】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をプレチラクロールハプテンに結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。ポリクローナル抗体の作製プレチラクロールハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロー
ナル抗体を作製することができる。例えば、プレチラク
ロールハプテン／ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝
液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完
全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として
動物に免疫することによって得ることができる。免疫さ
れる動物としては当該分野で常用されるものをいずれも
使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等を挙げることができる。

【００８７】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００８８】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、プレチラクロールと反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。本発明
においてプレチラクロールハプテンと高分子化合物との
結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において少なくとも約１００
ｎｇ／ｍｌの濃度でプレチラクロールと反応できる（実
施例５、図１）。モノクローナル抗体の作製プレチラクロールハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗
体を作製することができる。

【００８９】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。（ａ）免疫用抗原として使用するプレチラクロールハプ
テンと高分子化合物との結合体の作製（ｂ）動物への免疫（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製（ｄ）ミエローマ細胞の調製（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマテクニック
ス（ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールドスプリングハーバーラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。

【００９０】以下、本発明のプレチラクロールに対する
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して
記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができ
る。

【００９１】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００９２】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。

【００９３】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００９４】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００９５】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００９６】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、プレチラクロールに対する抗体活性
を測定する。

【００９７】さらに、測定によりプレチラクロールに反
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法とし
ては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマ
が含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天
培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレ
ーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソータ
ーによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。

【００９８】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗プレチラクロール
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００９９】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【０１００】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗プレチラクロールモノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗プレチラクロールモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場
合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせ
ることにより実施できる。

【０１０１】以上のようにして得られた抗プレチラクロ
ールモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ
法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等
を決定することができる。抗体によるプレチラクロールの測定本発明で使用する抗体によるプレチラクロールの測定法
としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９
８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【０１０２】プレチラクロールの測定は、各種ＥＬＩＳ
Ａ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以
下のような手順により行うことができる。（ａ）まず、固相化用抗原であるプレチラクロールハプ
テンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。

【０１０３】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッ
キングする。（ｃ）これに各種濃度のプレチラクロールを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びプレチラク
ロールに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体
及び、プレチラクロール−抗体複合体を生成させる。

【０１０４】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のプレ
チラクロールの量を決定することができる。（ａ）工程
において、固相化用抗原を固相化する担体としては、特
別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるもの
をいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレ
ン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げら
れる。

【０１０５】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【０１０６】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したプレチラクロールハプテンと高分子化合
物との結合体自体のみならず、式（１）又は（２）で表
される他のハプテンと高分子化合物との結合体を固相化
抗原として使用することも可能である。例えば、式
（１）においてＲ¹、Ｒ²又はｎが抗体作製用と相違する
化合物を、あるいは、式（２）においてＸ¹、Ｘ²又はｍ
が抗体作製用と相違する化合物を、固相化抗原として使
用することもできる。さらに、式（１）および（２）に
含まれない他のプレチラクロール類似化合物を固相化抗
原として使用することも可能である。

【０１０７】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（プレ
チラクロールハプテンと高分子化合物との結合体）を固
相化した担体において、プレチラクロールハプテン部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２
５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを
使用することもできる。具体的には、限定されるわけで
はないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング
剤を含む緩衝液（例えば、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶
液）を適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションし
た後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液と
しては特に制限はないが、例えば、１５０ｍＭＮａＣ
ｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液を用いることがで
きる。

【０１０８】次いで（ｃ）工程において、プレチラクロ
ールを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原及びプレチラクロールと反応させることによ
り、固相化抗原−抗体複合体及びプレチラクロール−抗
体複合体が生成する。

【０１０９】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のプレチラクロールに対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。

【０１１０】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは２５℃から３７℃で約１時間行えばよい。反
応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合し
なかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例え
ば、１５０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸
緩衝液を用いることができる。

【０１１１】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に約５００倍から１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用い
てもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【０１１２】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からプレチラクロー
ルの量を算出することができる。

【０１１３】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。

【０１１４】プレチラクロールを添加しない反応溶液の
吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のプレチラクロールを添加した反応液の阻害率により
予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のプレチラ
クロールの濃度を算出できる。

