JP2993902B2 - トリフルミゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、(Ｅ)−４−クロロ
−α,α,α−トリフルオロ−Ｎ−（１−イミダゾール−
１−イル−２−プロポキシエチリデン）−ｏ−トルイジ
ン（以下、本明細書中「トリフルミゾール」と言う）の
ハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関
する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】トリフルミゾールは、以下の式（２）：

【化３】 で表される構造を有し、イミダゾール系のエルゴステロ
ール生合成阻害剤（以下、「ＥＢＩ剤」と言う）に属す
る。

【０００４】エルゴステロールは、藻菌類を除く多くの
糸状菌が体内で合成するステロール類の内の一つで、生
体膜のリン脂質の二重層の間に存在し、細胞膜の強度
や、透過性、各種の膜酵素の機能に重要な影響を与えて
いる。エルゴステロールは、生体内では、酢酸からメバ
ロン酸、スクワレンなどを経て合成されるが、この経路
のいずれかの反応を特異的に阻害する一連の化合物群を
ＥＢＩ剤と総称する。ＥＢＩ剤は、幅広い抗菌スペクト
ルと浸透性、治療性など優れた特性を有する。子のう菌
類、担子菌類、不完全菌類などに有効で、中でも各種作
物のうどんこ病に卓効を有することが特徴である。従来
の薬剤と比較すると低薬量で効力を発揮し、植物体内へ
速やかに浸透するため耐雨性もある。また、ミツバチな
ど訪花昆虫に対する毒性が低いので、果樹などの開花期
の散布が可能である。ＥＢＩ剤は化学構造から、トリア
ゾール系、イミダゾール系、ピリミジン系等に分けられ
る。本発明のトリフルミゾールは、これらのうちイミダ
ゾール系のＥＢＩ剤に属する（農薬ハンドブック 第２
２４頁−第２３１頁 １９９４年版 日本植物防疫協
会）。

【０００５】トリフルミゾールは、広い抗菌活性を有
し、リンゴ、ナシの黒星病、赤星病、野菜などのうどん
こ病、イネ、ムギの種子伝染病の病害など広範囲の病害
に有効である。予防効果および治療効果がある。植物体
内での移行性は比較的弱く、一方ガス効果がある。他の
ＥＢＩ剤と同様、菌の胞子発芽は阻害しないが、菌糸の
伸長、病斑の形成、拡大、胞子の形成を阻害する。茎葉
散布剤として用いられる他、種子消毒剤、くん煙剤とし
ても使用される（上記 農薬ハンドブック 第２３０頁
−第２３１頁）。

【０００６】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。トリフルミゾールについては、食品衛生法に基づき
残留基準値が、小麦・とうもろこし等の穀類で１.０ｐ
ｐｍ、大根、はくさい、にんじん等の野菜類で１．０ｐ
ｐｍ、みかん、りんご、いちご等の果実類で２．０ｐｐ
ｍ等、定められている（農薬登録保留基準 残留農薬基
準ハンドブック 農薬環保全対策研究会編 第５５９頁
−第５６４頁）。環境や食品に関する安全確保のために
は、これらに含有される、トリフルミゾールの量を迅
速、かつ正確に測定することが必要である。

【０００７】従来、トリフルミゾールは、穀類、果実、
野菜、抹茶等の試料から抽出し、精製した後、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析されてき
た。例えば、試料をメタノールで抽出して、ジクロロメ
タン転溶、カラムクロマトグラフィーで精製した後、Ｈ
ＰＬＣで分析する方法が採用されてきた。これらの方法
は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、
分析に熟練を有すること、並びに、測定装置や設備等に
高額の費用を必要とする等の問題点がある。トリフルミ
ゾールの測定は、特に輸入農産物等の残留農薬の分析に
おいては、短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必
要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済
性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。

【０００８】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００９】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【００１０】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、トリフルミゾールのような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエ
ピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応
答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が
産生される。このように高分子化合物と結合させて初め
て免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」とい
う。

