JPH1132762A - ダミノジッドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ダミノジッドのハプテン化合物、
抗体および測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、ダミノジッ
ドまたはその部分にスペーサーアームおよび結合のため
の官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ−ジメチルアミ
ノスクシンアミド酸（以下、本明細書中「ダミノジッ
ド」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフ
ラグメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ダミノジッドは、以下の式（４）：

【化３】 で表される構造を有する化合物である。ダミノジッドは
植物成長調節剤で、植物の成長を抑制する作用があり、
耐寒性、耐早性、耐病性を与えたり、葉色や果色を良く
する作用などもある。ダミノジッド剤処理により生育が
抑制されても花の大きさや数は影響を受けない特徴があ
る。残効は長く、小菊などでは通常２回以上行う摘芯
が、本剤処理により１回ですむという労力節約の効果も
ある。日本では、主に花類の抑制栽培、ぶどうの着粒増
加、果実の着色増進および熟期促進などに使用されてき
た。（「最新農薬の残留分析法」 第１７９頁−第１８
３頁、農薬残留分析法研究班編集 中央法規出版；農薬
ハンドブック 第４６７頁、１９９４年版、日本植物防
疫協会）。

【０００４】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。ダミノジッドについても、食品衛生法に基づき残留
基準値が穀類、豆類、果実、野菜、種実類、茶、ホップ
等で不検出であることが要求される（「最新農薬の残留
分析法」 前出）。環境や食品に関する安全確保のため
には、これらに含有される、ダミノジッドの量を迅速、
かつ正確に測定することが必要である。

【０００５】従来、ダミノジッドは、穀類、豆類、野
菜、果実等から水を用いて抽出した後、酸加水分解によ
り１,１−ジメチルヒドラジンを生成させ、これを水蒸
気蒸留により精製し、発色試薬を添加して分光光度計で
測定する方法（分光光度法）が採用されてきた。近年
は、水蒸気蒸留後、１,１−ジメチルヒドラジンを芳香
族アルデヒドと反応させ、生成するヒドラゾンをガスク
ロマトグラフィー（ＧＣ）等によって測定する方法（誘
導化ＧＣ法）も行われている。これらの方法は、試料の
調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟練
を有すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用
を必要とする等の問題点がある。ダミノジッドの測定
は、特に輸入農産物等の残留農薬の分析においては、短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
た新規測定方法が要求されてきている。

【０００６】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００７】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Tijssen P,“Practi
ce and theory of enzyme immunoassays" in Laborator
y techniques in biochemistry and molecular biolog
y, Elsevier Amsterdam New York, Oxford ISBN 0-7204
-4200-1 (1990) に記載されている。

【０００８】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ダミノジッドのような低分
子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出す
ことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分
子化合物に結合させることによって初めて一団のエピト
ープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を
起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生
される。このように高分子化合物と結合させて初めて免
疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。

【０００９】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１０】ダミノジッドについてはその必要性が非常
に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、抗
体を作製するためのハプテンも本発明前には得られてい
なかった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ダミノジッ
ドに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、及
びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明
細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合
可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１２】本発明はその一態様において、ダミノジッ
ドに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１３】本発明は、また、ダミノジッドに反応性を
有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプ
テン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供すること
を目的とする。

【００１４】本発明は、さらに、ダミノジッド誘導体と
高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。
当該結合体はダミノジッドに反応性を有する抗体を作製
するための抗原となる。

【００１５】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１６】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記ダミノジッド誘導体と高分
子化合物との結合体を使用することを含む、ダミノジッ
ドの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ダミノジッドにスペーサーアーム及び高
分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、ダ
ミノジッドの誘導体をハプテンとして使用することによ
り、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功
し、本発明の完成に至った。

【００１８】本発明の対象となるダミノジッドは、以下
の式（４）：

【化４】 で表される化合物である。

【００１９】本発明の抗体は、例えば、ダミノジッドに
スペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入し
た誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合さ
せたものを抗原として用いることによって得ることがで
きる。例えば、限定するわけではないが、以下の式
（１）−（３）：

【化５】 ［式（１）および（２）中、ｎは１−１０の整数であ
る］のいずれかで表される構造を有する化合物を、抗体
作製のためのハプテンとして使用する。本発明におい
て、化合物の立体異性体は特に限定されず全ての立体異
性体を含む。

【００２０】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ダミノジッドに反応
する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物
または該抗体を用いるダミノジッドの免疫学的測定方法
に関する。

【００２１】ダミノジッドの誘導体の作製 式（１）ないし（３）で表されるダミノジッド誘導体
は、公知の方法に従って作製することができる。例え
ば、限定されるわけではないが、以下に記載するような
方法がある。

【００２２】I．式（１）の化合物の製造方法例 ａ．先ず、以下の式（Ｘ１）：

【化６】 ［式（Ｘ１）中、Ｌはハロゲン原子であり（本明細書
中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味す
る）；Ｚは水酸基または脱離基であり；そしてｎは１−
１０の整数、好ましくは３−６の整数である］で表され
るハロゲン化合物に保護基を共有結合させて、以下の式
（Ｘ２）：

【化７】 ［式（Ｘ２）中、Ｐはカルボキシル基の保護基でありＬ
およびｎは先に定義した通りである］で表される化合物
を合成する。

【００２３】Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチ
ル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシ
ベンジル基、３,４−ジメトキシベンジル基、トリクロ
ロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジ
メチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることがで
きる。