【０１１５】あるいはプレチラクロールの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固
相化する。

【０１１６】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロ
ッキングする。（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のプレチラクロール
を含む試料に、プレチラクロールハプテンと酵素を結合
させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。

【０１１７】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のプレチラクロールの量を決定する。

【０１１８】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【０１１９】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のプレチラク
ロール並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無
関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それ
を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前
述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。

【０１２０】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、プレチラクロールハプテンを酵素に結合す
る方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っても
よい。例えば、前述した活性化エステル法を採用するこ
とができる。調製した酵素結合ハプテンは、プレチラク
ロールを含む試料と混合する。

【０１２１】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したプレチラク
ロールハプテン自体のみならず、式（１）又は（２）で
表される他のハプテンと高分子化合物との結合体を標識
競合用抗原として使用することも可能である。例えば、
式（１）においてＲ¹、Ｒ²又はｎが抗体作製用と相違す
る化合物を、あるいは、式（２）においてＸ¹、Ｘ²又は
ｍが抗体作製用と相違する化合物を、標識競合用抗原と
して使用することもできる。さらに、式（１）および
（２）に含まれない他のプレチラクロール類似化合物も
標識競合用抗原として使用可能である。

【０１２２】（ｄ）工程においてプレチラクロールを含
む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、プレチラクロールと酵素結合ハプテンとの競合阻害
反応により、これらと固相化担体との複合体が生成す
る。プレチラクロールを含む試料は適当な緩衝液で希釈
して使用する。限定されるわけではないが、反応は例え
ば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担
体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプ
テンを除去する。洗浄液は、例えば１５０ｍＭＮａＣｌ
を添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液を使用することがで
きる。

【０１２３】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からプレチラクロールの量を算出することが
できる。

【０１２４】本発明のモノクローナル抗体ＰＲＣ２１−
２１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約２０ｎｇ
／ｍｌから６２，５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００
ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でプ
レチラクロールと反応する（実施例７、図２）。

【０１２５】さらに、前述したように直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識競
合用抗原として使用できる。例えば、本発明のモノクロ
ーナル抗体ＰＲＣ２１−２１はプレチラクロールハプテ
ン−１を用いて得られた抗体であるが、標識競合用抗原
としてプレチラクロールハプテン−２を用いた場合、約
２０ｎｇ／ｍｌから２，０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で
プレチラクロールと反応する（実施例８，図３）。この
ように、本発明のモノクローナル抗体は、標識競合用抗
原との組み合わせによって直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
おいて固有の反応性を示す。本発明の抗体の交差反応性上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害法
により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調
べることができる。

【０１２６】例えば、モノクローナル抗体ＰＲＣ２１−
２１は、ブタクロールで９％、アラクロールで０．８９
％、テニルクロールで０．４５％、メトラクロールで
０．７２％以下の交差反応性が認められるものの、プレ
チラクロールに対して高い特異性を有する（実施例９、
表４）。以下、実施例によって本発明を具体的に説明す
るが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのも
のではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に
本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発
明の技術的範囲に含まれる。

