JPH10101615A - フェノキシ酢酸類のハプテン化合物、抗体および測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、フェノキシ酢酸類のハプテン化合
物、抗体および測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明の抗体は、フェノキシ酢酸類自体
または、以下の式Ｉ： 【化１】 ［式中、Ａは枝分かれしていてもよい炭素数１−３のア
ルキレン基であり；ｍは１−１０の整数であり；そして
ｎおよびｐは０−３の整数である］で表されるフェノキ
シ酢酸類誘導体をハプテンとして使用することにより作
製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フェノキシ酢酸誘
導体およびフェノキシ酪酸誘導体（以下、「フェノキシ
酢酸類」という）のハプテン化合物、抗原、抗体および
そのフラグメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体およびそ
のフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】フェノキシ酢酸類は、以下の式：

【化３】 を有するフェニル基の置換されたフェノキシ酢酸の塩お
よびエステル等の誘導体およびそのα位の置換された誘
導体等の一連の化合物、並びに４−フェノキシ酪酸の同
様の誘導体等の一連の化合物である。これらの多くは除
草剤として広く使用されており、２,４ＰＡ剤（２,４−
Ｄ）、ＭＣＰ剤、ＭＣＰＢ剤、ＭＣＰＰ剤、およびこれ
らと近縁のトリクロピル剤、フェノチオール剤、クロメ
プロップ剤、ナプロアニリド剤等がある。これらの除草
剤は、低濃度では植物体内の内生オーキシン（ＩＡＡ）
と同じく、まず細胞膜に作用してその構造変化を引き起
こし、酵素の活性化によりＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質
の生合成が促進され、細胞壁の弛緩−吸水−細胞の伸長
につながる植物成長調整剤として機能する。しかし、高
濃度では代謝調節されず、植物ホルモン作用を撹乱して
枯死に至らしめると考えられている。広葉雑草がイネ科
雑草に比べ害を受けやすいのは、茎葉からの吸収移行性
が大きく、特に、生長点で高濃度になるためといわれ
る。イネも発芽期に感受性が高く、移植イネも気温、薬
量によって、黄化、筒状葉を生ずることがある（農薬ハ
ンドブック １９９４年版 第３１８頁−第３２３頁
日本植物防疫協会）。

【０００４】フェノキシ酢酸類の代表的なものとして、
以下の式：

【化４】 で表される（２,４−ジクロロフェノキシ）酢酸（以
下、「２,４−Ｄ」という）がある。２,４−Ｄを有効成
分として含む２,４ＰＡ剤は、ホルモン型の選択性除草
剤で、広葉雑草を枯らし、イネ科の作物には薬害が少な
いものである。２,４ＰＡ剤を広葉雑草に散布すると、
主に茎葉から吸収され、植物体内を移行し、２,４ＰＡ
酸として分裂組織に働いて分裂組織異常および生理機能
撹乱を起こさせ捻転、株基部の腐敗、根の生育阻害を生
じ枯死させる。土壌中を移行しやすく、土壌中での効力
持続期間は夏期で約２０日といわれる。

【０００５】さらに、以下の式：

【化５】 で表される（２,４,５−トリクロロフェノキシ）酢酸
（以下、「２,４,５−Ｔ」という）は、２,４−Ｄと類
似した作用を有し、潅木類に対して２,４−Ｄより効果
が高いことから、林業用除草剤として開発が進められ
た。２,４,５−Ｔはホルモン型の移行性のある選択除草
剤であり、草木類よりも樹木や潅木類に対して活性が高
く、高温条件下では茎葉処理・土壌処理とも効果が大き
い。ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、アミ
ン塩、アルキルエステルとして製剤され、我が国では主
としてブトキシエチルエステル（商品名ウィードン）が
市販された。我が国では１９６４年９月−１９７５年４
月まで農薬として登録されていたが、現在は使用が禁止
されている。また、本明細書に参考文献として挙げた
「最新農薬の残留分析法 第２１頁−第２３頁 農薬残
留分析法研究班編集 中央法規出版）にも記載されてい
るように、２,４,５−ＴのＡＤＩは０．０３ｍｇ／ｋｇ
である。

【０００６】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。例えば、前出の２,４,５−Ｔについては、米、麦、
雑穀、果実、野菜、いも類、豆類、種実、茶、ホップの
いずれにおいても不検出である必要がある（最新農薬の
残留分析法 前出）。環境や食品に関する安全確保のた
めには、これらに含有されるフェノキシ酢酸類の量を迅
速、かつ正確に測定することが必要である。

【０００７】従来フェノキシ酢酸類は、米、果実、いも
類等の試料から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラ
フィー（ＧＣ）により分析されてきた。例えば、２,４,
５−Ｔの場合、試料をアセトンで抽出して、酢酸エチ
ル、ヘキサンにそれぞれ転溶した後、フロリジルカラム
クロマトグラフィーで溶出し、さらにＧＣで分析する方
法が採用されている（最新農薬の残留分析法 前出）。
これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間
を必要とし、分析に熟練を有すること、並びに、測定装
置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点があ
る。フェノキシ酢酸類の測定は、特に輸入農産物等の残
留農薬の分析においては、短時間で膨大な数の試料の分
析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、
迅速性および経済性をも具備したフェノキシ酢酸類の新
規測定方法が要求されてきている。

【０００８】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原−抗体反応に基づいて抗原の検出を行
う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済
性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法に
おいては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、安定遊離基、ラテックスそしてバクテリ
オファージが適用されてきた。

【０００９】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【００１０】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、フェノキシ酢酸類のような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエ
ピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応
答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が
産生される。このように高分子化合物と結合させて初め
て免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」とい
う。