【００２４】Ｚで示される脱離基は公知のものでよく、
例えば、フッ素、塩素、臭素等が挙げられる。

【００２５】カルボキシル基の保護基として、例えばｐ
−メトキシベンジル基を有する上記式（Ｘ２）の化合物
は、Ｚが水酸基である式（Ｘ１）を用いる場合には、ト
リフェニルホスフィンとアゾジカルボン酸ジエチル等ま
たは光延反応で常用される他の試薬の共存下で、ｐ−メ
トキシベンジルアルコールと反応させることによって合
成できる。また、Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド、１−
（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジ
イミド等のカルボジイミド系縮合剤、２,２'−ジピリジ
ルジスルフィドとトリフェニルホスフィン等の向山試
薬、またＢＯＰ試薬、ＤＰＰＡ等の他の縮合剤を用いて
もよい。あるいはクロロ蟻酸イソブチル等のハロ蟻酸エ
ステルを用いる混合酸無水物法を用いても合成すること
ができる。

【００２６】反応は０℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは２０℃−４０℃で、１時間−４０時間、好ましくは
１０時間−２０時間行う。溶媒としては、例えば、ジク
ロロメタン、１,２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶
媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族系溶媒、Ｎ,Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、ジエチルエーテル、テトラヒドロ
フラン、ジブチルエーテル、ジオキサン、１,２−ジメ
トキシエタン等を用いることができる。

【００２７】あるいは、カルボキシル保護基としてｔ−
ブチル基を有する上記式（Ｘ２）の化合物は、式（Ｘ
１）の化合物をイソブテンと反応させることにより合成
できる。反応はマイナス５０℃から溶媒の沸点の温度、
好ましくはマイナス２０℃−２０℃で、１時間−５０時
間、好ましくは５時間−３０時間行う。溶媒としては、
例えばジクロロメタン、１,２−ジクロロエタン、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン等を用いることができる。
触媒としては、例えば、濃硫酸、リン酸、三フッ化ホウ
素ジエチルエーテル錯体等を用いることができる。

【００２８】式（Ｘ１）の化合物でＺが脱離基の場合
は、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン等の有機溶媒
中でトリエチルアミン、ピリジン等の適当な塩基存在
下、ｐ−メトキシベンジル基と反応させることによって
目的物を合成できる。

【００２９】ｂ．次に、上記式（Ｘ２）の化合物を式
（４）のダミノジッドと、炭酸カリウム、炭酸ナトリウ
ム、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチ
ウム、ブチルリチウム、ナトリムメトキシド等の塩基、
好ましくは炭酸ナトリウムの存在下で反応させることに
より以下の式（Ｘ３）：

【化８】 ［式（Ｘ３）中、Ｐ、Ｌおよびｎは先に定義した通りで
ある］で表される化合物を合成する。反応は０℃から溶
媒の沸点の温度、好ましくは２０℃−３０℃で、５時間
−５０時間、好ましくは１０時間−３０時間行う。溶媒
としては、例えば、ヘキサメチルリン酸トリアミド（Ｈ
ＭＰＡ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド等を用いることができる。このとき１８−ク
ラウン−６等のクラウンエーテルや他の相間移動触媒を
共存させてもよい。

【００３０】ｃ．更に、式（Ｘ３）の化合物からＰで表
される保護基を除去することにより、式（１）の化合物
を得ることができる。保護基の除去は、酸加水分解、ア
ルカリ加水分解等の公知の方法で行うことができる。

【００３１】例えば、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｘ３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒、又はこれらの有機溶媒と水との混合溶媒に水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムまたは炭
酸カリウム等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは０℃から２０℃で、３０分−２時間撹拌反応さ
せることにより行うことができる。

【００３２】また、該保護基がｔｅｒｔ−ブチル基であ
る場合は、式（Ｘ３）の化合物を含む有機溶媒に酸触媒
を加えて、好ましくは撹拌下で反応させることにより行
われる。有機溶媒としては、例えば、ベンゼン等の芳香
族炭化水素類、ジクロロメタン、１,２−ジクロロエタ
ン等のハロゲン化炭化水素類、又はこれらの混合溶媒等
を使用できる。酸触媒としては公知のもの、例えばトリ
フルオロ酢酸等のカルボン酸、ｐ−トルエンスルホン酸
等のスルホン酸、塩酸、硝酸等の鉱酸などが使用できる
が、その中でもトリフルオロ酢酸が好ましい。反応温度
は、通常０℃−１００℃程度、好ましくは室温がよく、
反応時間は通常０.５−３時間程度とすればよい。

【００３３】更に、ベンジル基の除去は加水素分解によ
っても行うことができる。

【００３４】また、トリメチルシリル基、tert−ブチル
ジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、
トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリ
メチルシリルエトキシメチル基は、フッ化水素、テトラ
ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリ
ド等のフッ素イオンを発生させる試薬により選択的に除
去することもできる。

【００３５】ＩＩ．式（２）の化合物の製造方法例 ａ．先ず、式（１）の化合物の合成と同様に、式（Ｘ
１）の化合物のカルボキシル基に保護基を結合させて、
式（Ｘ２）の化合物を合成する。

【００３６】ｂ．式（Ｘ２）の化合物を、適当な溶媒に
溶解させる。これにメチルヒドラジン含有溶液を加えて
反応させ、式（Ｘ４）：

【化９】 ［式（Ｘ４）中、Ｐおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。反応はマイナス１０
℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは３０℃−６０℃
で、１時間−２０時間、好ましくは３−１０時間行う。
溶媒としては、例えば、エタノール、Ｎ,Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル
等を用いることができる。

