JP2824049B2

JP2824049B2 - チオカルバマート系化合物のハプテン化合物、抗体および測定方法

Info

Publication number: JP2824049B2
Application number: JP8282103A
Authority: JP
Inventors: 茂壽伊東; 俊一竹脇; 司郎三宅; 優樹山口; 佳紀別府
Original assignee: 株式会社環境免疫技術研究所
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 1998-11-11
Anticipated expiration: 2016-10-24
Also published as: JPH10120647A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、チオカルバマート
系化合物のハプテン化合物、抗原、抗体およびそのフラ
グメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体およびそ
のフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】チオカルバマート系化合物は、以下の式
（２）：

【化３】（式中、Ｘは、無置換であるか、またはハロゲン原子で
あり；Ｒ₁およびＲ₂は、枝分かれしていてもよい炭素数
１−５のアルキル基であり；そしてｎは１−１０の整数
である）を有する、一連の化合物である。

【０００４】チオカルバマート系化合物の代表的なもの
として、以下の式（３）：

【化４】で表されるＳ−４−クロロベンジルジエチルチオカル
バマート（以下、「チオベンカルブ」という）がある。
チオベンカルブは商品名をサターンといい、茎葉兼土壌
処理の除草剤で、イネに対する薬害が少なく、単独の乳
剤、ペンディメタリン・リニュロンとの混合乳剤などが
知られている。また、プロメトリン剤との混合剤などは
畑作にも使用されている。主に幼芽部から吸収され、根
より幼芽部の伸長を強く阻害する。本剤の作用機構は、
オーキシン活性阻害とタンパク質合成阻害と考えられて
いる（農薬ハンドブック１９９４年版日本植物防疫
協会、「最新農薬の残留分析法」農薬残留分析法研究
班編集中央法規出版）。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。例えば、前出のチオベンカルブについては、食品衛
生法に基づき残留基準値が、例えば米、豆類、野菜で
０．２ｐｐｍ、穀類で０．１ｐｐｍ、いも類で０．０５
ｐｐｍと定められている（最新農薬の残留分析法前
出）。環境や食品に関する安全確保のためには、これら
に含有されるチオカルバマート系化合物の量を迅速、か
つ正確に測定することが必要である。

【０００６】従来チオカルバマート系化合物は、穀類、
豆類、いも類、野菜等の試料から抽出し、精製した後、
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてき
た。例えば、チオベンカルブの場合、試料をアセトンで
抽出して、ヘキサンに転溶した後、フロリジルカラムク
ロマトグラフィーで溶出し、さらにＧＣで分析する方法
が採用されている（最新農薬の残留分析法前出）。こ
れらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間を
必要とし、分析に熟練を有すること、並びに、測定装置
や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。
チオカルバマート系化合物の測定は、特に輸入農産物等
の残留農薬の分析においては、短時間で膨大な数の試料
の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便
性、迅速性および経済性をも具備したチオカルバマート
系化合物の新規測定方法が要求されてきている。

【０００７】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックスおよびバクテリオファージが
適用されてきた。

【０００８】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【０００９】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、チオカルバマート系化合物
のような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応
答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性
を有する高分子化合物に結合させることによって初めて
一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下
で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球によ
り抗体が産生される。このように高分子化合物と結合さ
せて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテ
ン」という。

【００１０】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なけらばならない。

【００１１】チオカルバマート系化合物についてはその
必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体は
もとより、抗体を作製するためのハプテンも本発明前に
は得られていなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、チオカルバ
マート系化合物に特異的に反応する新規な抗体を作製す
るための抗原を構成するハプテン化合物となる、チオカ
ルバマート系化合物誘導体を提供することを目的とす
る。

【００１３】本発明は、また、前記チオカルバマート系
誘導体と高分子化合物との結合体を提供することを目的
とする。当該結合体はチオカルバマート系化合物に特異
的に反応する抗体を作製するための抗原となる。

【００１４】本発明は、さらに、チオカルバマート系化
合物に反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、
およびその作製方法を提供することを目的とする。

【００１５】本発明はその一態様において、チオベンカ
ルブに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
前記抗体は、さらに２０％以下のメタノール存在下にお
いてチオベンカルブを濃度依存的に認識できるという特
徴を有する。

【００１６】本発明は、さらにまた、前記抗体およびそ
のフラグメントを産生するハイブリドーマを提供するこ
とを目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体を使用するこ
とを含む、チオカルバマート系化合物の免疫学的測定方
法を提供することを目的とする。