【００１１】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なけらばならない。

【００１２】トリフルミゾールについてはその必要性が
非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、抗体を作製するためのハプテンも本発明前には得ら
れていなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、トリフルミ
ゾールに特異的に反応する新規な抗体を作製するための
抗原を構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘
導体を提供することを目的とする。

【００１４】本発明は、また、トリフルミゾール誘導体
と高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。当該結合体はトリフルミゾールに特異的に反応する
抗体を作製するための抗原となる。

【００１５】本発明は、さらに、トリフルミゾールに強
い新和性を有する新規な抗体もしくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。

【００１６】本発明はその一態様において、前記化合物
に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１７】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１８】本発明は、さらに、前記抗体を使用するこ
とを含む、トリフルミゾールの免疫学的測定方法を提供
することを目的とする。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、トリフルミゾールにスペーサーアーム及
び高分子との結合に利用できる官能基を導入した、トリ
フルミゾールの誘導体をハプテンとして使用することに
より、前記化合物に特異的な抗体を得ることに成功し、
本発明の完成に至った。

【００２０】本発明の対象となるトリフルミゾールは、
以下の式（２）：

【化４】 で表される化合物である。

【００２１】抗体作製のためのハプテンとして使用され
る誘導体は、前記トリフルミゾールの

【化５】 の部分を

【化６】 ［式中、ｎは１−１０の整数であり、好ましくは２−５
である］に変化させたものである。即ち、本発明のトリ
フルミゾール誘導体は、以下の式（１）：

【化７】 ［式（１）中、ｎは前述した通りである］で表される構
造を有する化合物である。

【００２２】本発明のトリフルミゾールにスペーサーア
ーム及び結合に利用できる官能基を結合させた誘導体を
ハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを
抗原として用いることによって、トリフルミゾールに特
異的な抗体を得ることができる。

【００２３】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、トリフルミゾールに
反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化
合物又は該抗体を用いるトリフルミゾールの免疫学的測
定方法に関する。

【００２４】トリフルミゾールの誘導体の作製 式（１）で表されるトリフルミゾール誘導体は、例え
ば、式（３）：

【化８】 [式中、Ｘは水素原子またはｐ−メトキシ基であり、そ
してｎは先に定義した通りである。]で示されるイミド
ベンジルエステル化合物から、保護基のベンジル基を除
去することにより製造できる。

【００２５】ベンジル基の除去は水素による接触還元反
応によって行うことができる。還元反応はＰｄ−Ｃ等の
触媒の存在下、等モル以上の塩化水素の存在下または非
存在下に、水、メタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、酢酸エチル、酢酸等の溶媒中または
これらの混合溶媒中で、常圧または加圧下に行われる。
０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃
の温度で、１−３０時間、好ましくは２−１５時間撹拌
反応させることにより、式（１）の化合物を得ることが
できる。

【００２６】式（３）で示されるベンジルエステル化合
物は、例えば以下に記載するような方法に従って合成す
ることができる。

【００２７】先ず、４−クロロ−２−トリフルオロメチ
ルアニリンに以下の式（Ｚ１）：

【化９】 ［Ｒ’は、低級アルキル基であり、ｎは先に定義した通
りである。］で表されるカルボン酸塩化物を、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホル
ム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセ
トニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド等の不活性溶媒中、炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム等の無機塩基、トリエチルアミ
ン、ビリジン、ジイソプロピルエチルアミン等の有機塩
基の存在下、または非存在下に撹拌反応させることによ
り、以下の式（Ｚ２）：

【化１０】 ［式中、Ｒ’およびｎは先に定義した通りである。］で
表されるのアミドエステル化合物を得ることができる。
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温か
ら５０℃で、５分−１０時間、好ましくは、１−３時間
行う。