【０１２７】

【実施例】実施例１プレチラクロールハプテン−１の
合成

【０１２８】

【化２４】

【０１２９】プレチラクロールハプテン−１として、３
−［Ｎ−（２，６−ジブロモフェニル）−Ｎ−（２−プ
ロポキシエチル）カルバモイルメチルチオ］プロピオン
酸（６）を合成した。２−アセトキシ−２’，６’−ジブロモアセトアニリド
（１）の合成グリコール酸２．３ｇ（３０ｍｍｏｌ）へ塩化アセチル
４．２ｇ（５４ｍｍｏｌ）を２０−３０℃で加え、環流
下に１．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮後、残渣に
塩化チオニル５．２ｇ（４４ｍｍｏｌ）を加えた。環流
下に２時間撹拌後、濃縮し、２−アセトキシアセチルク
ロリドの粗精製物３．０ｇを得た。これをアセトン１０
０ｍｌ中の２，６−ジブロモアニリン５．５ｇ（２２ｍ
ｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム２．２ｇ（２６ｍｍｏ
ｌ）の懸濁液に、室温で加え、環流下に１時間撹拌し
た。反応混合物を濃縮し、残渣に１００ｍｌの酢酸エチ
ルと５０ｍｌの水を加え、分液した。酢酸エチル層を水
洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮し
た。残渣の固体をｎ−ヘキサンで洗浄、乾燥し、４．５
ｇ（収率５８％）の（１）を得た。融点：１６３−１６４℃ ２−アセトキシ−２’，６’−ジブロモ−Ｎ−（２−プ
ロポキシエチル）アセトアニリド（２）の合成Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌ中の２−アセト
キシ−２’，６’−ジブロモアセトアニリド（１）２．
１ｇ（６．０ｍｍｏｌ）の溶液に、６０％水素化ナトリ
ウム０．２６ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を室温下に加え、５
０℃で３０分間撹拌した。この混合物に２−プロポキシ
エチルクロリド０．９５ｇ（７．７ｍｍｏｌ）を加え、
１２０℃で３時間撹拌した。この反応混合物に１２０ｍ
ｌの酢酸エチルと５０ｍｌの水を加え、分液した。酢酸
エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾
過、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、１．６ｇ
（収率６２％）の（２）を得た。２’，６’−ジブロモ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−プ
ロポキシエチル）アセトアニリド（３）の合成エタノール１５ｍｌ中の２−アセトキシ−２’，６’−
ジブロモ−Ｎ−（２−プロポキシエチル）アセトアニリ
ド（２）１．３ｇ（３．０ｍｍｏｌ）の溶液に、水１０
ｍｌ中の水酸化ナトリウム０．６ｇ（１５ｍｍｏｌ）の
溶液を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下にエタノー
ルを留去し、残渣に水３０ｍｌとエーテル３０ｍｌを加
えた。分配後、水層を希塩酸で酸性にし、酢酸エチル６
０ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲル
クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
３：１）で精製し１．０ｇ（収率８３％）の（３）を得
た。２−クロロ−２’，６’−ジブロモ−Ｎ−（２−プロポ
キシエチル）アセトアニリド（４）の合成２’，６’−ジブロモ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−プ
ロポキシエチル）アセトアニリド（３）１．０ｇ（２．
５ｍｍｏｌ）に塩化チオニル０．９ｇ（７．５ｍｍｏ
ｌ）を加えた。環流下に１時間撹拌後、濃縮した。残
渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：
酢酸エチル＝５：１）で精製し０．８ｇ（収率８０％）
の（４）を得た。

【０１３０】上記プレチラクロールハプテン−１の中間
体（４）の¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシ
フトδ）を以下に示す。

【０１３１】

【表１】表１¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ） δ０．８０（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₃），１．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），３．２９（２Ｈ，ｔ，２Ｈ₂），３．６７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．８２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ₂），３．９１（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），７．１４（１Ｈ，ｔ，Ａｒ：Ｈ），７．６７（２Ｈ，ｄ，２Ａｒ：Ｈ）３−［Ｎ−（２，６−ジブロモフェニル）−Ｎ−（２−
プロポキシエチル）カルバモイルメチルチオ］プロピオ
ン酸エチル（５）の合成エタノール１５ｍｌ中の２−クロロ−２’，６’−ジブ
ロモ−Ｎ−（２−プロポキシエチル）アセトアニリド
（４）１．０ｇ（２．４ｍｏｌ）、チオグリコール酸エ
チル０．３２ｇ（２．４ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム
０．３６ｇ（２．６ｍｍｏｌ）の混合物を環流下に１時
間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に５０ｍｌの水
を加え、酢酸エチル６０ｍｌで２回抽出した。酢酸エチ
ル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、
濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、１．０ｇ（収率
８３％）の（５）を得た。３−［Ｎ−（２，６−ジブロモフェニル）−Ｎ−（２−
プロポキシエチル）カルバモイルメチルチオ］プロピオ
ン酸（６）の合成エタノール１０ｍｌ中の３−［Ｎ−（２，６−ジブロモ
フェニル）−Ｎ−（２−プロポキシエチル）カルバモイ
ルメチルチオ］プロピオン酸エチル（５）０．８ｇ
（１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、水５ｍｌ中の水酸化ナト
リウム０．３ｇ（８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、室温で１
時間撹拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣を希
塩酸で酸性にし、次いで酢酸エチル６０ｍｌで２回抽出
した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ
ー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し
０．４０ｇ（収率５３％）の（６）を得た。