【００１８】尚、本明細書において抗体の「フラグメン
ト」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab
断片等を意味する。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、チオカルバマート系化合物にスペーサー
アーム及びカルボキシル基等の官能基を導入したチオカ
ルバマート系化合物誘導体をハプテンとして使用するこ
とにより、チオカルバマート系化合物に特異的な抗体を
得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００２０】本発明の対象となるチオカルバマート系化
合物は、以下の一般式（２）：

【化５】（式中、Ｘは、無置換であるか、またはハロゲン原子
（本明細書中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ
を意味する）であり；Ｒ₁およびＲ₂は、枝分かれしてい
てもよい炭素数１−５のアルキル基であり；そしてｎは
１−１０の整数である）で表される構造を有する化合物
である。

【００２１】抗体作製のためのハプテンとして使用され
るチオカルバマート系化合物誘導体は、前記チオカルバ
マート系化合物の

【化６】の部分を

【化７】（式中、ｎは１−１０の整数、好ましくは３である）に
変化させる。即ち、本発明のチオカルバマート系化合物
誘導体は、以下の一般式（１）

【化８】（式中、Ｘ、Ｒ₁およびｎは式（２）で定義した通りで
ある）で表される構造を有する化合物である。

【００２２】限定するわけではないが、好ましい化合物
は、式（１）または式（２）において、Ｘが無置換であ
るか、あるいは４−クロロおよび２−クロロからなる群
から選択される置換基で置換されており、そしてＲ₁お
よびＲ₂がメチル基、エチル基、プロピル基、１−メチ
ルプロピル基および１,２−ジメチルプロピル基からな
る群から選択される化合物である。特に好ましい化合物
は、Ｘが４−クロロであり、Ｒ₁およびＲ₂がエチル基で
表される化合物である。

【００２３】本発明のチオカルバマート系化合物にスペ
ーサーアームとカルボキシル基を結合させたチオカルバ
マート系化合物誘導体を、ハプテンとして適当な高分子
化合物と結合させたものを抗原として用いることによっ
て、チオカルバマート系化合物に特異的な抗体を得るこ
とができる。

【００２４】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、チオカルバマート系
化合物に反応する抗体およびその作製方法、ならびに該
ハプテン化合物または該抗体を用いるチオカルバマート
系化合物の免疫学的測定方法に関する。

【００２５】チオカルバマート系化合物誘導体の作製一般式（１）で表されるチオカルバマート系化合物誘導
体は、公知の方法に従って製造することができる。例え
ば以下に記載するＡ，Ｂのような方法がある。

【００２６】Ａ一般式（Ｘ１）

【化９】（式中、Ｒ₁およびｎは式（１）で定義した通りであ
る。）で表されるアミノ酸誘導体またはその塩、硫化カ
ルボニル（ＣＯＳ）ガスおよび水酸化ナトリウム、水酸
化カリウムなどの苛性アルカリ類を、水、アセトン、ア
セトニトリルなどの極性溶媒およびこれらの混合溶媒中
で、−１０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃か
ら室温で、５分−１０時間、好ましくは３０分−３時間
反応させて一般式（Ｘ２）

【化１０】（式中、Ｍはアルカリ金属を表し、Ｒ₁、ｎは式（１）
で定義した通りである。）で表されるカルバミン酸塩を
合成する。

【００２７】更にこのカルバミン酸塩を単離することな
しに一般式（Ｘ３）

【化１１】（式中、Ｙはハロゲン原子を表し、Ｘは式（１）で定義
した通りである。）で表されるハロゲン化ベンジル誘導
体と、−１０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは１０
℃から６０℃で、５分−１０時間、好ましくは３０分−
３時間反応させて一般式（１）で表されるチオカルバマ
ート系化合物誘導体を製造することができる。

【００２８】なお一般式（Ｘ１）で表されるアミノ酸誘
導体は、一般式（Ｘ４）

【化１２】（式中、Ｒ₁、ｎは式（１）で定義した通りである。）
で表されるＮ−アルキル環状アミド類を、溶媒の存在下
または非存在下に塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの強酸
類で加水分解することにより得ることができる。反応温
度は室温から反応系の沸点の温度、好ましくは５０℃か
ら１５０℃で、５分−１０時間、好ましくは３０分−３
時間撹拌反応させる。

【００２９】一般式（Ｘ４）の化合物は、試薬として市
販されているものを入手できる。あるいは、一般式（Ｘ
５）

【化１３】（式中、ｎは式（１）で定義した通りである。）で表さ
れる環状アミド化合物を、一般式（Ｘ６）

【化１４】（式中、Ｒ₁は式（１）で、Ｙは式（Ｘ３）で定義した
通りである。）で表されるハロゲン化アルキル誘導体
と、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、
クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラ
ヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケ
トン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキシド等の不活性溶媒中、水素化
ナトリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラ
ート等の塩基またはＫＦ−アルミナ複合体（Chemistry
Letters，1981，p.1143-1146）の存在下、０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃で、１−４８
時間、好ましくは２−８時間撹拌反応させることによ
り得ることもできる。