【００１１】さらに、低分子化合物を高分子化合物に結
合させて抗原とする場合、低分子化合物そのものではな
く、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム
（結合手）を導入したものをハプテンとして使用するこ
とも有効である。しかしその場合に、結合手／官能基の
配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が
適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得
られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなけ
らばならない。

【００１２】フェノキシ酢酸類についてはその必要性が
非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体は得られて
いなかった。また、抗体を作製するためのハプテンとし
て、フェノキシ酢酸類にスペーサーを結合させたフェノ
キシ酢酸類誘導体も本発明前には得られていなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、フェノキシ
酢酸類に特異的に反応する新規な抗体を作製するための
抗原を構成するハプテン化合物となる、フェノキシ酢酸
類誘導体を提供することを目的とする。

【００１４】本発明は、また、フェノキシ酢酸類あるい
は前記フェノキシ酢酸類にスペーサーを結合させたフェ
ノキシ酢酸類誘導体と、高分子化合物との結合体を提供
することを目的とする。当該結合体はフェノキシ酢酸類
に特異的に反応する抗体を作製するための抗原となる。

【００１５】本発明は、さらに、フェノキシ酢酸類に反
応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、およびそ
の作製方法を提供することを目的とする。

【００１６】本発明はその一態様において、２,４,５−
Ｔおよび３,５,６−トリクロロ−２−ピリジルオキシ酢
酸（以下、「トリクロピル」という）に反応性を有する
モノクローナル抗体を提供する。前記抗体は、さらに４
０％以下のメタノール存在下において２,４,５−Ｔを濃
度依存的に認識できるという特徴を有する。

【００１７】本発明は、さらにまた、前記抗体およびそ
のフラグメントを産生するハイブリドーマを提供するこ
とを目的とする。

【００１８】本発明は、さらに、前記抗体を使用するこ
とを含む、フェノキシ酢酸類の免疫学的測定方法を提供
することを目的とする。

【００１９】尚、本明細書において抗体の「フラグメン
ト」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab
断片等を意味する。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、フェノキシ酢酸類自体あるいは、前記フ
ェノキシ酢酸類にスペーサーを結合させたフェノキシ酢
酸類誘導体をハプテンとして使用することにより、フェ
ノキシ酢酸類に特異的な抗体を得ることに成功し、本発
明の完成に至った。すなわち、本発明では、対象となる
フェノキシ酢酸類自体をハプテンとして高分子化合物に
結合させて抗原としてもよいし、フェノキシ酢酸類にス
ペーサーを結合させたフェノキシ酢酸類誘導体をハプテ
ンとしてもよい。

【００２１】本発明の対象となるフェノキシ酢酸類は、
以下の一般式ＩＩ：

【化６】 （式中、Ｂは、メチレン基、エチリデン基およびトリメ
チレン基からなる群から選択され；そしてｎおよびｐは
それぞれ０−３の整数である）で表される構造を有する
化合物である。なお、本明細書中の化学式においてフェ
ニル基は所望によりピリジル基であってもよい。

【００２２】ハプテンとしてフェノキシ酢酸類誘導体を
使用する場合は、前記フェノキシ酢酸類の−ＣＯＯＨ部
分を

【化７】 （式中、ｍは１〜１０の整数、好ましくは３である）に
変化させる。即ち、本発明のフェノキシ酢酸類誘導体
は、以下の一般式Ｉ

【化８】 （式中、Ａは枝分かれしていてもよい炭素数１−３のア
ルキレン基であり；ｎおよびｐは式ＩＩで定義した通り
であり；そしてｍは１〜１０の整数、好ましくは３であ
る）で表される構造を有する化合物である。

【００２３】限定するわけではないが、とくに好ましい
化合物は、式Ｉまたは式ＩＩにおいて、ベンゼン環が無
置換であるいか、あるいは３−クロロ、４−クロロ、
２,４−ジクロロ、２,４,５−トリクロロおよび４−ク
ロロ−２−メチルからなる群から選択される置換基で置
換されており、そしてＡがメチレン基、エチリデン基お
よびトリメチレン基からなる群から選択される化合物で
ある。

【００２４】本発明のフェノキシ酢酸類またはスペーサ
ーを結合させたフェノキシ酢酸類誘導体を、ハプテンと
して適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として
用いることによって、フェノキシ酢酸類に特異的な抗体
を得ることができる。

【００２５】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、フェノキシ酢酸類に
反応する抗体およびその作製方法、ならびに該ハプテン
化合物または該抗体を用いるフェノキシ酢酸類の免疫学
的測定方法に関する。

【００２６】フェノキシ酢酸類誘導体の作製 一般式Iで表されるフェノキシ酢酸類誘導体は、公知の
方法に従って製造することができる。例えば、一般式Ｉ
ＩＩ

【化９】 ［式中、Ｒはカルボキシル基の保護基を表し；そして
Ａ、ｎ、ｐおよびｍは式Ｉで定義した通りである］で表
されるエステル化合物から、Ｒで示されるカルボキシル
基の保護基を除去することにより製造できる。

【００２７】上記式ＩＩＩ中、Ｒで示されるカルボキシ
ル基の保護基は公知のものでよく、その具体例として、
例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベン
ジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリクロロエチル
基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシ
リル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエ
チルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチル
シリルエトキシメチル基等を挙げることができる。