【０１３２】上記プレチラクロールハプテン−１（６）
の¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）
を以下に示す。

【０１３３】

【表２】表２¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６，４００ＭＨｚ） δ０．７４（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₃），１．３６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），２．４５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），２．６８（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．０４（２Ｈ，ｓ，２Ｈ₂），３．２０（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．５４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．７４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），７．２９（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），７．８１（２Ｈ，ｍ，２Ａｒ：Ｈ），１２．２７（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ）実施例２プレチラクロールハプテン−２の合成

【０１３４】

【化２５】

【０１３５】プレチラクロールハプテン−２として
２’，６’−ジエチル−Ｎ−（２−プロポキシエチル）
アジピンアニリド酸（９）を合成した。２’，６’−ジエチルアジピンアニリド酸エチル（７）
の合成クロロホルム５ｍｌ中のアジピン酸モノエチルエステル
１．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化チオニル２．
０ｇ（１５ｍｌ）を室温下に加えた。この混合物を環流
下に３時間撹拌し、反応混合物を濃縮した。残渣をアセ
トン３０ｍｌ中の２，６−ジエチルアニリン１．５ｇ
（１０ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム０．９２ｇ（１
１ｍｍｏｌ）の懸濁液に室温下に加え、１時間環流させ
た。反応混合物を濃縮し、残渣に５０ｍｌの水を加え
た。次いで、酢酸エチル６０ｍｌで２回抽出した。酢酸
エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾
過、濃縮した。残渣の固体をｎ−ヘキサンで洗浄、乾燥
し、２．０ｇ（収率６５％）の（７）を得た。融点：１０７−１０９℃２’，６’−ジエチル−Ｎ−（２−プロポキシエチル）
アジピンアニリド酸エチル（８）の合成Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｍｌ中の２’，６’
−ジエチルアジピンアニリド酸エチル（７）１．９ｇ
（６．２ｍｍｏｌ）の溶液に、６０％水素化ナトリウム
０．２７ｇ（６．８ｍｍｏｌ）を室温下に加え、５０℃
で３０分間撹拌した。この混合物に２−プロポキシエチ
ルクロリド０．９１ｇ（７．４ｍｍｏｌ）を加え、１４
０℃で４時間撹拌した。この反応混合物に１２０ｍｌの
酢酸エチルと５０ｍｌの水を加え、分液した。酢酸エチ
ル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、
濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、１．５ｇ（収率
６３％）の（８）を得た。２’，６’−ジエチル−Ｎ−（２−プロポキシエチル）
アジピンアニリド酸（９）の合成メタノール１０ｍｌ中の２’，６’−ジエチル−Ｎ−
（２−プロポキシエチル）アジピンアニリド酸エチル
（８）１．２ｇ（３．０ｍｍｏｌ）の溶液に、水１０ｍ
ｌ中の水酸化ナトリウム０．６ｇ（１５ｍｍｏｌ）の溶
液を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下にメタノール
を留去し、残渣を希塩酸で酸性にし、酢酸エチル６０ｍ
ｌで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロ
マトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：
１）で精製し０．７０ｇ（収率６４％）の（９）を得
た。

【０１３６】上記プレチラクロールハプテン−２（９）
の¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）
を以下に示す。