【００３０】Ｂ一般式（Ｘ７）

【化１５】（式中、Ｘは式（１）で定義した通りである。）で表さ
れる塩化チオ炭酸エステル誘導体を，一般式（Ｘ１）で
表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、四
塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジ
オキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニト
リル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド等の不活性溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭
酸水素カリウム等の無機塩基、アトリエチルアミン、ピ
リジン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン等の有機塩基の
存在下、または非存在下に、−１０℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは室温から５０℃で、５分−８時間、好
ましくは３０分−３時間撹拌反応させることにより一般
式（１）のチオカルバマート系化合物誘導体を得ること
ができる。

【００３１】なお一般式（Ｘ７）で表される塩化チオ炭
酸エステル誘導体は、相当するベンジルメルカプタン類
とホスゲンを、上述と同様の溶媒中、同様の塩基を使用
し、−３０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくはマイナ
ス１０から５０℃で、５分−１０時間、好ましくは３０
分−３時間撹拌反応させることにより得ることができ
る。

【００３２】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶
操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とする
ことができる。

【００３３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、および
免疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製
は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研
究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこ
とができる。

【００３４】チオカルバマート系化合物誘導体と高分子
化合物との結合体の作製上述のように合成されたチオカルバマート系化合物誘導
体を適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原と
して使用する。

【００３５】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミンな
どがある。

【００３６】チオカルバマート系化合物誘導体と高分子
化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（A.E. K
ARU et al.:J. Agric. Food Chem. 42 301-309 (199
4)）、または混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.
Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)）等の公知の方法に
よって行うことができる。

【００３７】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステルを生成する。

【００３８】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサ
ン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ
−ヒドロキシコハク酸イミドのモル比は好ましくは１：
１０−１０：１、より好ましくは、１：１−１：１０、
最も好ましくは１：１である。反応温度は、０−１００
℃、好ましくは５−５０℃、より好ましくは２２−２７
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは３０分−
６時間、より好ましくは１−２時間である。反応温度は
各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００３９】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、
反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、
より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、チオカルバマート系化合
物誘導体と高分子化合物との結合体を得ることができ
る。

【００４０】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては例えば、トリエチルアミン、トリ
メチルアミン、ピリジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、
Ｎ−メチルモルホリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等
の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素
カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げら
れる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００℃、好ま
しくは０℃−５０℃において行われ、反応時間は５分−
１０時間、好ましくは５分−２時間である。得られた混
合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２
０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃において行
われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは５分−５
時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われ
る。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているい
ずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタ
ン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化
水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化
水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロ
フラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルと
しては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、
クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソ
ブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハ
ロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲
から適宜選択され得る。

【００４１】また、上記と同様の方法により、酵素をチ
オカルバマート系化合物誘導体に結合させたものを、酵
素免疫測定法において使用することができる。

【００４２】ポリクローナル抗体の作製チオカルバマート系化合物誘導体と高分子化合物との結
合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリ
クローナル抗体を作製することができる。例えば、チオ
カルバマート系化合物誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸緩
衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、フロイント
完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいは
ミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原と
して動物に免疫することによって行う。免疫される動物
としては当該分野で常用されるものをいずれも使用でき
るが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等
を挙げることができる。

【００４３】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１
回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間
の間隔で複数回行うことができる。

【００４４】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、チオカルバマート系化合物と反応
するポリクローナル抗体の存在を評価することができ
る。

【００４５】モノクローナル抗体の作製チオカルバマート系化合物誘導体と高分子化合物との結
合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクロー
ナル抗体を作製することができる。

【００４６】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００４７】（ａ）免疫用抗原として使用するチオカル
バマート系化合物誘導体と高分子化合物との結合体の作
製（ｂ）動物への免疫（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製（ｄ）ミエローマ細胞の調製（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング（ｇ）ハイブリドーマの培養または動物へのハイブリド
ーマの移植によるモノクローナル抗体の調製（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマテクニック
ス（Hybridoma Techniques），コールドスプリング
ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laborat
ory），１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、
日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載
されている。

【００４８】以下、上述の本発明のチオカルバマート系
化合物に対するモノクローナル抗体の作製方法を説明す
るが、これに制限されないことは当業者によって明らか
であろう。