【００２８】出発原料のカルボン酸塩化物（Ｚ１）は、
相当するカルボン酸を塩化チオニル、三塩化リン、五塩
化リン等の酸塩素化剤で塩素化することにより合成でき
る。

【００２９】次に、式（Ｚ２）のアミドエステル化合物
を、好ましくはメタノール、エタノール、テトラヒドロ
フラン、エチレングリコール等の有機溶媒に溶解し、次
いで水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム水溶液を加
えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から
５０℃で、５分−５時間、好ましくは、３０分−１時間
撹拌反応させることにより以下の式（Ｚ３）：

【化１１】 ［式中、ｎは先に定義した通りである。］のカルボン酸
化合物を得ることができる。本化合物の中でｎが２また
は３の化合物は、４−クロロ−２−トリフルオロメチル
アニリンにこはく酸無水物またはグルタル酸無水物を反
応させても得ることができる。

【００３０】次に式（Ｚ３）のカルボン酸化合物を塩化
チオニル、三塩化リン、五塩化リン等の酸塩素化剤でカ
ルボン酸塩化物とした後、前記の化合物（Ｚ２）の合成
法と同様の方法で、以下の式（Ｚ４）：

【化１２】 ［式中、Ｘは先に定義した通りである。］で表されるの
ベンジルアルコール類と反応させ、以下の式（Ｚ５）：

【化１３】 ［式中、Ｘ 、ｎは先に定義した通りである。］で表さ
れるアミドベンジルエステル化合物を得ることができ
る。

【００３１】次に、このベンジルエステル化合物を特許
公開公報 昭５３−１５３７２号または昭５４−１１９
４６２号に記載と同様の方法で塩素化を行い、以下の式
（Ｚ６）：

【化１４】 ［式中、Ｘおよびｎは先に定義した通りである。］で表
されるイミド酸塩化物を得、次いで同明細書と同様の方
法でイミダゾールと反応させ、一般式（２）で表される
イミドベンジルエステル化合物を得ることができる。

【００３２】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００３３】トリフルミゾール誘導体と高分子化合物と
の結合体の作製 上述のように合成されたトリフルミゾール誘導体を適当
な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用
する。

【００３４】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ］と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ
及びＢＳＡが好ましい。

【００３５】トリフルミゾール誘導体と高分子化合物と
の結合は、例えば、混合酸無水物法（B.F.Erlanger et
al.:J.Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)）、又は活性
化エステル法（A.E. KARU et al.:J. Agric. Food Che
m. 42 301-309 (1994)）等の公知の方法によって行うこ
とができる。

【００３６】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得ら
れ、これを高分子化合物と反応させることにより目的と
するハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショ
ッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としてはショッテン−バウマン反応に
おいて慣用されている化合物を使用することができる。
例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメ
チルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ,Ｎ
−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の
有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カ
リウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられ
る。該反応は、通常マイナス２０℃−１００℃、好まし
くは０℃−５０℃において行われ、反応時間は５分−１
０時間、好ましくは５分−２時間である。得られた混合
酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０
℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃において行わ
れ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは５分−５時
間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。
溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれ
の溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジク
ロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢
酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸メチル、
ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００３７】一方活性化エステル法は、一般に以下のよ
うに行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶
媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキ
シこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸
イミドエステルを生成する。

【００３８】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサ
ン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ
−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：
１０−１０：１、より好ましくは、１：１−１：１０、
最も好ましくは１：１である。反応温度は、０−１００
℃、好ましくは５−５０℃、より好ましくは２２−２７
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは３０分−
６時間、より好ましくは１−２時間である。反応温度は
各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００３９】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、
反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、
より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、トリフルミゾール誘導体
と高分子化合物との結合体を得ることができる。

【００４０】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をトリフルミゾール誘導体に結合させたもの
を、免疫学測定方法において使用することができる。標
識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン等
の発色物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物
質などがある。

【００４１】ポリクローナル抗体の作製 トリフルミゾール誘導体と高分子化合物との結合体を使
用して、慣用化された方法により本発明のポリクローナ
ル抗体を作製することができる。例えば、トリフルミゾ
ール誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝液（以下、「Ｐ
ＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント
又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助
剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫する
ことによって行う。免疫される動物としては当該分野で
常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウ
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができ
る。