【０１３７】

【表３】表３¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６，４００ＭＨｚ） δ０．７９（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₃），１．１８（６Ｈ，ｔ，２ＣＨ₃），１．４（６Ｈ，ｍ，３ＣＨ₂），１．７５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），２．０８（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），２．４８（４Ｈ，ｍ，２ＣＨ₂），３．２４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．４４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．６０（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），７．２３（２Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ），７．３３（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），１１．９６（１Ｈ，ｓ，ＣＯＯＨ）実施例３プレチラクロールハプテンと高分子化合物と
の結合体の作製免疫原およびスクリーニング用抗原としてプレチラクロ
ールハプテンとＫＬＨ若しくはＢＳＡとの結合体を活性
化エステル法を用いて作製した。

【０１３８】先ず、実施例１で作製したプレチラクロー
ルハプテン−１の３．６４μｍｏｌをＤＭＳＯ５０μ
ｌに溶解した。次に、１８４ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒドロキ
シこはく酸イミドのＤＭＳＯ溶液１０μｌと５３ｍｇ／
ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩のＤＭＳＯ溶液を２０μｌ添
加した。ＤＭＳＯ５０μｌを加えた後、遮光下、室温
で９０分間静置し活性化させた。

【０１３９】一方、ＫＬＨ及びＢＳＡを各々１０ｍｇ秤
量し、８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μ
ｌに添加溶解した。これを上記の反応液と混合し、遮光
下、室温で９０分間放置することにより結合反応を行っ
た。

【０１４０】最後に反応試薬除去のため、遮光、４℃の
条件下で１晩、２Ｌのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」
と言う）で２回透析を行い、プレチラクロールハプテン
−１とＫＬＨとの結合体（以下、「プレチラクロールハ
プテン−１／ＫＬＨ」と言う）、及びプレチラクロール
ハプテン−１とＢＳＡとの結合体（以下、「プレチラク
ロールハプテン−１／ＢＳＡ」と言う）を各々作製し
た。実施例４免疫感作免疫にはＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社より購入）
を用いた。実施例３で調製した免疫用抗原（プレチラク
ロールハプテン−１／ＫＬＨ）をマウス１匹あたり１０
０μｇ／５０μｌとなるようにＰＢＳで希釈した。さら
に５０μｌのフロイント完全アジュバントを添加混合し
た後、マウスの腹腔内に接種した。その１ヶ月後に、マ
ウス１匹あたり２５μｇ／５０μｌＰＢＳの免疫用抗原
（プレチラクロールハプテン−１／ＫＬＨ）を等量の不
完全アジュバントと混合し、追加免疫した。さらにその
１週間後にマウス尾静脈から採血した血液を３７℃で３
０分インキュベーションした後、４℃で１晩静置した。
５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を採取
し、これを抗血清とした。実施例５抗血清のプレチラクロールに対する反応性実施例３で調製したスクリーニング用抗原（プレチラク
ロールハプテン−１／ＢＳＡ）を用いた間接競合ＥＬＩ
ＳＡ法により、実施例４で調製した抗血清のプレチラク
ロールに対する反応性を調べた。

【０１４１】まず、実施例３で調製したスクリーニング
用抗原（プレチラクロールハプテン−１／ＢＳＡ）を４
μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した。これを９６
ウェルのＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェルと
なるように添加し、４℃で１晩静置することにより固相
化した。次に溶液を廃棄し、１％ＢＳＡを含んだＰＢＳ
溶液を３００μｌ／ウェル添加して４℃で１晩静置する
ことによりブロッキングを行った。

【０１４２】このウェルを洗浄液（１５０ｍＭＮａＣ
ｌを含む８５ｍＭホウ酸緩衝液）で１回洗浄した。次い
で、少量のメタノールに溶解しＰＢＳで任意の濃度にな
るように希釈したプレチラクロール溶液５０μｌと０．
３％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した抗体溶液５０μｌを
混合、添加し、１時間常温で反応を行った。洗浄液で３
回洗浄した後、１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ結合抗
マウスＩｇＧ抗体（キルケガードアンドペリー社製）を
１００μｌ／ウェルで添加した。常温でさらに１時間反
応を行った。３回洗浄した後、１００μｌのペルオキシ
ダーゼ基質溶液（１００μｇ／ｍｌの３，３’，５，
５’−テトラメチルベンチジン並びに０．００６％過酸
化水素を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５））で１０分間発色させた。次いで、１００μｌの１
Ｎ硫酸で反応を停止した。この溶液の４５０ｎｍの吸光
度を分光光度計で測定した。