【００４９】（ａ）−（ｃ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５０】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液またはこれらの組み合わせから得ることができる
が脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５１】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００５２】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ
改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当
日に１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００５３】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのは、融合作業も
簡単なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法
である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、
山下修二ら（上述）に記載されている。その他の融合方
法としては、電気処理（電気融合）による方法等を適宜
採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学５．
１３１５−１９、１９８７）。また、細胞の使用比率も
公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対し
て脾細胞を３−１０倍程度用いればよい。脾細胞とミエ
ローマ細胞とが融合し、抗体産生能および増殖能を獲得
したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細
胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤ
ＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・
チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行
うことができる。

【００５４】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、チオカルバマート系化合物に対する
抗体活性を測定する。さらに、測定によりチオカルバマ
ート系化合物に反応する抗体を産生することが判明した
ハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞ク
ローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個
のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界
希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マ
イクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す
方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソ
ータークローン」法等が挙げられる。限界希釈法が簡単
でありよく用いられる。

【００５５】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗チオカルバマ
ート系化合物モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
として選択する。

【００５６】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度および３７℃（１００％湿度中の
恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００５７】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。または、同系統のマウス（例えば、上述のＢａ
ｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブ
リドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも
可能である。

【００５８】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗チオカルバマート系化合物モノクローナル抗
体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アン
モニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗
体画分を集め精製することにより抗チオカルバマート系
化合物モノクローナル抗体を得ることができる。さらに
精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、オープン
カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を使用して抗
体画分を集める操作を１回、または複数回行うことによ
り実施できる。

【００５９】以上のようにして得られた抗チオカルバマ
ート系化合物モノクローナル抗体は、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、
抗体価等を決定することができる。

【００６０】抗体によるチオカルバマート系化合物の測
定本発明で使用する抗体によるチオカルバマート系化合物
の測定方法としては、放射性同位元素免疫測定方法（Ｒ
ＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Engvall,E.,Meth. Ensymol.,
70, 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、ス
ポット法、血球凝集反応、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種
々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗
体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５
３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便
性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００６１】チオカルバマート系化合物の測定は各種Ｅ
ＬＩＳＡ法のうち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
より、以下のような手順により行うことができる。
（ａ）まず、抗原であるチオカルバマート系化合物誘導
体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係
な、例えばタンパク質によりブロッキングする。（ｃ）
これに各種濃度のチオカルバマート系化合物を含む試料
および抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原および遊離
チオカルバマート系化合物に競合的に反応させて、固相
化抗原−抗体複合体および遊離チオカルバマート系化合
物−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体
複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線
から試料中の遊離チオカルバマート系化合物の量を決定
することができる。

【００６２】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００６３】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができ
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは
０.０５−１０μｇ／ｍｌが適している。また、担体と
して９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する
場合には、３００μｌ／ウェル以下で５０−１５０μｌ
／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの
条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキ
ュベーションが適している。

【００６４】（ｂ）工程のブロッキングは、チオカルバ
マート系化合物誘導体と高分子化合物との結合体を固相
化した担体において、チオカルバマート系化合物誘導体
部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在
する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。
ブロッキング剤として、例えば、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）やスキムミルク溶液を使用できる。あるい
は、ブロックエース（「ＢｌｏｃｋＡｃｅ」、雪印乳
業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング
剤として市販されているものを使用することもできる。
具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を
固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液［例え
ば、１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍ
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）］を適量加え、約４℃
で、一晩インキュベーションした後、緩衝液で洗浄する
ことにより行われる。洗浄液としては特に制限はない
が、例えば、６０ｍＭＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝
液が適している。

【００６５】次いで（ｃ）工程において、チオカルバマ
ート系化合物を含む試料と抗体を固相化抗原と接触さ
せ、抗体を固相化抗原および遊離チオカルバマート系化
合物と反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体
および遊離チオカルバマート系化合物−抗体複合体が生
成する。

【００６６】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のチオカルバマート系化合物に対する抗体を加
え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に
対する抗体を順次加えて反応させる。

【００６７】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
６０ｍＭＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液が好まし
い。

【００６８】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるの
が適当である。担体に結合した第一抗体に最終吸光度が
４以下で、好ましくは０．５−３.０となるように希釈
した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝
液を用いる。限定されるわけではないが、反応は約２５
℃で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の
反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標
識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は
不要である。

【００６９】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からチオカルバマート系
化合物の量を算出することができる。

【００７０】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば発色基質として過酸
化水素、３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンを使
用する。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加
え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加える
ことにより酵素反応を停止させる。３,３',５,５'−テ
トラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸
光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素として
アルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ
−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２Ｎの
ＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光
度を測定する方法が適している。