【００４２】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。投与は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間
隔で複数回行うことができる。

【００４３】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、トリフルミゾールと反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。

【００４４】モノクローナル抗体の作製 トリフルミゾール誘導体と高分子化合物との結合体を使
用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体
を作製することができる。

【００４５】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００４６】（ａ）免疫用抗原として使用するトリフル
ミゾール誘導体と高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Hybridoma Techniques），コールド スプリング
ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laborat
ory），１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、
日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載
されている。

【００４７】以下、上述の本発明のトリフルミゾールに
対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、こ
れに制限されないことは当業者によって明らかであろ
う。

【００４８】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００４９】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５０】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００５１】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００５２】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法に
ついては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）
に記載されている。別の融合方法としては、電気処理
（電気融合）による方法を採用することもできる（大河
内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８
７）。その他の方法を適宜採用することもできる。ま
た、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えば
ミエローマ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いれ
ばよい。

【００５３】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使
用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキ
サンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製し
たＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００５４】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、トリフルミゾールに対する抗体活性
を測定する。

【００５５】さらに、測定によりトリフルミゾールに反
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法とし
ては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマ
が含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天
培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレ
ーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソータ
ーによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。

【００５６】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗トリフルミゾ
ールモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選
択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒
温器中）で培養するのが好ましい。

【００５７】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００５８】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗トリフルミゾールモノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗トリフルミゾールモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに高度な精製が必要
な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合
わせることにより実施できる。

【００５９】以上のようにして得られた抗トリフルミゾ
ールモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ
法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等
を決定することができる。

【００６０】抗体によるトリフルミゾールの測定 本発明で使用する抗体によるトリフルミゾールの測定方
法としては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ
法）、ＥＬＩＳＡ法（Engvall,E., Methods in Enzymo
l., 70, 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、
スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ）法等の一般に抗原の検出に使用されている種々
の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、
株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、
昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の
観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００６１】トリフルミゾールの測定は各種ＥＬＩＳＡ
法のうち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以
下のような手順により行うことができる。（ａ）まず、
抗原であるトリフルミゾール誘導体と高分子化合物との
結合体を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していな
い固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により
ブロッキングする。（ｃ）これに各種濃度のトリフルミ
ゾールを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化
抗原及び遊離トリフルミゾールに競合的に反応させて、
固相化抗原−抗体複合体及び遊離トリフルミゾール−抗
体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体
の量を測定することにより、予め作成した検量線から試
料中の遊離トリフルミゾールの量を決定することができ
る。

【００６２】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００６３】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、１４５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＰＢＳを
挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲
から選択できるが、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０.０５−５μｇ／ｍｌが適している。
また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレー
トを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０
−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュ
ベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度
で一晩インキュベーションが適している。

【００６４】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（トリ
フルミゾール誘導体と高分子化合物との結合体）を固相
化した担体において、トリフルミゾール誘導体部分以外
に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合
があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキ
ング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使
用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ
Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエー
スを適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした
後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液とし
ては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７.２）、０.８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０.０２％
（ｗ／ｖ）ＫＣｌ，０.０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２
０の組成のものが適している。

【００６５】次いで（ｃ）工程において、トリフルミゾ
ールを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原及び遊離トリフルミゾールと反応させること
により、固相化抗原−抗体複合体及び遊離トリフルミゾ
ール−抗体複合体が生成する。

【００６６】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のトリフルミゾールに対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識物質を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。

【００６７】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。この反応に用いる試薬とし
ては、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.２）、０.８％（ｗ／
ｖ）ＮａＣｌ、０.０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌの組成のも
のが好ましい。