【００２８】Ｒで示されるカルボキシル基の保護基の除
去は、酸加水分解、アルカリ加水分解等の公知の方法で
行うことができる。

【００２９】例えば、該保護基がｔｅｒｔ−ブチル基で
ある場合は、式ＩＩＩのエステル化合物を含む有機溶媒
に酸性触媒を加えて、好ましくは撹拌下で反応させるこ
とにより行われる。有機溶媒としては、例えば、ベンゼ
ン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、１,２−ジ
クロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、又はこれらの
混合溶媒等を使用できる。酸性触媒としては公知のも
の、例えばトリフルオロ酢酸等のカルボン酸、ｐ−トル
エンスルホン酸等のスルホン酸、塩酸、硝酸等の鉱酸な
どが使用できるが、その中でもトリフルオロ酢酸が好ま
しい。反応温度は、通常０−５０℃程度、好ましくは室
温がよく、反応時間は通常０．５−３時間程度とすれば
よい。

【００３０】また、アルカリ加水分解の場合は、式ＩＩ
Ｉのエステル化合物を、好ましくはメタノール、エタノ
ール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有
機溶媒、又はこれらの有機溶媒と水との混合溶媒に水酸
化ナトリウム、水酸化リチウムまたは水酸化カリウムを
加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温か
ら５０℃で、１−２時間撹拌反応させることにより式Ｉ
のカルボン酸化合物を得ることができる。

【００３１】更に、ベンジル基の除去は水素による接触
還元反応によっても行うことができる。

【００３２】また、トリメチルシリル基、tert−ブチル
ジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、
トリエチルシリル基、トリイソプロピル基、トリメチル
シリルエトキシメチル基は、フッ化水素、テトラブチル
アンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリド等の
フッ素イオンを発生させる試薬により特異的に除去でき
る。

【００３３】なお、一般式ＩないしＩＩＩにおいて、ｍ
は１〜１０の整数、好ましくは３である。ここにおいて
ｍは反応物が実質上その整数で表されるという意味であ
る。

【００３４】式ＩＩＩのエステル化合物は、種々の方法
によって合成することができる。例えば、一般式ＩＶ

【化１０】 ［Ｘはハロゲン原子（本明細書中、ハロゲン原子はＦ、
Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する）を表す］で表される化
合物を、一般式Ｖ

【化１１】 ［ｍは一般式Ｉに同じ］で表されるエステル化合物と、
溶媒中、相間移動触媒の存在下で反応させることによ
り、式ＩＩＩのエステル化合物を得る。溶媒としては、
ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロ
ロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケト
ン、アセトニトリル、酢酸エチル、Ｎ,Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド等が使用
できる。好ましい溶媒は、ＤＭＦである。相間移動触媒
としては公知のもの、例えば、クラウンエーテル等が挙
げられる。好ましい相間移動触媒は１８−クラウン−６
である。反応温度はマイナス１０−１００℃、好ましく
は２０−３０℃で、反応時間は１−４８時間、好ましく
は５−２４時間である。

【００３５】以上の製造法によって、化合物は結晶で得
られるので、必要ならばシリカゲルクロマトグラフィー
または再結晶操作を行うことにより、さらに高純度の精
製品とすることができる。

【００３６】以下、本発明の抗原、抗体の作製、および
免疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製
は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研
究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこ
とができる。

【００３７】フェノキシ酢酸類またはその誘導体と高分
子化合物との結合体の作製 上述のように合成されたフェノキシ酢酸類誘導体、また
はフェノキシ酢酸類自体を適当な高分子化合物に結合さ
せてから免疫用抗原として使用する。

【００３８】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミンな
どがある。

【００３９】フェノキシ酢酸類またはその誘導体と高分
子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（A.E.
KARU et al.:J. Agric. Food Chem. 42 301-309 (199
4)）、または混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.
Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)）等の公知の方法に
よって行うことができる。

【００４０】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド活性化エステルを生成する。

【００４１】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサ
ン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ
−ヒドロキシコハク酸イミドのモル比は好ましくは１：
１０−１０：１、より好ましくは、１：１−１：１０、
最も好ましくは１：１である。反応温度は、０−１００
℃、好ましくは５−５０℃、より好ましくは２２−２７
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは３０分−
６時間、より好ましくは１−２時間である。反応温度は
各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００４２】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、
反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、
より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、フェノキシ酢酸類または
その誘導体と高分子化合物との結合体を得ることができ
る。

【００４３】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては例えば、トリエチルアミン、トリ
メチルアミン、ピリジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、
Ｎ−メチルモルホリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等
の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素
カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げら
れる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００℃、好ま
しくは０℃−５０℃において行われ、反応時間は５分−
１０時間、好ましくは５分−２時間である。得られた混
合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２
０℃−１５０℃、好ましくは５℃−１００℃、より好ま
しくは１０℃−１００℃において行われ、反応時間は５
分−１０時間、好ましくは５分−５時間である。混合酸
無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混
合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能
であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジ
クロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエー
テル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエ
タン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエス
テル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロト
ン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において
使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻
酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロ
モ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。
当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子
化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。

【００４４】また、上記と同様の方法により、酵素をフ
ェノキシ酢酸類またはその誘導体に結合させたものを、
免疫学的測定方法において使用することができる。

【００４５】ポリクローナル抗体の作製 フェノキシ酢酸類またはその誘導体と高分子化合物との
結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポ
リクローナル抗体を作製することができる。例えば、フ
ェノキシ酢酸類−ウシ血清アルブミン結合体をリン酸緩
衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、フロイント
完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいは
ミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原と
して動物に免疫することによって行う。免疫される動物
としては当該分野で常用されるものをいずれも使用でき
るが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等
を挙げることができる。

【００４６】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１
回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間
の間隔で複数回行うことができる。

【００４７】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、フェノキシ酢酸類と反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。

【００４８】モノクローナル抗体の作製 フェノキシ酢酸類またはその誘導体と高分子化合物との
結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のモ
ノクローナル抗体を作製することができる。