【００３７】ｃ．次に、式（Ｘ４）の化合物をコハク酸
無水物と反応させて、式（Ｘ５）：

【化１０】 ［式（Ｘ５）中、Ｐおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。反応は０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは０℃−２５℃で、１時間−１
０時間、好ましくは１時間−３時間行う。溶媒として
は、例えば、ジクロロメタン、１,２−ジクロロエタ
ン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を用いるこ
とができる。

【００３８】ｄ．次に、式（Ｘ５）の化合物を、以下の
式（Ｘ６）：

【化１１】 で表される化合物と反応させて、式（Ｘ７）：

【化１２】 ［式（Ｘ７）中、Ｐおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。反応は０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは１０℃−３０℃で、１０分−
１０時間、好ましくは３０分−３時間行う。溶媒として
は、例えば、トルエンとメタノールとの混合溶液等を用
いることができる。

【００３９】ｅ．最後に、式（１）の化合物の合成と同
様に、式（Ｘ７）の化合物からＰのカルボキシル基の保
護基を除去することにより、式（２）の化合物を得るこ
とができる。

【００４０】ＩＩＩ．式（３）の化合物の製造方法例 ａ．先ず、式（Ｘ８）：

【化１３】 ［式（Ｘ８）中、ＰおよびＺは、先に定義した通りであ
る］で表される化合物２分子をヒドラジンを用いて縮合
させて、以下の式（Ｘ９）：

【化１４】 ［式（Ｘ９）中、Ｐは先に定義した通りである］で表さ
れる化合物を合成する。

【００４１】ｂ．最後に、式（１）の化合物の合成と同
様に、式（Ｘ９）の化合物からＰのカルボキシル基の保
護基を除去することにより、式（３）の化合物を得るこ
とができる。

【００４２】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶
操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とする
ことができる。

【００４３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４４】ダミノジッド誘導体と高分子化合物との結
合体の作製 上述のように合成されたダミノジッド誘導体を適当な高
分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。

【００４５】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。

【００４６】ダミノジッド誘導体と高分子化合物との結
合は、例えば、活性化エステル法（A.E. KARU et al.:
J. Agric. Food Chem. 42 301-309 (1994)）、または、
混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.Biol.Chem. 2
34 1090-1094 (1954)）等の公知の方法によって行うこ
とができる。

【００４７】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ドエステルを生成する。

【００４８】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」という）、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０−１０：１、より好ましくは、
１：１−１：１０、最も好ましくは１：１である。反応
温度は、０℃−１００℃、好ましくは５℃−５０℃、よ
り好ましくは２２℃−２７℃で、反応時間は５分−２４
時間、好ましくは３０分−６時間、より好ましくは１−
４時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温
度で行うことができる。

【００４９】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間にア
ミド結合が生成される。反応温度は、０℃−６０℃、好
ましくは５℃−４０℃、より好ましくは２２℃−２７℃
で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時
間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製
して、ダミノジッド誘導体と高分子化合物との結合体を
得ることができる。

【００５０】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては例えば、Ｎ−メチルモルホリン、
トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、Ｎ,
Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等
の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素
カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げら
れる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００℃、好ま
しくは０℃−５０℃において行われ、反応時間は５分−
１０時間、好ましくは５分−２時間である。得られた混
合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２
０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃において行
われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは５分−５
時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われ
る。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているい
ずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、
ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエ
タン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、
ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、
トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルと
しては、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸メチ
ル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸
エチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハ
ロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲
から適宜選択され得る。

【００５１】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をダミノジッド誘導体に結合させたものを、免
疫測定法において使用することができる。標識物質とし
ては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」
と言う）やアルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオ
レセインイソチオシアネートやローダミン等の発色物
質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質などがある。

【００５２】ポリクローナル抗体の作製 ダミノジッド誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。例えば、ダミノジッド誘導
体−ＢＳＡ結合体をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と
言う）に溶解し、フロイント完全アジュバントまたは不
完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混
合したものを、免疫用抗原として動物に免疫することに
よって行う。免疫される動物としては当該分野で常用さ
れるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラ
ット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。

【００５３】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。投与は１
回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間
の間隔で複数回行うことができる。

【００５４】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ダミノジッドと反応するポリクロ
ーナル抗体の存在を評価することができる。

【００５５】本発明のダミノジッド誘導体と高分子化合
物との結合体により免疫感作させたマウスの抗血清は、
後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、ダミノジ
ッドの量を約１００μｇ／ｍｌ以上の範囲で測定できる
（実施例９）。

【００５６】モノクローナル抗体の作製 ダミノジッド誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００５７】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するダミノジッド誘導体と
高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養または動物へのハイブリド
ーマの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００５８】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学（山
下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６
年）に記載されている。

【００５９】以下、上述の本発明のダミノジッドに対す
るモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに
制限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００６０】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００６１】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液またはこれらの組み合わせから得ることができる
が脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６２】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００６３】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ
改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当
日に１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００６４】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのは、融合作業も
簡単なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法
である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、
山下修二ら（上述）に記載されている。その他の融合方
法としては、電気処理（電気融合）による方法等を適宜
採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．
１３１５−１９、１９８７）。また、細胞の使用比率も
公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対し
て脾細胞を３−１０倍程度用いればよい。脾細胞とミエ
ローマ細胞とが融合し、抗体産生能及び増殖能を獲得し
たハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞
株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭ
ＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行う
ことができる。