【００６８】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５０００−１
００００倍、好ましくは最終吸光度が１．０−１．５と
なるように希釈した第二抗体を反応させるのが望まし
い。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではない
が、反応は約３７℃で約１時間行い、反応後、緩衝液で
洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結
合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その
場合、第二抗体は不要である。

【００６９】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からトリフルミゾー
ルの量を算出することができる。

【００７０】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば基質として過酸化水
素、発色試薬としてｏ−フェニレンジアミン（以下、
「ＯＰＤ」と言う）を使用する。限定されるわけではな
いが、発色溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた
後、２Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させ
る。ＯＰＤを使用する場合、４９０ｎｍの吸光度を測定
する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホ
スファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフ
ェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを
加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定す
る方法が適している。

【００７１】遊離のトリフルミゾールを添加しない反応
溶液の吸光度に対して、トリフルミゾールを添加して抗
体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計
算する。既知の濃度のトリフルミゾールを添加した反応
液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、
試料中のトリフルミゾールの濃度を算出できる。

【００７２】あるいは、トリフルミゾールの測定は、例
えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を
用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともで
きる。

【００７３】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。

【００７４】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキン
グする。

【００７５】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のトリ
フルミゾールを含む試料に、トリフルミゾール誘導体と
酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調
製する。

【００７６】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。

【００７７】（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量
線から試料中のトリフルミゾールの量を決定する。

【００７８】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００７９】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のトリフルミ
ゾール及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係
に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防
ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００８０】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、トリフルミゾール誘導体を酵素に結合する
方法であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、トリフルミゾ
ールを含む試料と混合する。

【００８１】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のトリフルミゾールと酵素
結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化
抗体との複合体が生成する。トリフルミゾールを含む試
料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけ
ではないが、反応は例えば室温でおよそ１時間行う。反
応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハ
プテンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用する
ことができる。

【００８２】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からトリフルミゾールの量を算出することが
できる。

【００８３】本発明のモノクローナル抗体ＴＦＺ６−１
２は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってトリフルミゾ
ールを０.０１−１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１−１
００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定するすることができる（実
施例８、図１）。モノクローナル抗体ＴＦＺ６−１２は
非常に特異性が高く、トリフルミゾールとのみ反応し、
他のアゾール系化合物であるジニコナゾール、イマザリ
ル、ジクロブトラゾールとは反応しない（実施例９ 図
２）。

【００８４】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００８５】

【実施例】実施例１ トリフルミゾール誘導体の合成

【化１５】

【００８６】５−（４−クロロ−２−トリフルオロメチ
ルアニリノカルボニル）ペンタン酸エチルエステル
（２）の合成 クロロホルム２５ｍｌにアジピン酸モノエチルエステル
（１）１７．４ｇ（０．１ｍｏｌ）および塩化チオニル
２０．５ｇ（０．１５ｍｏｌ）を加え、環流下に４時間
撹拌反応させた後、濃縮した。次にこの残渣をアセトン
５０ｍｌに溶解し、アセトン１５０ ｍｌ中の４−クロ
ロ−２−トリフルオロメチルアニリン １９．６ ｇ
（０．１ｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム９．０ｇ
（０．１１ｍｏｌ）の懸濁液に加え、環流下に２時間撹
拌反応させた。この反応混合物を濃縮後、トルエンで抽
出した。次にトルエン層を水洗後、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、濃縮した。残渣の固体にｎ−ヘキサンを加
え、濾過、乾燥し、２９．２ｇ（収率８３％）の５−
（４−クロロ−２−トリフルオロメチルアニリノカルボ
ニル）ペンタン酸エチルエステル（２）を得た。 融点：１１２−１１３℃