【００７１】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のモノクローナル抗体ＴＢＣ５−３はチオベ
ンカルブの量を１−３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２−１
５ｎｇ／ｍｌ、ＴＢＣ７−２は０．２−４０ｎｇ／ｍ
ｌ、好ましくは０．２−８ｎｇ／ｍｌ、ＴＢＣ９−２は
１−６０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２−３０ｎｇ／ｍｌ、
ＴＢＣ１４−７は０．２−３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは
０．５−１５ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例
５、図１）。

【００７２】あるいは、チオカルバマート系化合物の測
定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナ
ル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行う
こともできる。

【００７３】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。

【００７４】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキン
グする。

【００７５】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のチオ
カルバマート系化合物を含む試料に、チオカルバマート
系化合物誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを
加えた混合物を調製する。

【００７６】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。

【００７７】（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量
線から試料中のチオカルバマート系化合物の量を決定す
る。

【００７８】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００７９】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のチオカルバ
マート系化合物および酵素結合ハプテンが抗原抗体反応
とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるの
で、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤およびその
方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のもの
を採用できる。

【００８０】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、チオカルバマート系化合物誘導体を酵素に
結合する方法であれば、特に制限なくいかなる方法で行
ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用
することができる。調製した酵素結合ハプテンは、チオ
カルバマート系化合物を含む試料と混合する。

【００８１】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のチオカルバマート系化合
物と酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これら
と固相化抗体との複合体が生成する。チオカルバマート
系化合物を含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用す
る。限定されるわけではないが、反応は例えば約２５℃
でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄
し、未反応の酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、
例えば６０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩
衝液（ｐＨ８.０）を採用することができる。

【００８２】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からチオカルバマート系化合物の量を算出す
ることができる。

【００８３】本発明のモノクローナル抗体の一つ、ＴＢ
Ｃ７−２は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において４−２
５０ｎｇ／ｍｌ，好ましくは５−２００ｎｇ／ｍｌの範
囲でチオベンカルブを測定できる（実施例８、図２）。

【００８４】本発明の抗体のメタノール耐性本発明の一態様であるモノクローナル抗体ＴＢＣ７−２
はさらに、記述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれば
０−２０％、好ましくは１０−２０％の濃度のメタノー
ル存在下においてチオベンカルブを濃度依存的に認識で
きる（実施例９、図３）。チオカルバマート系化合物は
有機溶媒に易溶性であり、一般に分析はメタノール等の
有機溶媒中で行われることを考慮すると、本発明のモノ
クローナル抗体のこのような特性は非常に有効である。

【００８５】本発明の抗体の交差反応性上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法または間接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交
差反応性を調べることができる。ＴＢＣ７−２は、例え
ば直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、チオベンカルブ
代謝分解物−３および−６がチオベンカルブの約１５％
の交差反応性を示すほかは、他の類縁化合物は１％以下
しか交差反応せず、チオベンカルブと特異性が高い（実
施例１０、表２）。

【００８６】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００８７】

【実施例】実施例１チオベンカルブ誘導体の合成

【化１６】１−エチル−２−ピロリドン（２）の合成フッ化カリウム１４.５ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を水２０
０ｍｌに溶解し、この溶液にアルミナ（活性アルミナ９
０、中性、活性度１）２２ｇを加え、湯温７０℃で水を
減圧下に留去した後、残渣の白色粉末を７５℃で１８時
間真空乾燥した。このようにして得られたＫＦ−アルミ
ナと２−ピロリドン（１）８．５ｇ（１００ｍｍｏｌ）
およびヨウ化エチル２３．４ｇ（１５０ｍｍｏｌ）をア
セトニトリル１５０ｍｌに懸濁し、室温下で８時間撹拌
した後、反応混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣に
アセトン３０ｍｌを加え、さらに濾過し、濾液を濃縮し
た。残渣を減圧蒸留に付し、７．３ｇ（収率６６％）の
１−エチル−２−ピロリドン（２）を得た。

【００８８】沸点：１０２−１０５℃／２３ｍｍＨｇ４−エチルアミノブタン酸（３）の合成１−エチル−２−ピロリドン（２）３．７ｇ（３３ｍｍ
ｏｌ）に濃塩酸４．７ｍｌを加え、２時間撹拌環流させ
た。反応混合物を濃縮し、過剰の濃塩酸を留去して、
４．０ｇ（収率７２％）の４−エチルアミノブタン酸の
塩酸塩（３）を固体として得た。潮解性が高く、融点を
測定できなかった。