【００６５】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ダミノジッドに対する抗体活性を測
定する。さらに、測定によりダミノジッドに反応する抗
体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クロ
ーニングを行う。この細胞クローニング法としては、限
界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれ
るように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に
撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターに
よって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによっ
て１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙
げられる。限界希釈法が簡単でありよく用いられる。

【００６６】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗ダミノジッド
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。

【００６７】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒
温器中）で培養するのが好ましい。

【００６８】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。または、同系統のマウス（例えば、上述のＢａ
ｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブ
リドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも
可能である。

【００６９】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ダミノジッドモノクローナル抗体として使用
することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによ
る塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め
精製することにより抗ダミノジッドモノクローナル抗体
を得ることができる。さらに精製が必要な場合には、イ
オン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、オープンカラムクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣
用されている方法を使用して抗体画分を集める操作を１
回、または複数回行うことにより実施できる。

【００７０】以上のようにして得られた抗ダミノジッド
モノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法な
どの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決
定することができる。

【００７１】抗体によるダミノジッドの測定 本発明で使用する抗体によるダミノジッドの測定方法と
しては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Engvall,E.,Meth. Ensymol., 70,419-439
(1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法等の一
般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブ
リドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプ
ラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００７２】ダミノジッドの測定は各種ＥＬＩＳＡ法の
うち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下の
ような手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原
であるダミノジッド誘導体と高分子化合物との結合体を
担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表
面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキ
ングする。（ｃ）これに各種濃度のダミノジッドを含む
試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び遊離
ダミノジッドに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体
複合体及び遊離ダミノジッド−抗体複合体を生成させ
る。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定すること
により、予め作成した検量線から試料中の遊離ダミノジ
ッドの量を決定することができる。

【００７３】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００７４】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えばリン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗
原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１−
１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.０５−１０μｇ
／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマ
イクロタイタープレートを使用する場合には、３００μ
ｌ／ウェル以下で５０−１５０μｌ／ウェル程度が望ま
しい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限は
ないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適し
ている。

【００７５】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体作製に使用したダミノジッド誘導体と高分子化合物
との結合体自体のみならず、式（１）−（３）のいずれ
かで表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用
いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他の
ダミノジッド類似化合物も、固相化抗原として使用する
ことも可能である。

【００７６】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原との結
合体を固相化した担体において、ダミノジッド誘導体部
分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在す
る場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブ
ロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶
液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏ
ｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２
５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを
使用することもできる。具体的には、限定されるわけで
はないが、例えば抗原を固相化した部分に、ＰＢＳで４
倍希釈したブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩
インキュベーションした後、緩衝液で洗浄することによ
り行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例え
ば、ＰＢＳが適している。

【００７７】次いで（ｃ）工程において、ダミノジッド
を含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相
化抗原及び遊離ダミノジッドと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及び遊離ダミノジッド−抗体複
合体が生成する。

【００７８】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のダミノジッドに対する抗体を加え、更に第二抗
体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順
次加えて反応させる。

【００７９】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
ＰＢＳが好ましい。

【００８０】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるの
が適当である。担体に結合した第一抗体に最終吸光度が
４以下で、好ましくは０．３−３.０となるように希釈
した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝
液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で
約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応
により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識し
た第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要
である。

【００８１】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からダミノジッドの量を
算出することができる。

【００８２】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば基質として過酸化水
素、発色試薬としてオルトフェニレンジアミン（以下、
「ＯＰＤ」と言う）を使用することができる。限定され
るわけではないが、発色溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。ＯＰＤを使用する場合、４９０ｎｍの吸光
度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてア
ルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−
ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮ
ａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度
を測定する方法が適している。

【００８３】あるいは、ダミノジッドの測定は、例えば
以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用い
た直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を担体に固相
化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のダミノジッドを含
む試料に、ダミノジッド誘導体と酵素を結合させた酵素
結合ハプテンを加えた混合物を調製する。 （ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のダミノジッドの量を決定する。

【００８４】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００８５】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のダミノジッ
ド及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸
着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目
的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００８６】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ダミノジッド誘導体を酵素に結合する方法
であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよい。
例えば、前述した活性化エステル法を採用することがで
きる。調製した酵素結合ハプテンは、ダミノジッドを含
む試料と混合する。

【００８７】なお、酵素に結合させるハプテンとして
は、抗体作製に使用したダミノジッド誘導体自体のみな
らず、式（１）−（３）のいずれかで表される他の誘導
体を用いることもできる。さらに、式（１）−（３）に
含まれない他のダミノジッド類似化合物も、酵素に結合
させるハプテンとして使用することも可能である。例え
ば、式（１）の化合物と高分子化合物との結合体を抗原
として抗体を作製した場合、式（２）または（３）の化
合物を標識競合化合物として用いることもできる、ま
た、式（１）または（２）においてｎの数が相違する化
合物を各々抗体作製用と標識競合化合物として用いるこ
ともできる。

【００８８】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のダミノジッドと酵素結合
ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体
との複合体が生成する。ダミノジッドを含む試料は適当
な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではない
が、反応は例えば室温でおよそ１時間行う。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテン
を除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを採用することが
できる。

【００８９】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からダミノジッドの量を算出することができ
る。

【００９０】本発明のモノクローナル抗体４Ｊ８−１４
−１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０.０１
−１００μｇ／ｍｌ，好ましくは０．１−１０μｇ／ｍ
ｌの範囲でダミノジッドを測定できる（実施例１０およ
び１１、図１および図２）。