【００４９】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００５０】（ａ）免疫用抗原として使用するフェノキ
シ酢酸類またはその誘導体と高分子化合物との結合体の
作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのクロ
ーニング （ｇ）場合によってはモノクローナル抗体を大量に作製
するためのハイブリドーマの培養または動物へのハイブ
リドーマの移植 （ｈ）作製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Hybridoma Techniques），コールド スプリング
ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laborat
ory），１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、
日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載
されている。

【００５１】以下、本発明の抗フェノキシ酢酸類のモノ
クローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限さ
れないことは当業者によって明らかであろう。

【００５２】（ａ）−（ｃ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５３】ミエローマ細胞としては、例えば、Ｂａｌ
ｂ／ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８
（Ｘ６３）（Nature，256, 495-497 (1975)）、Ｐ３／
Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.i
n Microbiology and Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ
３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immu
nol., 6, 511-519 (1976)）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４
（Ｓｐ２／Ｏ）（Nature276, 269-270 (1978)）、ＦＯ
（J. Immuno. Meth., 35, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１
１、Ｘ６３.６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あ
るいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.
（Ｙ３）（Nature 277, 131-133, (1979)）等を使用で
きる。

【００５４】上述した株化細胞をダルベッコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ改変ダルベッコ培地
（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に１×１０⁶以上
の細胞数を確保する。

【００５５】抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一
般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液またはこれらの
組み合わせからえることができるが脾細胞が最も一般的
に用いられる。

【００５６】最終免疫後、抗体産生が確認されたマウス
より抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｄ）で得ら
れたミエローマ細胞の融合は公知の方法、例えばミルシ
ュタイン（Milstein）らの方法（Methods in Enzymolog
y, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことができる。現在
最も一般的に行われているのは、融合作業も簡単なポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。Ｐ
ＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら
（上述）に記載されている。あるいは、電気処理（電気
融合）による方法等を適宜採用することもできる（大河
内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８
７）。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよ
く、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３〜１０倍
程度用いればよい。

【００５７】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
産生能および増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
さらに、選択されたハイブリドーマ群を含む培養上清の
一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、フェ
ノキシ酢酸類に対する抗体活性を測定する。

【００５８】さらに、測定によりフェノキシ酢酸類に反
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
クローニングを行う。このクローニング法としては、限
界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれ
るように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に
撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターに
よって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによっ
て１個の細胞を分離する「ソータークローン」法等が挙
げられる。限界希釈法が簡単でありよく用いられる。

【００５９】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗フェノキシ酢酸類
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。

【００６０】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度および３７℃（１００％湿度中の
恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００６１】抗体を作製するための大量培養はフォロー
ファイバー型の培養装置等によって行われる。または、
同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるい
はＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖さ
せ、腹水液より抗体を作製することも可能である。

【００６２】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗フェノキシ酢酸類モノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗フェノキシ酢酸類モノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに精製が必要な場合
には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、オープンカラムクロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）な
どの慣用されている方法を使用して抗体画分を集める操
作を１回、または複数回行うことにより実施できる。

【００６３】以上のようにして得られた抗フェノキシ酢
酸類モノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ
法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等
を決定することができる。

【００６４】抗体によるフェノキシ酢酸類の測定 本発明で使用する抗体によるフェノキシ酢酸類の測定方
法としては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ
法）、ＥＬＩＳＡ法（Engvall,E.,Meth. Ensymol.,70,
419-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、血球凝集反応、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏ
ｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方
法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和
５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点
からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００６５】上述の測定は、例えば間接競合阻害ＥＬＩ
ＳＡ法により、以下のような手順により行うことができ
る。（ａ）まず、抗原であるフェノキシ酢酸類またはそ
の誘導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化す
る。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。
（ｃ）これに各種濃度のフェノキシ酢酸類を含む試料お
よび抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原および遊離フ
ェノキシ酢酸類に競合的に反応させて、固相化抗原−抗
体複合体および遊離フェノキシ酢酸類−抗体複合体を生
成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定す
ることにより、予め作成した検量線から試料中の遊離フ
ェノキシ酢酸類の量を決定することができる。

【００６６】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００６７】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができ
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは
０.０５−１０μｇ／ｍｌが適している。また、担体と
して９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する
場合には、３００μｌ／ウェル以下で５０−１５０μｌ
／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの
条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキ
ュベーションが適している。

【００６８】（ｂ）工程のブロッキングは、フェノキシ
酢酸類またはその誘導体と高分子化合物との結合体を固
相化した担体において、フェノキシ酢酸類または誘導体
部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在
する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。
ブロッキング剤として、例えば、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）やスキムミルク溶液を使用できる。あるい
は、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳
業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング
剤として市販されているものを使用することもできる。
具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を
固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液［例え
ば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍ
Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）］を適量加え、約４℃
で、一晩インキュベーションした後、緩衝液で洗浄する
ことにより行われる。洗浄液としては特に制限はない
が、例えば、６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝
液が適している。

【００６９】次いで（ｃ）工程において、フェノキシ酢
酸類を含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原および遊離フェノキシ酢酸類と反応させるこ
とにより、固相化抗原−抗体複合体および遊離フェノキ
シ酢酸類−抗体複合体が生成する。

【００７０】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のフェノキシ酢酸類に対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。

【００７１】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液が好まし
い。

【００７２】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるの
が適当である。担体に結合した第一抗体に最終吸光度が
４以下で、好ましくは０．５−３.０となるように希釈
した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝
液を用いる。限定されるわけではないが、反応は約２５
℃で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の
反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標
識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は
不要である。

【００７３】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からフェノキシ酢酸類の
量を算出することができる。