【００８９】４−［Ｎ−(４−クロロベンジルチオカル
ボニル)−Ｎ−エチルアミノ］ブタン酸（４）（チオベ
ンカルブ誘導体）の合成４−エチルアミノブタン酸の塩酸塩（３）３．４ｇ（２
０ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム２．４ｇ（６０ｍ
ｍｏｌ）を水２０ｍｌに溶解した。この溶液に氷水冷却
下５−１０℃で、５０％硫酸２０ｍｌに室温下でチオシ
アン酸アンモニウム２．３ｇ（３０ｍｍｏｌ）の飽和水
溶液を徐々に滴下することにより得られたＣＯＳガスを
３０分間かけて吹き込んだ。次にこの溶液に４−クロロ
ベンジルクロリド３．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）の２０ｍｌ
アセトン溶液を室温下に加え、５０℃で１時間撹拌し
た。反応混合物からアセトンを減圧下に留去し、酢酸エ
チルで抽出した。酢酸エチル層を水洗い後、硫酸マグネ
シウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をカラムクロ
マトグラフィ一（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝１：１）
で精製し、２．７ｇ（収率４２％）の４−［Ｎ−(４−
クロロベンジルチオカルボニル)−Ｎ−エチルアミノ］
ブタン酸（４）を無色透明の液体として得た。

【００９０】 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆,ｐｐｍ）１．０８（３Ｈ，ｂｒ）１．７３（２Ｈ，ｂｒ）２．２１（２Ｈ，ｂｒ）３．３２（４Ｈ，ｂｒ）４．０９（２Ｈ，ｓ）７．３５（４Ｈ，ｓ）１２．１２（ＩＨ，ｂｒ）ＩＲ（ｎｅａｔ，ｃｍ^-1）３４５０−２６００、１７００、１６４０実施例２活性化エステル法によるチオベンカルブ誘導
体とキャリアータンパク質との結合実施例１で得られたチオベンカルブ誘導体（３．５μｍ
ｏｌ）をジメチルスルホキシド（以下「ＤＭＳＯ」と略
す）５０μｌに溶解した。次にこの溶液にＮ−ヒドロキ
シコハク酸イミド（５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ１０μｌに
溶解したものを添加した後、さらに１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（４μｍｏｌ）をＤＭＳ０２０μ１に溶解し添加した。
室温にて１．５時間反応させた後、この反応溶液に８５
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μ１に溶解した
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいはスカシガイのへモ
シアニン（ＫＬＨ）各々１０ｍｇを、さらに添加し、再
び室温にて１．５時間反応させた。反応終了後ダルベコ
のリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ（−）」と略す）に対
して透析し、チオベンカルブ誘導体とＫＬＨとの結合
体、チオベンカルブ誘導体とＢＳＡとの結合体を各々調
製した。

【００９１】実施例３チオベンカルブ誘導体とＫＬＨ
との結合体の免疫免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で調
製したチオベンカルブ誘導体とＫＬＨとの結合体１００
μｇをＰＢＳ（−）５０μｌに溶解し、等量のフロイン
ト完全アジユバントと乳化混合した後、マウスの腹腔内
に接種した。その１カ月後に初回免疫量の１／４量を追
加免疫し、さらにその２週間後に追加免疫と同量を最終
免疫した。

【００９２】実施例４モノクローナル抗体の作製実施例３の最終免疫後３日目のマウスの脾細胞を用いて
細胞融合を行った。ステンレスメッシュで大きな固形物
を除去しながら、ＤＭＥＭ中に取り出した脾細胞をＤＭ
ＥＭにて３回洗浄した後、マウスのミエローマ細胞Ｐ３
−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞数の比で５：１（脾細
胞：ミエローマ細胞）になるように混合し、遠心（１，
２００ｒｐｍ、５分間）して細胞沈渣を集めた。この細
胞沈渣に予め３７℃に加温しておいた５０％ポリエチレ
ングリコール（分子量１,５００）１ｍｌを加え、細胞
を融合した。細胞融合は、ＤＭＥＭ１０ｍｌを徐々に添
加し、牛胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と略す）１ｍｌを
更に添加することにより、停止した。融合した細胞は、
１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭにヒポキサンチン（１
００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、およびチ
ミジン（１６μＭ）を添加したＨＡＴ培地に懸濁後、９
６ウェルのポリスチレンプレートに２×１０⁵細胞／ウ
ェルで分注し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で１０日
間−１４日間培養した。培養後、ウェル中の抗体活性の
有無をそれぞれスクリーニングした。