【００９１】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００９２】

【実施例】実施例１ ダミノジッド誘導体−１の合成

【化１５】

【００９３】（２）の合成 ８．４ｇ（５０ｍｍｏｌ）の４−ブロモ酪酸（１）とア
ゾジカルボン酸ジエチル８．７ｇ（５０ｍｍｏｌ）のジ
エチルエーテル溶液１００ｍｌに、室温で４−メトキシ
ベンジルアルコール１０．４ｇ（７５ｍｍｏｌ）とトリ
フェニルホスフィン１３．１ｇ（５０ｍｍｏｌ）のジエ
チルエーテル溶液５０ｍｌをゆっくりと滴下した。その
まま室温で一晩撹拌後、濾過、濃縮した濾液をシリカゲ
ルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル＝１９：
１→９：１）で精製すると、透明液体として（２）を
８．８ｇ（収率６１％）得た。

【００９４】（３）の合成 ４．０ｇ（２５ｍｍｏｌ）のダミノジッドと７．３ｇ
（２５ｍｍｏｌ）の（２）を３０ｍｌのヘキサメチルリ
ン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）に溶解後、炭酸カリウム１
０ｇ（７５ｍｍｏｌ）を添加して室温で１日撹拌した。
反応混合物をジエチルエーテル−水で分配（１００ｍｌ
×３回）して、集めたエーテル溶液を脱水（無水硫酸マ
グネシウム）、濾過、濃縮してシリカゲルクロマトグラ
フィー（酢酸エチル）で精製すると、透明液体として
２．７ｇ（収率２９％）の（３）を得た。

【００９５】（４）の合成 ２．７ｇ（７．４ｍｍｏｌ）のエステル化合物（３）を
１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢
酸１０ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液を
そのまま減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー
（クロロホルム−メタノール＝９：１）で精製すると、
透明液体として１．２ｇ（収率６７％）の（４）を得
た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．８２〜２．１６（ｍ，２Ｈ）,２．２３〜２．９２
（overlap,１２Ｈ），４．０２〜４．１２（ｔ，２Ｈ）

【００９６】実施例２ ダミノジッド誘導体−２の合成

【化１６】

【００９７】（２）の合成 ５．９ｇ（３０ｍｍｏｌ）の６−ブロモカプロン酸
（１）とアゾジカルボン酸ジエチル５．３ｇ（３０ｍｍ
ｏｌ）のジエチルエーテル溶液１００ｍｌに、室温で４
−メトキシベンジルアルコール６．２ｇ（４５ｍｍｏ
ｌ）とトリフェニルホスフィン７．９ｇ（３０ｍｍｏ
ｌ）のジエチルエーテル溶液５０ｍｌをゆっくりと滴下
した。そのまま室温で一晩撹拌後、濾過、濃縮した濾液
をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチ
ル＝９：１）で精製すると、透明液体として（２）を
８．０ｇ（収率８４％）得た。

【００９８】（３）の合成 ４．７ｇ（２９ｍｍｏｌ）のダミノジッドと９．２ｇ
（２９ｍｍｏｌ）の（２）を３０ｍｌのヘキサメチルリ
ン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）に溶解後、炭酸カリウム
７．０ｇ（５１ｍｍｏｌ）を添加して室温で１日撹拌し
た。反応混合物をジエチルエーテル−水で分配（１００
ｍｌ×３回）して、集めたエーテル溶液を脱水（無水硫
酸マグネシウム）、濾過、濃縮してシリカゲルクロマト
グラフィー（酢エチル）で精製すると、透明液体として
５．４ｇ（収率４７％）の（３）を得た。

【００９９】（４）の合成 ７．０ｇ（１７．８ｍｍｏｌ）のエステル化合物（３）
を１５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ
酢酸１０ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液
をそのまま減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィ
ー（酢酸エチル→クロロホルム−メタノール＝９：１）
で精製すると、透明液体として３．５ｇ（収率７２％）
の（４）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．２５〜１．８０（ｍ，６Ｈ），２．２０〜３．２５
（overlap，１２Ｈ),４．００〜４．１１（ｔ，２
Ｈ），１０．８０（ｂｒ，１Ｈ）

【０１００】実施例３ ダミノジッド誘導体−３の合成

【化１７】

【０１０１】（２）の合成 ６．１ｇ（５０ｍｍｏｌ）の４−クロロ酪酸（１）をジ
クロロメタン１００ｍｌに溶解して、塩−氷で冷却し
た。イソブテン５．０ｇをバブリングして、リン酸０．
４ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエ
ーテル錯体０．５ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）を滴下した。
そのまま一晩撹拌後に濃縮し、シリカゲルクロマトグラ
フィー（ヘキサン−酢酸エチル＝４：１）で精製する
と、透明液体として（２）を６．３ｇ（収率７１％）得
た。

【０１０２】（３）の合成 ５．４ｇ（３６ｍｍｏｌ）の（２）と９．０ｇ（６０ｍ
ｍｏｌ）のヨウ化ナトリウムを１５０ｍｌのアセトンに
溶解して窒素気流下、６０℃で１日還流した。反応混合
物を濾過、濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（ヘ
キサン→ヘキサン−酢酸エチル＝４９：１→１９：１）
で粗精製した。この粗精製物のエタノール５０ｍｌにメ
チルヒドラジン２．５ｇ（５４ｍｍｏｌ）のエタノール
溶液１０ｍｌを滴下して、６０℃で一晩撹拌した。反応
溶液をそのまま濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィ
ー（クロロホルム−メタノール＝４０：１）で精製する
と、（３）を１．８ｇ（収率３２％）得た。