【００７４】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば発色基質として過酸
化水素、３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンを使
用する。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加
え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加える
ことにより酵素反応を停止させる。３,３',５,５'−テ
トラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸
光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素とし
て、例えばアルカリホスファターゼを使用する場合に
は、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、
２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍで
の吸光度を測定する方法が適している。

【００７５】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のモノクローナル抗体ＴＣＡ２８−５０は
２,４,５−Ｔの量を０．００１−１０ｎｇ／ｍｌ、好ま
しくは０．０４−１．２５ｎｇ／ｍｌの範囲で測定でき
る。また、ＴＣＡ２８−５およびＴＣＡ３１−４は、
２,４,５−Ｔの量を１ｎｇ／ｍｌ−１０μｇ／ｍｌ、好
ましくは２０−１２５０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる
（実施例５、図１）。

【００７６】あるいは、フェノキシ酢酸類の測定は、例
えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を
用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともで
きる。

【００７７】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。

【００７８】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキン
グする。

【００７９】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のフェ
ノキシ酢酸類を含む試料に、フェノキシ酢酸類またはそ
の誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた
混合物を調製する。

【００８０】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。

【００８１】（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量
線から試料中のフェノキシ酢酸類の量を決定する。

【００８２】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００８３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のフェノキシ
酢酸類および酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関
係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを
防ぐ目的で行う。ブロッキング剤およびその方法は、前
述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用でき
る。

【００８４】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、フェノキシ酢酸類またはその誘導体を酵素
に結合する方法であれば、特に制限なくいかなる方法で
行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採
用することができる。調製した酵素結合ハプテンは、フ
ェノキシ酢酸類を含む試料と混合する。

【００８５】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のフェノキシ酢酸類と酵素
結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化
抗体との複合体が生成する。フェノキシ酢酸類を含む試
料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけ
ではないが、反応は例えば約２５℃でおよそ１時間行
う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素
結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えば６０ｍＭ
ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８.
０）を採用することができる。

【００８６】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からフェノキシ酢酸類の量を算出することが
できる。

【００８７】本発明のモノクローナル抗体の一つ、ＴＣ
Ａ２８−５０は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において測
定系に添加する酵素結合ハプテンの種類により、２,４,
５−Ｔの測定感度に差異が生じる。すなわち、酵素結合
ハプテンとして、例えば２,４,５−Ｔとペルオキシダー
ゼの結合体を用いた場合には、１−５００ｎｇ／ｍｌ，
好ましくは５−２００ｎｇ／ｍｌ、２,４,５−Ｔ誘導体
とペルオキシダーゼの結合体を用いた場合には、１０−
１０００ｎｇ／ｍｌ，好ましくは１２．５−４００ｎｇ
／ｍｌ、メコプロップとペルオキシダーゼの結合体を用
いた場合には、０．５−２０ｎｇ／ｍｌ，好ましくは１
−１０ｎｇ／ｍｌの範囲で２,４,５−Ｔを測定できる
（実施例８、図２）。

【００８８】また、前述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法
においても、直接競合阻害法と同様に担体に固相化させ
る抗原として各種のフェノキシ酢酸類またはその誘導体
を用いることができる。

【００８９】本発明の抗体のメタノール耐性 本発明の一態様であるモノクローナル抗体ＴＣＡ２８−
５０はさらに、記述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
れば、０％−４０％、好ましくは１０％−４０％、直接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれば０−１０％の濃度のメタ
ノール存在下において２,４,５−Ｔを濃度依存的に認識
できる。フェノキシ酢酸類は有機溶媒に易溶性であり、
一般に分析はメタノール等の有機溶媒中で行われること
を考慮すると、本発明のモノクローナル抗体のこのよう
な特性は非常に有効である。

【００９０】本発明の抗体の交差反応性 上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法および直接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体ＴＣ
Ａ２８−５０の交差反応性を調べることができる。ＴＣ
Ａ２８−５０は、２,４,５−Ｔの他にトリクロピルにも
強い反応性を示すが、その他のフェノキシ酢酸類にはほ
とんど交差反応性を示さない。例えば、間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法においては、２,４−Ｄ、２,４−ＤＢ、フロ
キシピル、ＭＣＰに対する交差反応性は２,４,５−Ｔに
対する反応性の約４００分の１以下であり、また直接競
合阻害ＥＬＩＳＡ法においては、２,４−Ｄに対する交
差反応性は２,４,５−Ｔに対する反応性の約６０分の１
以下である（実施例１０、表２）。

【００９１】以下、本発明の説明のために実施例を記載
するが、実施例は本発明の技術的範囲を制限するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。

【００９２】

【実施例】

実施例１ ２,４,５−Ｔ誘導体の合成

【化１２】 （２）の合成 ０.９ｇ（４.０ｍｍｏｌ）の２,４,５−トリクロロフェ
ノキシ酢酸カリウム塩（１）を１０ｍｌのＤＭＦに溶解
し、４−ブロモ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル１.５ｇ（５.１ｍ
ｍｏｌ）と１８−クラウン−６を１.３ｇ（４.９ｍｍｏ
ｌ）加えて室温で一晩撹拌した。反応混合物を水−エー
テルで分配抽出（１００ｍｌ×３回）して、集めたエー
テル溶液を無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し
た。濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサ
ン：酢酸エチル＝４：１）で精製すると、白色結晶とし
て（２）を１.３ｇ（収率８１％）得た。