【０１４３】結果を図１に示す。いずれのマウスも１０
０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のプレチラクロールに対して反
応した。実施例６ハイブリドーマの作製実施例５で抗血清の力価を測定したマウスについて、ポ
リエチレングリコール法を用いて細胞融合を行った。

【０１４４】マウス１匹あたり２５μｇ／１００μｌ
ＰＢＳの免疫用抗原（プレチラクロールハプテン−１／
ＫＬＨ）を実施例４で示したとおりにマウス腹腔内に投
与した。３日後、抗プレチラクロール抗体を産生するマ
ウスの脾臓とマウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３）とを用い山下らの方法（組織細胞化学：
日本組織細胞学会編：学際企画、１９８６年）に従い、
ポリエチレングリコール法により細胞融合操作を行っ
た。これらを９６ウェルマイクロプレートに総細胞数が
２×１０⁷となるように分注し、ＨＡＴ及び１０％ＢＳ
Ａを含んだダルベッコ培地中で選択培養した。培養後、
細胞培養液を用いて実施例５と同様の間接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法で、プレチラクロールに対する反応性を指標に
ハイブリドーマ細胞の選抜操作を行った。

【０１４５】次に選抜された細胞について、限界希釈法
により細胞のクローニングを実施した。３日後に培養液
を半量交換し、ハイブリドーマ細胞がコロニーを形成す
るまで培養を続けた。

【０１４６】以上の操作により、プレチラクロールに反
応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞を数株分離した。そのうちのＰＲＣ２１−２１を
平成１１年３月９日に寄託番号ＦＥＲＭＰ−１７２８
９で工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−０
０４６茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託し
た。実施例７直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるプレチラク
ロールの測定実施例６で得られたハイブリドーマ細胞ＰＲＣ２１−２
１をマウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日経過後
の腹水を採取し、硫安分画法、さらにプロテインＡカラ
ム（アマルシャム社製）を用いて抗体を精製した。この
操作によって抗プレチラクロール抗体ＰＲＣ２１−２１
を得た（以後、モノクローナル抗体はこれを産生するモ
ノクローナル抗体産生細胞と同一の名称を用いる）。

【０１４７】モノクローナル抗体ＰＲＣ２１−２１を用
い、以下のように直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によりプレ
チラクロールを測定した。先ず、直接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法で用いるプレチラクロールハプテン−１とＨＲＰと
の結合体（以下、「プレチラクロールハプテン−１／Ｈ
ＲＰ」と言う）を、実施例３と同様に活性化エステル法
により作製した。

【０１４８】精製したモノクローナル抗体ＰＲＣ２１−
２１を５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した。次
いで、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ添
加し、４℃で１晩静置することにより固相化した。抗体
結合後、１％ＢＳＡを含んだＰＢＳ溶液を、３００μｌ
／ウェル添加することによりブロッキングを行った。こ
こに、任意の濃度に希釈したプレチラクロールと０．２
５μｇ／ｍｌのプレチラクロールハプテン−１／ＨＲＰ
を含む０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液とを各々５０μｌ
ずつ添加した。１時間室温で反応させた。反応後、実施
例５と同様の方法で発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測
定した。

【０１４９】その結果を図２に示す。モノクローナル抗
体ＰＲＣ２１−２１は２０ｎｇ／ｍｌないし６２，５０
０ｎｇ／ｍｌの範囲でプレチラクロールを測定できた。実施例８ヘテロロガスなハプテンを用いた直接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法におけるモノクローナル抗体ＰＲＣ２１
−２１のプレチラクロールに対する反応性モノクローナル抗体ＰＲＣ２１−２１について、直接競
合阻害ＥＬＩＳＡ法に用いるＨＲＰ結合ハプテンを代え
て、プレチラクロールに対する反応性の変化を調べた。
具体的には、ＨＲＰ結合ハプテンとしてプレチラクロー
ルハプテン−１／ＨＲＰの代わりにレチラクロールハプ
テン−２／ＨＲＰを用いた他は実施例７と同様に行っ
た。ただし、固相化抗体量は５μｇ／ｍｌ、プレチラク
ロールハプテン−２／ＨＲＰ添加量は１μｇ／ｍｌとし
た。