【０１０３】（４）の合成 １．８ｇ（９．５ｍｍｏｌ）の（３）を３０ｍｌのジク
ロロメタンに溶解し、１．０ｇ（１０ｍｍｏｌ）のコハ
ク酸無水物を加えて室温で一日撹拌した。反応溶液をそ
のまま減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘ
キサン→ヘキサン−酢酸エチル＝４：１→１：１→酢酸
エチル）で精製すると、１．０ｇ（収率３６％）の
（４）を得た。

【０１０４】（５）の合成 １．０ｇ（３．５ｍｍｏｌ）の（４）をトルエン−メタ
ノール（４：１）溶液３５ｍｌに溶解し、トリメチルシ
リルジアゾメタンの１０％ヘキサン溶液４．３ｇを加え
て室温で３時間撹拌した。反応溶液をそのまま減圧濃縮
し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精
製すると、０．９ｇ（収率８６％）の（５）を得た。

【０１０５】（６）の合成 １．０ｇ（３．３ｍｍｏｌ）のエステル化合物（５）を
５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸
１０ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液をそ
のまま減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢
酸エチル）で精製すると、０．８１ｇ（収率１００％）
の（６）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．７０〜２．０２（ｍ，２Ｈ），２．２６〜２．８９
（overlap,１１Ｈ)，３．６５（ｓ，３Ｈ）

【０１０６】実施例４ ダミノジッド誘導体−４の合成

【化１８】

【０１０７】（２）の合成 ２１ｇ（１０８ｍｍｏｌ）の６−ブロモカプロン酸
（１）をジクロロメタン２５０ｍｌに溶解して、塩−氷
で冷却した。イソブテン１０ｇをバブリングして、濃硫
酸１ｍｌを滴下後、更にイソブテン１０ｇを加え、その
まま氷冷下で１時間、そして室温で１日撹拌した。反応
液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン
→ヘキサン−酢酸エチル＝１９：１）で精製すると、透
明液体として（２）を１０．７ｇ（収率４０％）得た。

【０１０８】（３）の合成 （２）５．０ｇ（２０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液１０
０ｍｌにメチルヒドラジン２．３ｇ（５０ｍｍｏｌ）の
エタノール溶液１０ｍｌを滴下して、６０℃で３時間撹
拌した。更に７０℃で１時間撹拌後、反応溶液を濃縮し
て、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル→クロ
ロホルム−メタノール＝２０：１）で精製すると、
（３）を２．２ｇ（収率５１％）得た。

【０１０９】（４）の合成 ２．２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（３）を３０ｍｌのジクロ
ロメタンに溶解し、１．１ｇ（１１ｍｍｏｌ）のコハク
酸無水物を加えて室温で１日撹拌した。反応溶液をその
まま減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキ
サン→ヘキサン−酢酸エチル＝４：１→１：１→酢酸エ
チル）で精製すると、１．８ｇ（収率５６％）の（４）
を得た。

【０１１０】（５）の合成 １．８ｇ（５．７ｍｍｏｌ）の（４）をトルエン−メタ
ノール（４：１）溶液５０ｍｌに溶解し、７ｇのトリメ
チルシリルジアゾメタンの１０％ヘキサン溶液を加えて
室温で２時間撹拌した。反応溶液をそのまま減圧濃縮
し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エ
チル＝１：１→酢酸エチル）で精製すると、１．７５ｇ
（収率９３％）の（５）を得た。

【０１１１】（６）の合成 １．７５ｇ（５．３ｍｍｏｌ）のエステル化合物（５）
を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ
酢酸１０ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液
をそのまま減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー
（クロロホルム−メタノール＝２０：１）で精製する
と、０．８１ｇ（収率５６％）の（６）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．３０〜１．８０（overlap,６Ｈ），２．２２〜２．
９３（overlap,１１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ）

【０１１２】実施例５ ダミノジッド誘導体−５の合成

【化１９】

【０１１３】（２）の合成 １３．３ｇ（５０ｍｍｏｌ）の１１−ウンデカン酸
（１）をジクロロメタン２００ｍｌに溶解して、塩−氷
で冷却した。イソブテン１０ｇをバブリングして、濃硫
酸０．５ｍｌを滴下し、そのまま氷冷下で２時間、そし
て室温で３時間撹拌した。反応液を濃縮し、シリカゲル
クロマトグラフィー（ヘキサン→ヘキサン−酢酸エチル
＝１９：１）で精製すると、透明液体として（２）を１
０．８ｇ（収率６７％）得た。

【０１１４】（３）の合成 （２）９．６ｇ（３０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液１０
０ｍｌにメチルヒドラジン２．０ｇ（４４ｍｍｏｌ）の
エタノール溶液１０ｍｌを氷冷下で滴下した。滴下終了
後に室温に戻して３時間撹拌した。更に６０℃で３時間
撹拌後、反応溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラ
フィー（クロロホルム−メタノール＝４０：１）で精製
すると、（３）を１．８ｇ（収率２１％）得た。

【０１１５】（４）の合成 １．８ｇ（６．３ｍｍｏｌ）の（３）を５０ｍｌのジク
ロロメタンに溶解し、０．９ｇ（９ｍｍｏｌ）のコハク
酸無水物を加えて室温で１日撹拌した。反応溶液をその
まま減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキ
サン→ヘキサン−酢酸エチル＝４：１→１：１→酢酸エ
チル−クロロホルム−メタノール＝９：１）で精製する
と、０．５２ｇ（収率２１％）の（４）を得た。