【００９３】２,４,５−Ｔ誘導体（３）の合成 １.５ｇ（３.８ｍｍｏｌ）のエステル（２）を５０ｍｌ
のジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸５ｍｌを
加えて室温で１.５時間撹拌した。反応溶液をトリフル
オロ酢酸の刺激臭が無くなるまでジクロロメタンで共沸
した。濃縮物を少量の酢酸エチルに溶解し、ヘキサンを
加えると１.０ｇ（収率７８％）の（３）（「２,４,５
−Ｔ誘導体」という）が白色結晶として晶出した。

【００９４】

【表１】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）２.０２ｐｐｍ（ｑ,
２Ｈ）、２.４３ｐｐｍ（ｍ,２Ｈ）、４.２９ｐｐｍ
（ｔ,２Ｈ）、４.６９ｐｐｍ（ｓ,２Ｈ）、６.９６ｐｐ
ｍ（ｓ,１Ｈ）、７．４９ｐｐｍ（ｓ,１Ｈ）

【００９５】実施例２：活性化エステル法による ２,
４,５−Ｔおよび２,４,５−Ｔ誘導体とキャリアータン
パク質との結合 ２,４,５−Ｔおよび実施例１で合成した２,４,５−Ｔ誘
導体をハプテンとして、各々３.５μｍｏｌをジメチル
スルホキシド（以下ＤＭＳＯと略す）５０μｌに溶解し
た。次にこれらの溶液にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
（５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ １０μｌに溶解し添加後、
さらに１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミド塩酸塩（４μｍｏｌ）をＤＭＳ０ ２
０μｌに溶解し添加した。室温にて１.５時間反応させ
た後、この反応溶液に８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８.
０）５００μｌに溶解した牛血清アルブミン（以下ＢＳ
Ａと略す）あるいはスカシガイのヘモシアニン（以下Ｋ
ＬＨと略す）各々１０ｍｇを、さらに添加し、再び室温
にて１.５時間反応させた。反応終了後ダルベッコのリ
ン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ（−）と略す）に対して透析
し、２,４,５−ＴとＫＬＨとの結合体、２,４,５−Ｔと
ＢＳＡとの結合体、あるいは２,４,５−Ｔ誘導体とＫＬ
Ｈとの結合体、２,４,５−Ｔ誘導体とＢＳＡとの結合体
を各々調製した。

【００９６】実施例３ ２,４,５−ＴとＫＬＨとの結合
体、および２,４,５−Ｔ誘導体とＫＬＨとの結合体の免
疫 免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で調
製した２,４,５−ＴとＫＬＨとの結合体、あるいは２,
４,５−Ｔ誘導体とＫＬＨとの結合体各々１００μｇを
ＰＢＳ（−）５０μｌに溶解し、等量のフロイント完全
アジュバントと乳化混合した後、マウスの腹腔内に接種
した。その１カ月後にそれぞれの初回免疫量の１／４量
を追加免疫し、２,４,５−ＴとＫＬＨとの結合体は、追
加免疫の２カ月後に、また２,４,５−Ｔ誘導体とＫＬＨ
との結合体は、３週間後に追加免疫と同量を最終免疫し
た。

【００９７】実施例４ モノクローナル抗体の作製 細胞融合は、実施例３の最終免疫後３日目のマウスの脾
細胞を用いて行った。ステンレスメッシュで大きな固形
物を除去しながら、ＤＭＥＭ中に取り出した脾細胞をＤ
ＭＥＭにて３回洗浄した後、マウスのミエローマ細胞Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞数の比で５：１（脾
細胞：ミエローマ細胞）になるように混合し、遠心
（１,２００ｒｐｍ、５分間）して細胞沈渣を集めた。
この細胞沈渣に予め３７℃に加温しておいた５０％ポリ
エチレングリコール（分子量１,５００）１ｍｌを加
え、細胞を融合した。細胞融合は、ＤＭＥＭ１０ｍｌを
徐々に添加し、牛胎児血清（以下ＦＢＳと略す）１ｍｌ
を更に添加することにより、停止した。融合した細胞
は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭにヒポキサンチン
（１００μＭ）、アミノプテリン（０.４μＭ）、およ
びチミジン（１６μＭ）を添加したＨＡＴ培地に懸濁
後、９６ウェルのポリスチレンプレートに２×１０⁵細
胞／ウェルで分注し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で
１０日間−１４日間培養した。培養後、ウェル中の抗体
活性の有無をそれぞれスクリーニングした。

【００９８】抗体活性は、実施例２で調製した２,４,５
−ＴとＢＳＡとの結合体、あるいは２,４,５−Ｔ誘導体
とＢＳＡとの結合体を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定し
た。各々ＰＢＳ（−）に溶解した免疫用抗原に対応する
ＢＳＡとの結合体およびＢＳＡ（４μｇ／ｍｌ）を、９
６ウェルのマイクロタイタープレートに各々１００μｌ
／ウェルで添加し、４℃で１晩静置することにより、固
相化した。次に３００μｌ／ウェルでブロッキング剤を
含む緩衝液｛１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加し
た８５ｍＭ ホウ酸緩衝液(ｐＨ８.０)｝に置き換え、
室温で１時間ブロッキングした。このウェルを洗浄液
（６０ｍＭ ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液）で洗浄
した後、ハイブリドーマの培養上清を１００μｌ／ウェ
ルで加え、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄し
た後、第二抗体希釈液｛０.３％ ＢＳＡと６０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８.０)｝
で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩ
ｇＧ抗体（カペル社製）を１００μｌ／ウェルで添加
し、室温で１時間反応させた。洗浄液で３回洗浄した
後、ペルオキシダーゼの基質溶液 ｛３,３',５,５'−テ
トラメチルベンジジン（１００μｇ／ｍｌ）、０.００
６％過酸化水素を添加した０.１Ｍ 酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５.５）｝ で１０分間発色し、１Ｎ硫酸で反
応停止後４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【００９９】抗体活性を示したウェル中のハイブリドー
マは、限界希釈法によって細胞クローニングし、モノク
ローナル抗体を産生しているハイブリドーマとして選択
した。