【００９３】抗体活性は、実施例２で調製したチオベン
カルブ誘導体とＢＳＡとの結合体を用いたＥＬＩＳＡ法
にて測定した。ＰＢＳ（−）に溶解したチオベンカルブ
誘導体とＢＳＡとの結合体（１μｇ／ｍｌ）を、９６ウ
ェルのマイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェル
で添加し、４℃で１晩静置することにより、固相化し
た。次に３００μｌ／ウェルでブロッキング剤を含む緩
衝液｛１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを添加した８５
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝に置き換え、室温で
１時間ブロッキングした。このウェルを洗浄液｛６０ｍ
ＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．０）｝で洗浄した後、ハイブリドーマの培養上清を
１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応した。洗
浄液で３回洗浄した後、第二抗体希釈液｛０．３％Ｂ
ＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩
衝液(ｐＨ８.０)｝で１０００倍希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１００μ
１／ウェルで添加し、室温で１時間反応した。洗浄液で
３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質溶液｛３,
３',５,５'−テトラメチルベンジジン（１００μｇ／ｍ
ｌ）、０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）｝で１０分間発色し、
１Ｎ硫酸で反応を停止した後４５０ｎｍの吸光度を測定
した。

【００９４】抗体活性を示したウェル中のハイブリドー
マは、限界希釈法によって細胞クローニングし、モノク
ローナル抗体を産生しているハイブリドーマとして選択
した。

【００９５】これらの結果、表１に示したとおり、チオ
ベンカルブ誘導体とＢＳＡとの結合体と反応するハイブ
リドーマを４株（ＴＢＣ５−３、ＴＢＣ７−２、ＴＢＣ
９−２、ＴＢＣ１４−７）分離した。

【００９６】

【表１】これらのうちＴＢＣ７−２を、平成８年１０月１１日に
寄託番号ＦＥＲＭＰ−１５９０５として工業技術院生
命工学工業技術研究所（〒３０５茨城県つくば市東１
丁目１番３号）に寄託した。

【００９７】実施例５間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
る分離したモノクローナル抗体のチオベンカルブに対す
る反応性実施例４で得られた４株のハイブリドーマが産生するモ
ノクローナル抗体（以後モノクローナル抗体は、これを
産生するハイブリドーマと同一の名称を用いる）とチオ
ベンカルブとの反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
って検討した。

【００９８】まず、実施例４に示したＥＬＩＳＡ法と同
様の方法で、チオベンカルブ誘導体とＢＳＡとの結合体
（１μｇ／ｍｌ）を固相化後、ブロッキングしたマイク
ロタイタープレートへ、希釈液｛１５０ｍＭＮａＣｌ
を添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）｝で適
当な濃度に希釈したチオベンカルブ溶液を５０μｌ／ウ
ェルで加えた。その後直ちに、同じ希釈液で適当な濃度
に希釈した抗体溶液を５０μｌ／ウェルで加えて混合
し、室温で１時間反応させた。３回洗浄した後、実施例
４に示したＥＬＩＳＡ法と同様の方法で第二抗体と反応
させ、発色後４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【００９９】結果は、図１に示すように、ＴＢＣ５−３
が約２から１５ｎｇ／ｍｌ、ＴＢＣ７−２が約０．２か
ら８ｎｇ／ｍｌ、ＴＢＣ９−２が約２から３０ｎｇ／ｍ
ｌ、ＴＢＣ１４−７が約０．５から１５ｎｇ／ｍｌの測
定範囲でチオベンカルブと反応した。従って、これらの
抗体は、すべてチオベンカルブと反応し、その内ＴＢＣ
７−２が最も高感度に反応することが明らかとなった。

【０１００】実施例６モノクローナル抗体の精製抗体精製は、チオベンカルブと最も高感度に反応したＴ
ＢＣ７−２に対して行った。まず、ハイブリドーマをＤ
ＭＥＭに１０％ＦＢＳを添加した培地を用いて培養し、
その培養上清に５０％飽和となるように硫安を加え、４
℃で１晩撹拌した。生じた沈殿物に蒸留水を加えて可溶
化した後、ＰＢＳ（−）で透析し、ＡｖｉｄＡＬゲル
（バイオプローブインターナショナル社製）カラムク
ロマトグラフィーによって精製した。回収率は、実施例
４に記載したＥＬＩＳＡ法で確認した結果、ほぼ１００
％だった。また、純度もＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動の結果から、少なくとも９５％以上であった。

【０１０１】実施例７ペルオキシダーゼ結合ハプテン
の調製まずチオベンカルブ誘導体１．２５μｍｏｌをＤＭＳＯ
１００μ１に溶解した。この溶液へＤＭＳＯに溶解し
たＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（５．５μｍｏｌ）を
３μｌ、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩（３．５μｍｏｌ）を
７μｌを加え、室温にて１時間反応させた。この反応液
に１Ｍ炭酸水素ナトリウム４０μｌを加え、更にペルオ
キシダーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）５００μ１を加えて
混合し、室温にて３時間反応した。得られた反応液は、
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−２５）で低分子化
合物を除去し、ペルオキシダーゼ結合ハプテンとした。