【０１１６】（５）の合成 ０．２ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）の（４）をトルエン−メ
タノール（４：１）溶液５ｍｌに溶解し、１ｇのトリメ
チルシリルジアゾメタンの１０％ヘキサン溶液を加えて
室温で１時間撹拌した。反応溶液をそのまま減圧濃縮
し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精
製すると、０．２１ｇ（収率１００％）の（５）を得
た。

【０１１７】（６）の合成 ０．４８ｇ（１．２ｍｍｏｌ）のエステル化合物（５）
を３０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢
酸５ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液をそ
のまま減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢
酸エチル→クロロホルム−メタノール＝９：１）で精製
すると、０．３ｇ（収率７３％）の（６）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．３０〜１．８０(overlap,１６Ｈ），２．２０〜
２．９０（overlap,１１Ｈ），３．６４（ｓ，３Ｈ）

【０１１８】実施例６ ダミノジッドの誘導体−６の合
成

【化２０】

【０１１９】（２）の合成 １０ｇ（６０ｍｍｏｌ）のモノエチルコハク酸クロリド
（１）のジクロロメタン２００ｍｌ溶液に、１０ｍｌの
ヒドラジン１．０ｇ（３１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン
溶液、次いで１０ｍｌのトリエチルアミン６．０ｇ（６
０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を氷冷下で滴下し
た。そのまま氷冷下で２．５時間撹拌して、水洗した。
集めたジクロロメタン層を無水硫酸マグネシウムで脱
水、濾過、濃縮した。濃縮液にヘキサンを添加すると、
（２）が析出し、７．１ｇ（収率４１％）得た。

【０１２０】（３）の合成 ７．１ｇ（２５ｍｍｏｌ）の（３）を５０ｍｌのメタノ
ールに溶解し、２．５ｇ（６３ｍｍｏｌ）の水酸化ナト
リウムを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧
濃縮し、白色残渣を水に溶かし、濃塩酸でｐＨを２〜３
に調製した。酢酸エチルで洗って、再び水層を濃縮する
と、白色結晶が析出してきたので、これを濾別してメタ
ノールで洗浄した。３．９ｇ（収率６８％）。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） ２．２１〜２．８２（ｍ，８Ｈ），９．７８（ｓ，２
Ｈ）

【０１２１】実施例７ ダミノジッド誘導体と高分子化
合物もしくは標識物質との結合体の作製 免疫原およびスクリーニング用抗原としてダミノジッド
誘導体−１とＢＳＡとの結合体を活性化エステル法を用
いて作製した。

【０１２２】実施例１で作製したダミノジッド誘導体−
１の０．０５ｍｍｏｌをＤＭＦ０．２５ｍｌに溶解し、
Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド０．０５ｍｍｏｌ及びジ
シクロヘキシルカルボジイミド０．０５ｍｍｏｌを加
え、室温で３．５時間撹拌した。反応後、１００００ｒ
ｐｍで１５分間遠心し、上清と沈殿に分離した。

【０１２３】一方、ＢＳＡ２５ｍｇを１４５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ−０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２：以下「Ｐ
ＢＳ」という）２．５ｍｌに溶解し、ＤＭＦ０．５ｍｌ
を加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記の上清
０．１２５ｍｌを加え、室温にて１６時間反応させた。
反応後、蒸留水にて４℃で透析したダミノジッド誘導体
１−ＢＳＡ結合体を免疫用抗原として用いた。

【０１２４】さらに、同様の方法を用いてダミノジッド
誘導体１−ＲＳＡとの結合体、ダミノジッド誘導体１−
ＨＲＰ結合体、およびダミノジッド誘導体２−ＨＲＰ結
合体も作製した。

【０１２５】実施例８ 免疫感作 免疫用抗原１００μｇをＰＢＳ１００μｌに溶解し、等
量のフロイント完全アジュバンドと混合して、Ｂａｌｂ
／ｃマウスの皮下に接種した。さらに、２．４週間後に
それぞれフロイント不完全アジュバンドを用いて前記と
同様に調製した免疫用抗原を追加免疫した。また、６週
間目にＰＢＳに溶解した免疫用抗原をマウスの腹腔に追
加免疫した。

【０１２６】実施例９ 抗血清によるダミノジッドの反
応性 実施例８におけるマウス腹腔への接種直前、採血した抗
血清を希釈調製して、以下に詳述する間接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡにてダミノジッドを測定し、抗血清を評価した。

【０１２７】免疫用抗原と同様に調製したダミノジッド
誘導体１−ＲＳＡ結合体の溶液（０.１μｇ／ｍｌ）を
５０μｌ／ウェルの量で９６穴プレートにコーティング
し、４倍希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃ
ｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブ
ロッキングしてアッセイ用プレートを作製した。これに
抗血清５０００倍希釈液と、各種濃度のダミノジッドを
含む２０％メタノール溶液とを等量混合し、その５０μ
ｌをウェルに入れ、室温で１時間反応させた。

【０１２８】ＰＢＳで５回洗浄した後に、１０倍希釈の
ブロックエースを用いて２０００倍希釈したペルオキシ
ダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を
５０μｌ／ウェルの量で加え、室温で１時間反応させ
た。

【０１２９】ＰＢＳで５回洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのＯＰ
Ｄ及び０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量
で加え、室温で１０分間反応させて発色させた。

【０１３０】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一例を以下の表１に示す。

【０１３１】

【表１】 マウス抗血清を用いたダミノジッドの反応性 ダミノジッド濃度 吸光度（４９０ｎｍ） 吸光度の差 ０μｇ／ｍｌ ０．３６５ １μｇ／ｍｌ ０．３６５ ０．０００ １０μｇ／ｍｌ ０．３３５ ０．０３０ １００μｇ／ｍｌ ０．２４６ ０．１１９ 表１より、マウスの抗血清を使用することにより、１０
０μｇ／ｍｌのダミノジッドの吸光度をコントロールの
吸光度との差で確認することができ、ダミノジッドを測
定することができた。