【００８７】５−（４−クロロ−２−トリフルオロメチ
ルアニリノカルボニル）ペンタン酸（３）の合成 エタノール ２００ｍｌに５−（４−クロロ−２−トリ
フルオロメチルアニリノカルボニル）ペンタン酸 エチ
ルエステル（２）１７．６ｇ（５０ｍｍｏｌ）を溶解し
た。この溶液に水８０ｍｌに溶かした水酸化ナトリウム
１０ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時間撹拌
反応させた。反応混合物を濃縮し、残渣を水２００ｍｌ
に溶解し、希塩酸でｐＨ６にした。析出した結晶を濾取
し、順に水、ヘキサンで洗浄した。これを乾燥させて、
１２．６ｇ（収率７８％）の５−（４−クロロ−２−ト
リフルオロメチルアニリノカルボニル）ペンタン酸
（３）を得た。 融点：１４３−１４５℃

【００８８】５−（４−クロロ−２−トリフルオロメチ
ルアニリノカルボニル）ペンタン酸ベンジルエステル
（４）の合成 クロロホルム５０ｍｌに５−（４−クロロ−２−トリフ
ルオロメチルアニリノカルボニル）ペンタン酸（３）
９．０ｇ（２８ｍｍｏｌ）および塩化チオニル６ｇ（５
０ｍｍｏｌ）を加え、環流下に２時間撹拌反応させた
後、濃縮した。次にこの残渣およびベンジルアルコール
３．３ｇ（２８ｍｍｏｌ）をトルエン１２０ｍｌに溶解
した。この溶液にトリエチルアミン３．３ｇ（２８ｍｍ
ｏｌ）を氷水冷却下、１０−２０℃で滴下し、室温下に
４時間撹拌反応させた。この反応混合物に１５０ｍｌの
酢酸エチルを加え、有機層を水洗後、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥し．濃縮した。残渣の固体にｎ−ヘキサンを
加え、濾過、乾燥し、６．８ｇ（収率 ５９％）の５−
（４−クロロ−２−トリフルオロメチルアニリノカルボ
ニル）ペンタン酸 ベンジルエステル（４）を得た。 融点：９４−９５℃

【００８９】６−（４−クロロ−２−トリフルオロメチ
ルフェニル）イミノ−６−（イミダゾール−１−イル）
ヘキサン酸 べンジルエステル（５）の合成 クロロホルム ６ｍｌに５−（４−クロロ−２−トリフ
ルオロメチルアニリノカルボニル）ぺンタン酸 ベンジ
ルエステル（４）２．３ｇ（５．６ｍｍｏｌ）および五
塩化リン１．３ｇ（６．３ｍｍｏｌ）を加え、環流下に
１時間撹拌反応させた後、濃縮した。次にこの残渣をク
ロロホルム４ｍｌに溶かし、この溶液にイミダゾール
０．４２ｇ（６．２ｍｍｏｌ）を加え、５０−６０℃で
３０分間撹拌した。これにトリエチルアミン０．６５ｇ
（６．４ｍｍｏｌ）を氷水冷却下、５−１０℃で加え、
５０−６０℃で３０分間撹拌した。この反応混合物にク
ロロホルム３０ｍｌを加え、クロロホルム層を水洗後、
無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エチル
＝３：２）で精製し、１．１ｇ（収率４２％）の６−
（４−クロロ−２−トリフルオロメチルフェニル）イミ
ノ−６−（イミダゾール−１−イル）ヘキサン酸ベンジ
ルエステル（５）を得た。

【００９０】６−（４−クロロ−２−トリフルオロメチ
ルフェニル）イミノ−６−（イミダゾール−１−イル）
ヘキサン酸（６）の合成 エタノール１０ｍｌに６−（４−クロロ−２−トリフル
オロメチルフェニル）イミノ−６−（イミダゾール−１
−イル）ヘキサン酸 ベンジルエステル（５）０．８ｇ
（１．７ｍｍｏｌ）および５０ｍｇの１０％パラジウム
カーボンを加え、この混合物に水素ガスを室温下、撹拌
しながら１５時間かけて吹き込んだ。この反応混合物を
濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグ
ラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エチル：メタノール＝１
０：１０：１）で精製し、０．３ｇ（収率４７％）の６
−（４−クロロ−２−トリフルオロメチルフェニル）イ
ミノ−６−（イミダゾール−１−イル）ヘキサン酸
（６）を得た。