【０１０２】実施例８直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るモノクローナル抗体ＴＢＣ７−２のチオベンカルブに
対する反応性直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法は、以下の手順で実施した。
まず実施例６で精製したＴＢＣ７−２を４μｇ／ｍｌの
濃度で５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に
溶解し、９６ウェルのマイクロタイタープレートに１０
０μｌ／ウェルで加えた後、４℃で１晩静置することに
より固相化した。つぎに３００μｌ／ウェルでブロッキ
ング緩衝液に置き換え、室温で１時間ブロッキングし
た。またこのプレートとは別に、各々６０ｍＭＮａＣ
ｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適
当な濃度に希釈したチオベンカルブとペルオキシダーゼ
結合ハプテンを混合し、先にブロッキングしたプレート
に１００μｌ／ウェルで加えた後、室温にて１時間反応
した。洗浄液で５回洗浄した後、実施例４に示したＥＬ
ＩＳＡ法と同様の方法で発色させ、４５０ｎｍの吸光度
を測定した。

【０１０３】結果は、図２に示すように、約５−２００
ｎｇ／ｍｌの測定範囲でチオベンカルブと反応した。

【０１０４】実施例９モノクローナル抗体ＴＢＣ７−
２のメタノール耐性作物中などに残留するチオベンカルブを測定する場合、
一般に有機溶媒抽出物が被検試料となる。そこでこの試
料を直接測定し得る可能性を検討するため、実施例８に
示した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いて、この測定系
におけるメタノールの影響を検討した。メタノールは、
競合反応時の溶液に、最終濃度が０から２０％となるよ
うに添加した。結果は、図３に示したように、メタノー
ル濃度の増加に依存して吸光度の減少は認められるもの
の、２０％メタノールまではほぼ同じ測定感度でチオベ
ンカルブを測定できた。

【０１０５】実施例１０モノクローナル抗体ＴＢＣ７
−２のチオベンカルブの類縁化合物との交差反応性実施例９に示した条件の内、競合反応時のメタノールの
最終濃度を１５％としてＴＢＣ７−２のチオベンカルブ
の代謝分解物及びその類縁化合物との交差反応性を検討
した。結果は、化合物が未添加の条件での反応を５０％
阻害する化合物の濃度を各々ＩＣ₅₀値として、表２に示
した。

【０１０６】

【表２】表２からわかるように、ＴＢＣ７−２を用いた直接競合
阻害ＥＬＩＳＡ法は、チオベンカルブ代謝分解物−３と
−６がチオベンカルブの約１５％の交差反応性を示した
ほかは、すべて１％以下しか交差反応せず、チオベンカ
ルブと特異性の高いことが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の各モノクローナル抗体のチ
オベンカルブとの反応性を、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法
によって調べた結果を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体ＴＢＣ
７−２のチオベンカルブに対する反応性を、直接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法によって調べた結果を示す。

【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体ＴＢＣ
７−２を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるメタ
ノールの影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者山口優樹東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者別府佳紀東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07C 333/04 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/577 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式（１）【化１】（式中、Ｘは、無置換であるか、またはハロゲン原子であり；Ｒ
₁は、枝分かれしていてもよい炭素数１−５のアルキル
基であり；そしてｎは１−１０の整数である）で表され
る構造を有する化合物。
【請求項２】式（１）において、Ｘが４−クロロであ
り、Ｒ₁がエチル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】請求項１または２に記載の化合物と高分子
化合物との結合体。
【請求項４】請求項１または２に記載の化合物に高分子
化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原
を用いることにより、以下の式（２）【化２】［式中、Ｒ₂は、枝分かれしていてもよい炭素数１−５のアルキ
ル基であり；そしてＸ、Ｒ₁およびｎは式（１）で定義
した通りである］で表される構造を有する化合物に反応
性を示す抗体を製造することを特徴とする、式（２）の
化合物と反応性を示す抗体またはそのフラグメントの製
造方法。
【請求項５】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
ることにより製造された、式（２）の化合物と反応性を
示す抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】式（２）において、Ｘが４−クロロであ
り、Ｒ₁およびＲ₂がエチル基である、請求項５に記載の
抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】モノクローナル抗体である、請求項５また
は６に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】２０％以下のメタノール中で式（２）の化
合物と反応性を有する、請求項５ないし７のいずれか１
項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】ＴＢＣ７−２である、請求項５ないし８の
いずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】請求項５ないし９のいずれか１項に記載
の抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドー
マ。
【請求項１１】寄託番号ＦＥＲＭＰ−１５９０５で寄
託されている、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】請求項５ないし９のいずれか１項に記載
の抗体またはそのフラグメントを用いることを特徴とす
る、式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。