【０１５０】その結果を図３に示す。ＨＲＰ結合ハプテ
ンの種類によりモノクローナル抗体のプレチラクロール
に対する反応性が変化した。具体的には、本実施例では
モノクローナル抗体ＰＲＣ２１−２１のプレチラクロー
ルに対する測定範囲は２０ｎｇ／ｍｌないし２，０００
ｎｇ／ｍｌであった。実施例９モノクローナル抗体ＰＲＣ２１−２１の交差
反応性実施例８のヘテロロガスな系の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ
法において、プレチラクロールに類似した構造を持つ４
種の化合物（農薬）について交差反応性を調べた。

【０１５１】その結果を表４に示した。

【０１５２】

【表４】

【０１５３】表４に示すように、モノクローナル抗体Ｐ
ＲＣ２１−２１は、ブタクロールで９％、アラクロール
で０．８９％、テニルクロールで０．４５％、メトラク
ロールで０．７２％以下の交差反応性が認められたもの
の、プレチラクロールに対して高い特異性をもつ抗体で
あることが分かった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のプレチラクロールハプテン−
１を用いて得られた抗血清の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法
によるプレチラクロールとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体ＰＲＣ２
１−２１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるプレチラク
ロールとの反応性を示す。

【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体ＰＲＣ２
１−２１のヘテロロガスな直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
よるプレチラクロールとの反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＧＧ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＦターム(参考） 4B024 AA05 AA07 AA11 BA42 BA53 GA03 GA08 GA09 GA18 GA27 HA03 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 CE04 CE12 DA10 DA11 DA13 4B065 AA91X AB05 AC14 AC15 BA08 BA24 BB01 BC01 BD14 CA25 CA41 CA46 4H006 AA01 AB80 AB99 BJ50 BP10 BS10 BV25 TA04 TB53 TB54 TB55 TB56 4H045 AA11 AA20 AA30 DA76 EA50 FA72 GA06 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式（１）：【化１】［式（１）中、Ｒ¹およびＲ²は、同一であっても異なっていてもよい、
枝分かれしていてもよい炭素数１ないし５のアルキル基
であり；そしてｎは、１ないし１０の整数である］又
は、以下の式（２）：【化２】［式（２）中、Ｘ¹およびＸ²は、同一でも異なっていてもよい、Ｆ、Ｃ
ｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン原子であり；そ
してｍは、１ないし５の整数である］で表される構造を
有する化合物。
【請求項２】式（１）において、Ｒ¹およびＲ²がエチル
基であり、そしてｎが４である、請求項１に記載の化合
物。
【請求項３】式（２）において、ＸがＢｒであり、そし
てｍが２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体。
【請求項５】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作
製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（３）：【化３】で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
造することを特徴とする、式（３）で表される構造を有
する化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの
製造方法。
【請求項６】請求項４に記載の結合体を抗原として用い
ることにより製造された、式（３）の化合物に反応性を
示す抗体又はそのフラグメント。
【請求項７】モノクローナル抗体である、請求項６に記
載の抗体又はフラグメント。
【請求項８】モノクローナル抗体ＰＲＣ２１−２１であ
る、請求項６若しくは７に記載の抗体又はフラグメン
ト。
【請求項９】請求項６ないし８のいずれか１項に記載の
抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】寄託番号ＦＥＲＭＰ−１７２８９で寄
託されている、請求項９に記載のハイブリドーマ。
【請求項１１】請求項６ないし８のいずれか１項に記載
の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
（３）で表される化合物の免疫学的測定方法。
【請求項１２】さらに、請求項１ないし３のいずれか１
項に記載の化合物、又は請求項４に記載の結合体を用い
ることを含む、請求項１１に記載の免疫学的測定方法。