【００９１】 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６，ｐｐｍ） １．６４（４Ｈ，ｍ） ２．２３（２Ｈ，ｔ） ２．６６（２Ｈ，ｔ） ６．８５（１Ｈ，ｄ） ７．１２（１Ｈ，ｓ） ７．５３（１Ｈ，ｄｄ） ７・６１（１Ｈ，ｓ） ７．６５（１Ｈ，ｄ） ８・２２（１Ｈ，ｓ） ＭＳ ｍ／ｚ：３７３

【００９２】実施例２ 免疫用抗原の作製 免疫原としてトリフルミゾール誘導体とＫＬＨとの結合
体を以下のように混合酸無水物法により作製した。

【００９３】実施例１によって作製されたトリフルミゾ
ール誘導体の７ｍｇを無水ジオキサン０．７ｍｌに溶解
し、１０−１２℃に冷却した後、トリ−Ｎ−ブチルアミ
ン４μｌおよびクロロ蟻酸イソブチル２.４μｌを添加
し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した（以下これを
「Ａ液」という）。

【００９４】一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶
解し、０．５％ＮａＨＣ０₃、ｐＨ９．４を外液として
一晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心し
得られた上清１．５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。４
℃にて２時間反応させた後、スパーテル１杯のグリシン
を添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することにより
反応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣｌ
−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１週間透析して
免疫用抗原を得た。このようにして得られたトリフルミ
ゾール−ＫＬＨ結合体を免疫用抗原として用いた。

【００９５】実施例３ スクリーニング用抗原の作製 スクリーニング用抗原として実施例２と同様の方法によ
りトリフルミゾール誘導体−ＢＳＡ結合体を得た。

【００９６】実施例４ 免疫感作 免疫用抗原として実施例２において得られたトリフルミ
ゾール誘導体−ＫＬＨ結合体について、それぞれマウス
に免疫を行った。免疫用抗原１００μｇをＰＢＳ １０
０μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと
混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。１７日後
にフロイント不完全アジュバントを用いて調製した免疫
用抗原を、前記と同様の操作によりマウスに追加免疫を
行った。また、４１日後にはＰＢＳに溶解した免疫用抗
原をマウスに追加免疫した。

【００９７】実施例５ 抗血清による測定 トリフルミゾール誘導体−ＢＳＡ結合体の溶液（０．１
μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレー
トにコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロ
ックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」：大日本製薬、コ
ードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキングした後、抗血
清希釈液と各種濃度のトリフルミゾールあるいはその類
似化合物を含む１０％メタノール溶液とを等量混合し、
その１００μｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応
させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓにて１回洗浄の後、ＰＢＳを用いて５０００倍希釈し
たペルオキシターゼ結合抗マウス−ＩｇＧヤギ抗体（Ｃ
ａｐｐｅｌ社製）を５０μｌずつ各ウェルに添加し、３
７℃にて１時間反応させた。さらに反応終了後、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて２回洗浄し、０．４ｍ
ｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％の過酸化水素を含む
０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１０
０μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間放置し、発
色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加
え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。

【００９８】実施例６ ハイブリドーマ細胞の作製 実施例４に続き、血清中の抗トリフルミゾール抗体の活
性が高くなったマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細
胞（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞融合を行った。
細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方法で
トリフルミゾールに対する抗体活性を調べた。トリフル
ミゾール誘導体−ＢＳＡ結合体の溶液（０．１μｇ／ｍ
ｌ）を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコー
ティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエー
スでブロッキングした後、培養上清液と各種濃度のトリ
フルミゾールあるいはその類似化合物を含む１０％メタ
ノール溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに
入れ、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１回洗浄の後、ＰＢ
Ｓを用いて、５０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合
抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μ
ｌずつ各ウェルにて３７℃で１時間反応させた。さらに
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて２
回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４
％の過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液
（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ、室温
にて２０分間放置し発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１０
０μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０
ｎｍの吸光度を測定し、特異性のある抗体活性が認めら
れたものを選抜した。