【０１３２】実施例１０ ハイブリドーマの作製 実施例８に続いて、血清中の抗ダミノジッド抗体活性が
高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２
／Ｏ−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組織細胞化
学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年）に
従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養し
た。細胞の増殖が認められた培養上清液は、実施例３と
同様の方法でコーティング及びブロッキングしたプレー
トにそれぞれ５０μｌ／ウェルの量で加え、室温で１時
間反応させた。

【０１３３】ＰＢＳで５回洗浄後、１０倍希釈のブロッ
クエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５０
μｌ／ウェルの量で加え、室温で１時間反応させた。

【０１３４】ＰＢＳで５回洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのＯＰ
Ｄ及び０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量
で加え、室温で１０分間反応させて発色させた。

【０１３５】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加え、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、反
応性を示す細胞（ハイブリドーマ）を選抜した。次に、
各ウェルのダミノジッドとの反応性を実施例９に記載し
た間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗体を産生
している細胞について限界希釈法によりクローニングを
行った。

【０１３６】その結果、数株のハイブリドーマが抗ダミ
ノジッド抗体を産生する細胞としてクローン化された。
これらのうち、４Ｊ８−１４−１を平成９年６月２７日
に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６２８９で、工業技術院
生命工学工業技術研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東
１丁目１番３号）に寄託した。

【０１３７】実施例１１ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡによ
るダミノジッドの測定（１） 実施例１０で得られたハイブリドーマ４Ｊ８−１４−１
をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られた腹
水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーの原理
を用いたＭａｂ ＴｒａｐＧ（ファルマシア社製）カラ
ムによりモノクローナル抗体を精製し、以下の試験法
（直接競合阻害ＥＬＩＳＡ）にてダミノジッドの量を測
定した。

【０１３８】上に記載のモノクローナル抗体溶液（５μ
ｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルの量で９６穴ウェルプ
レートに入れ、４℃で一晩静置してコーティングし、さ
らに４倍希釈のブロックエース（雪印乳業社製）でブロ
ッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製した。各
濃度のダミノジッド及び実施例１で作製したダミノジッ
ド誘導体１−ＨＲＰ結合体を含むＰＢＳ溶液を１００μ
ｌずつ各ウェルに入れ、２５℃で１時間反応させた。

【０１３９】反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、２ｍｇ
／ｍｌのＯＰＤ及び０．０２％の過酸化水素を含むクエ
ン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌずつ各
ウェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行っ
た。

【０１４０】次に、１Ｎ硫酸を１００μｌずつ各ウェル
に加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測
定した。この結果を図１に示した。図１より直接競合阻
害ＥＬＩＳＡにおいて、本発明のモノクローナル抗体４
Ｊ８−１４−１はダミノジッドの量を０．０１〜１００
μｇ／ｍｌの範囲で測定することが確認できた。

【０１４１】実施例１２ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡによ
るダミノジッドの測定（２） 実施例１１で作製したプレートを用い、ダミノジッド誘
導体１−ＨＲＰ結合体をダミノジッド誘導体２−ＨＲＰ
結合体に代えて実施例１１と同様にダミノジッドの測定
を行った。この結果を図２に示す。図２より、本発明の
モノクローナル抗体４Ｊ８−１４−１は免疫原とは異な
るダミノジッド誘導体２−ＨＲＰ結合体を用いた場合に
も、ダミノジッドの量を実施例１１と同様に０．０１〜
１００μｇ／ｍｌの範囲で測定することが確認できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体４Ｊ８−
１４−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるダミノジッ
ドとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体４Ｊ８−
１４−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、標識競
合化合物を変えた場合のダミノジッドとの反応性を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (72)発明者 藤井 淳 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡邊 繁幸 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）−（３）： 【化１】 ［式（１）および（２）中、ｎは１−１０の整数であ
   る］のいずれかで表される構造を有する化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物ま
   たは標識物質との結合体。
3. 【請求項３】請求項１に記載の化合物に高分子化合物を
   結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いる
   ことにより、以下の式（４）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（４）の化合物と反応性を
   示す抗体またはそのフラグメントの製造方法。
4. 【請求項４】式（４）の化合物と反応性を示す抗体また
   はそのフラグメント。
5. 【請求項５】請求項２に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、請求項４に記載の抗体または
   そのフラグメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項４また
   は５に記載の抗体またはそのフラグメント。
7. 【請求項７】４Ｊ８−１４−１である、請求項４ないし
   ６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメン
   ト。
8. 【請求項８】請求項４ないし７のいずれか１項に記載の
   抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドー
   マ。
9. 【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６２８９で寄託
   されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】請求項４ないし７のいずれか１項に記載
    の抗体またはそのフラグメントを用いることを特徴とす
    る、式（４）で表される化合物の免疫学的測定方法。
11. 【請求項１１】さらに、式（１）−（３）のいずれかで
    表される化合物と、高分子化合物または標識物質との結
    合体を使用することを含む、請求項１０に記載の免疫学
    的測定方法。
12. 【請求項１２】式（１）−（３）のいずれかで表される
    化合物が、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗
    体又はそのフラグメントを作製するために用いた化合物
    とは異なるものである、請求項１１に記載の免疫学的測
    定方法。