【０１００】これらの結果、表１に示したとおり、２,
４,５−ＴとＢＳＡとの結合体、あるいは２,４,５−Ｔ
誘導体とＢＳＡとの結合体とは反応するが、ＢＳＡとは
反応しないモノクローナル抗体を産生しているハイブリ
ドーマを、各々１株（ＴＣＡ２８−５０）、および２株
（ＴＣＡ２８−５，ＴＣＡ３１−４）分離した。

【０１０１】

【表２】

【０１０２】これらのうちＴＣＡ２８−５０を、平成８
年９月１１日に寄託番号ＦＥＲＭＰ−１５８４８として
工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５ 茨城県
つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１０３】実施例５ 間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るモノクローナル抗体の２,４,５−Ｔに対する反応性の
検討 実施例４で得られた３株のハイブリドーマが産生するモ
ノクローナル抗体（以後モノクローナル抗体は、これを
産生するハイブリドーマと同一名称を用いる）と２,４,
５−Ｔとの反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって
検討した。

【０１０４】まずＴＣＡ２８−５０に対しては、２,４,
５−ＴとＢＳＡとの結合体（０．５μｇ／ｍｌ）を、ま
たＴＣＡ２８−５とＴＣＡ３１−４に対しては、２,４,
５−Ｔ誘導体とＢＳＡとの結合体（２μｇ／ｍｌ）を、
各々実施例４に示したＥＬＩＳＡ法と同様の方法で９６
ウェルのマイクロタイタープレートに固相化した。次に
３００μｌ／ウェルでブロッキング剤を含む緩衝液に置
き換え、室温で１時間ブロッキングした。洗浄した後、
希釈液 ｛１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝で適当な濃度に希釈した
２,４,５−Ｔ溶液を５０μｌ／ウェルで加え、その後、
直ちに同じ希釈液で適当な濃度に希釈した抗体溶液を５
０μｌ／ウェルで加えて混合し、室温で１時間反応し
た。３回洗浄した後、第二抗体希釈液で１０００倍希釈
したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル
社製）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反
応した。３回洗浄した後、実施例４のＥＬＩＳＡ法と同
様に発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１０５】結果は、図１に示すように、ＴＣＡ２８−
５０が約０.０４から１.２５ｎｇ／ｍｌ、ＴＣＡ２８−
５とＴＣＡ３１−４が約２０から１２５０ｎｇ／ｍｌの
測定範囲で２,４,５−Ｔと反応した。従って、これらの
抗体は、すべて２,４,５−Ｔと反応するが、その内ＴＣ
Ａ２８−５０が、２,４,５−Ｔと最も高感度に反応する
ことが明らかとなった。

【０１０６】実施例６ モノクローナル抗体の精製 抗体精製は、２,４,５−Ｔと最も高感度に反応したＴＣ
Ａ２８−５０に対して行った。まず、ハイブリドーマを
１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを用いて培養したその
培養上清に５０％飽和となるように硫安を加え、４℃で
１晩撹拌した。生じた沈殿物に蒸留水を加えて可溶化し
た後、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、Ｄ
ＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーによって精
製した。

【０１０７】実施例７ ペルオキシダーゼ結合ハプテン
の調製 ２,４,５−Ｔ、２,４,５−Ｔ誘導体および類縁の除草剤
メコプロップ、各々１.２５μｍｏｌをＤＭＳＯ １００
μｌに溶解した。この溶液へＤＭＳＯに溶解したＮ−ヒ
ドロキシコハク酸イミド（５．５μｍｏｌ）を３μｌ、
および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミド塩酸塩（３.５μｍｏｌ）を７μｌを
加え、室温にて１時間反応させた。この反応液に１Ｍ
炭酸水素ナトリウム水溶液４０μｌを加え、更にペルオ
キシダーゼ水溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを加え
て混合し、室温にて３時間反応させた。得られた反応液
は、ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−２５）で低分
子化合物を除去し、ペルオキシダーゼ結合ハプテンとし
た。

【０１０８】実施例８ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るモノクローナル抗体の２,４,５−Ｔに対する反応性の
検討 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法は、以下の手順で実施した。
実施例６で精製したＴＣＡ２８−５０を１０μｇ／ｍｌ
の濃度で５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
に溶解し、９６ウェルのマイクロタイタープレートに１
００μｌ／ウェルで加えた後、４℃で１晩静置すること
により固相化した。一方、０.１５％ＢＳＡを添加した
希釈液で適当な濃度に希釈した２,４,５−Ｔ溶液とペル
オキシダーゼ結合ハプテンとを混合した。ブロッキング
後、この溶液を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時
間反応させた。洗浄液で５回洗浄した後、実施例４のＥ
ＬＩＳＡ法と同様に発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測
定した。

【０１０９】結果は、図２に示すように、測定系に添加
するペルオキシダーゼ結合ハプテンの種類により、２,
４,５−Ｔの測定感度に差異が生じた。すなわち、ペル
オキシダーゼ結合ハプテンに２,４,５−Ｔとペルオキシ
ダーゼの結合体を用いた場合は、約５−２００ｎｇ／ｍ
ｌ、２,４,５−Ｔ誘導体とペルオキシダーゼの結合体を
用いた場合は、約１２．５−４００ｎｇ／ｍｌ、メコプ
ロップとペルオキシダーゼの結合体を用いた場合は、約
１−１０ｎｇ／ｍｌの測定範囲で２,４,５−Ｔと反応し
た。