【００９９】次に、選抜されたウェルの細胞について限
界希釈法を用いた細胞クローニングを行った。その結
果、抗トリフルミゾール抗体を産生するハイブリドーマ
細胞株をクローン化した。そのうちのＴＦＺ６−１２を
平成９年２月４日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０５８
として工業技術院生命工学技術研究所（〒３０５ 茨城
県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１００】実施例７ トルフルミゾール誘導体とＨＲ
Ｐとの結合体の作製 実施例２と同様な混合無水物法により実施例１で作製し
たトリフルミゾール誘導体とＨＲＰの結合体を作製し
た。１ｍｇのトリフルミゾール誘導体を無水ジオキサン
０．２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン０．
５μｌ、クロロ蟻酸イソブチル０．３μｌを添加し、１
０−１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、これを「Ｂ
液」とする） 一方、０．５％ＮａＨＣ０₃をＮａＯＨでｐＨ９．４に
調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを溶解し、Ｂ液をこ
の中に滴下した。４℃にて２時間撹拌し、さらにグリシ
ンを添加して３０分間撹拌することにより反応を終了さ
せた。反応物をＰＢＳにて透析することにより、精製Ｈ
ＲＰ結合トリフルミゾール誘導体を得た。

【０１０１】実施例８ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るトリフルミゾールの測定 実施例６で得られたハイブリドーマ細胞（ＴＦＺ６−１
２）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られ
た腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体
を分取し、以下の試験法にてトリフルミゾールを測定し
た。

【０１０２】それぞれのモノクローナル抗体溶液（５μ
ｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレート
に加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブロック
エースでブロッキングした後、トリフルミゾール及び実
施例７で作製した適度に希釈されたＨＲＰ結合トリフル
ミゾール誘導体を含む１０％メタノール−ＰＢＳ溶液を
５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間静置した。反
応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて２回
洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％
過酸化水素含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ
４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０
分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌ
を各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの
吸光度を測定した。その結果を図１に示す。直接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法においても、トリフルミゾールを測定す
ることができ、その測定範囲は０．１−１００ｎｇ／ｍ
ｌであった。

【０１０３】実施例９ モノクローナル抗体の評価 トリフルミゾール誘導体に由来する、クローン化したハ
イブリドーマＴＦＺ６−１２の産生するモノクローナル
抗体ＴＦＺ６−１２について実施例８と同様の方法を用
いてトリフルミゾールおよび他の類似するアゾール系化
合物に対する反応性について調べた。この結果を図２に
示す。図２より、この抗体は非常に特異性が高く、トリ
フルミゾールとのみ反応し、他の類似するアゾール系化
合物であるジニコナゾール、イマザリル、ジクロブトラ
ゾールとは反応しない。モノクローナル抗体ＴＦＺ６−
１２は直接競合ＥＬＩＳＡ法でトリフルミゾールの量を
０．１−１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体ＴＦＺ６
−１２の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるトリフルミゾ
ールの測定を示す。

【図２】図２は、モノクローナル抗体ＴＦＺ６−１２の
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるトリフルミゾールおよ
び他の類似するアゾール系化合物の測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 谷口 佳隆 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07D 233/61 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、ｎは１−１０の整数である］で表される
   構造を有する化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物又
   は標識物質との結合体。
3. 【請求項３】請求項１に記載の化合物と高分子化合物を
   結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いる
   ことにより、以下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
4. 【請求項４】請求項２に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物と反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
   載の抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】ＴＦＺ６−１２である、請求項４又は５に
   記載の抗体又はそのフラグメント。
7. 【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体又はそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０５８で寄託
   されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
9. 【請求項９】請求項１に記載された化合物、及び／又は
   請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体又はその
   フラグメントを用いることを特徴とする、式（２）で表
   される化合物の免疫学的測定方法。