【０１１０】このように、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
おいてもＴＣＡ２８−５０は、２,４,５−Ｔと反応し、
またメコプロップとペルオキシダーゼの結合体と競合さ
せた場合が２,４,５−Ｔと最も高感度に反応した。

【０１１１】実施例９ モノクローナル抗体ＴＣＡ２８
−５０のメタノール耐性 モノクローナル抗体ＴＣＡ２８−５０について、実施例
５に示した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法、および実施例８
に示した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いて、これらの
測定系におけるメタノールの影響を検討した。メタノー
ルは、競合反応時の溶液に、最終濃度が間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法では０から６０％、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ
法では０から２０％となるように添加した。間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法での結果を図３に、直接競合阻害ＥＬＩ
ＳＡ法での結果を図４に示した。結果から間接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法では、メタノール濃度の上昇により、測定
感度の低下が認められるものの、少なくとも４０％メタ
ノールまでは、２,４,５−Ｔが測定できた。一方、直接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法では、吸光度の減少は認められる
ものの１０％メタノールまではほぼ同じ測定感度で２,
４,５−Ｔを測定できた。

【０１１２】実施例１０ モノクローナル抗体ＴＣＡ２
８−５０の２,４,５−Ｔの類縁化合物との交差反応性 実施例５に示した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法および、実
施例８に示した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用い、ＴＣ
Ａ２８−５０の２,４,５−Ｔおよびその類縁化合物との
交差反応性を検討した。結果は、化合物未添加の条件で
の反応を５０％阻害する化合物の濃度を各々ＩＣ₅₀値と
して表２に示した。

【０１１３】

【表３】

【０１１４】表２からわかるように、ＴＣＡ２８−５０
は、２,４,５−Ｔの他にトリクロピルにも強い反応性を
示したが、他のフェノキシ酢酸類には殆ど交差反応性を
示さなかった。例えば、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にお
いては、２,４−Ｄ、２,４−ＤＢ、フロキシピル、ＭＣ
Ｐに対する交差反応性は２,４,５−Ｔに対する反応性の
約４００分の１以下であり、また直接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法においては、２,４−Ｄに対する交差反応性は２,
４,５−Ｔに対する反応性の約６０分の１以下であっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の各モノクローナル抗体の
２,４,５−Ｔに対する測定感度を、間接競合阻害ＥＬＩ
ＳＡ法によって調べた結果を示す。

【図２】 図２は、本発明のモノクローナル抗体ＴＣＡ
２８−５０の２,４,５−Ｔに対する測定感度を直接競合
阻害法によって調べた結果を示す。

【図３】 図３は、本発明のモノクローナル抗体ＴＣＡ
２８−５０を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における
メタノールの影響を示す。

【図４】 図４は、本発明のモノクローナル抗体ＴＣＡ
２８−５０を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における
メタノールの影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 三宅 司郎 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 山口 優樹 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式Ｉ： 【化１】 ［式中、 Ａは枝分かれしていてもよい炭素数１−３のアルキレン
   基であり；ｍは１−１０の整数であり；そしてｎおよび
   ｐは０−３の整数である］で表される構造を有する化合
   物。
2. 【請求項２】式Ｉの化合物と高分子化合物との結合体。
3. 【請求項３】式Ｉの化合物に高分子化合物を結合させる
   ことにより抗原を作製し、当該抗原を用いることによ
   り、以下の式ＩＩ： 【化２】 ［式中、 Ｂはメチレン基、エチリデン基およびトリメチレン基か
   らなる群から選択され；そしてｎおよびｐは式Ｉで定義
   した通りである］で表される構造を有する化合物に反応
   性を示す抗体を製造することを特徴とする、式ＩＩに記
   載の化合物と反応性を示す抗体またはそのフラグメント
   の製造方法。
4. 【請求項４】式Ｉの化合物または式ＩＩの化合物と高分
   子化合物との結合体を抗原として用いることにより製造
   された、式ＩＩに記載の化合物と反応性を示す抗体また
   はそのフラグメント。
5. 【請求項５】式Ｉの化合物または式ＩＩの化合物におい
   て、ベンゼン環が無置換であるか、あるいは３−クロ
   ロ、４−クロロ、２,４−ジクロロ、２,４,５−トリク
   ロロおよび４−クロロ−２−メチルからなる群から選択
   される置換基によって置換されており、そしてＡがメチ
   レン基、エチリデン基およびトリメチレン基からなる群
   から選択される、請求項４に記載の抗体またはそのフラ
   グメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項４また
   は５に記載の抗体またはそのフラグメント。
7. 【請求項７】４０％以下のメタノール中で式ＩＩの化合
   物と反応性を有する、請求項４ないし６のいずれか１項
   に記載の抗体またはそのフラグメント。
8. 【請求項８】２,４,５−トリクロロフェノキシ酢酸およ
   び３,５,６−トリクロロ−２−ピリジルオキシ酢酸に反
   応性を有する、請求項４ないし７のいずれか１項に記載
   の抗体またはそのフラグメント。
9. 【請求項９】ＴＣＡ２８−５０である、請求項４ないし
   ８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメン
   ト。
10. 【請求項１０】請求項４ないし９のいずれか１項に記載
    の抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドー
    マ。
11. 【請求項１１】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５８４８で寄
    託されている、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
12. 【請求項１２】請求項４ないし９のいずれか１項に記載
    の抗体またはそのフラグメントを用いることを特徴とす
    る、式ＩＩで表される化合物の免疫学的測定方法。
13. 【請求項１３】さらに、標識化合物として式Ｉまたは式
    ＩＩから選択される少なくとも１つの化合物を用いる、
    請求項１２に記載の方法。