UA76708C2 - Антитіло, яке застосовується в імунологічному аналізі зразка для визначення неонікотиноїдного інсектициду, білковий кон'югат для одержання антитіла, спосіб визначення концентрації неонікотиноїдного інсектициду в зразку та набір для визначення кількості неонікотиноїдного інсектициду - Google Patents

Abstract

Винахід належить до антинеонікотиноїдних антитіл, які застосовуються в імунологічному аналізі зразка для визначення кількості неонікотиноїдного інсектициду, нової сполуки класу неонікотиноїдних інсектицидів, білкового кон’югату, за допомогою якого одержують дані антитіла. Білковий кон’югат являє собою гаптен, яким є неонікотиноїдний інсектицид, з'єднаний з залишком імуногенного білка-переносника. Винахід належить також до способу визначення концентрації неонікотиноїдного інсектициду в зразку та набору для визначення кількості неонікотиноїдного інсектициду при імунологічному аналізі зразка.  

Description

сі СІ (в) (в) г й З ів; Г- г З о

КА она Й КИ ен пут он Мо МН-А-Р і й 5. Сполука за п.4 формули 10. Білковий кон'югат за п. 8 формули "7 МО, СІ М

Х Побеч; с А Мт сон й рен

М що Мо МН--РВ 6. Сполука за п.3 формули | І сі М о І

А. о 11. Спосіб визначення концентрації неонікотиноїд-

ХХ М М. (СНІ 4 ного інсектициду в зразку, який включає етапи:

Вій " (а) забезпечення твердої фази з іммобілізованим

Мод он антитілом, селективним до згаданого неонікотино- їдного інсектициду за пунктом 1 або 2;

Гой (б) контакт згаданого зразка з іммобілізованим й антитілом у присутності відомої кількості кон'югата 7. Сполука за п.б формули гаптену, яким є неонікотиноїдний інсектицид, з м7о ферментом за будь-яким з пунктів 8-10;

АЖ (в) промивання твердої фази етапу (б) для вида-

Дт Мт бо лення будь-якого незв'язаного кон'югата гаптену з 2 ферментом або зразка;

СІ м (г) взаємодія хромогенного субстрату, специфічно- . го до згаданого кон'югата гаптену з ферментом, із 8. Білковий кон'югат формули промитою твердою фазою етапу (в) для того, щоб

Кв генерувати хромоген; і

Ї о (д) вимірювання кількості хромогену, утвореного

А М М сн (І) на етапі (г), щоб визначити кількість зв'язаного ту п ( з) І антитіла з кон'югатом гаптену з ферментом і звід- вз Х МА-РК си - кількість неонікотиноїдного інсектициду в зга- даному зразку. де 12. Спосіб за п.11, де згаданий зразок одержують

А означає 2-хлоропірид-5-ил або 2-хлоротіазол-5- екстракцією рослинного відтворюваного матеріалу іл; у відповідний розчинник.

АЗ означає водень або (Сі-Са)алкіл; 13. Спосіб за п.12, де згаданим рослинним відтво-

В! ї В2 незалежно один від одного означають во- рюваним матеріалом є насіння. день або (С1-Са)алкіл, або 14. Спосіб за п.13, де згадане насіння вибирають

В! ї 2? разом з атомами азоту, до яких вони приє- із групи, яка складається з рапсу, сорго, пшениці, днані, утворюють імідазолідинове або оксадіази- бавовни, польової кукурудзи або цукрової кукуру- нове кільце; двзи. п означає ціле число 1-4; 15. Спосіб за п.11, де згаданим антитілом є полік-

Х означає -М-МО» або -М-СМ; і лональне антитіло, одержане імунізацією тварини

РЕ означає залишок білка молекули-переносника, з неонікотиноїдним інсектицидом, кон'югованим з вибраний із групи, яка складається з очищеного імуногенним білком-переносником. білкового похідного (РРО, туберкуліну) з вірусу 16. Спосіб за п.15, де згаданим білком-

ОіршШегіа, бичачого сироваткового альбуміну, каті- переносником є молекула-переносник, вибрана з онованого бичачого сироваткового альбуміну, групи, яка складається з очищеного похідного біл- людського сироваткового альбуміну, овальбуміну і ка (РРО, туберкуліну) з вірусу Оірілегіа, бичачого гемоціаніну з молюска Медаїпига сгепшайа; сироваткового альбуміну, катіонованого бичачого або залишок ферменту, вибраний із групи, яка сироваткового альбуміну, людського сироватково- складається з лужної фосфатази, пероксидази го альбуміну, овальбуміну і гемоціаніну з молюска хрону і В галактозидази, Медаїпига сгепшага. 9. Білковий кон'югат за п.8 формули 17. Набір для визначення кількості неонікотиноїд- ного інсектициду при імунологічному аналізі зраз- ка, де набір включає в сполученні в одному або декількох контейнерах:

(а) тверду фазу з іммобілізованим антитілом, се- тиноїдним інсектицидом, кон'югованим з імуноген- лективним у відношенні згаданого неонікотиноїд- ним білком-переносником. ного інсектициду за пунктом 1 або 2; 19. Набір за п.18, де ферментом є пероксидаза (б) ферментний кон'югат, який містить фермент, хрону. кон'югований з неонікотиноїдним гаптеном за 20. Набір за п.17, де антитіло специфічно зв'язу- будь-яким з пунктів 8-10. ється з неонікотиноїдним інсектицидом, вибраним 18. Набір за п.17, де антитілом є поліклональне із групи, яка складається з імідаклоприду, нітен- антитіло, одержане імунізацією тварини з неоніко- піраму, ацетаміприду, тіаметоксаму, тіаклоприду і клотіадину.

Даний винахід стосується імунологічних аналі- газо-рідинна або високоефективна рідинна хрома- зів пестицидів та антитіл і реагентів для проведен- тографія (ВЕРХ). Обидві хроматографічні методи- ня таких аналізів. Крім того, винахід стосується ки вимагають дорогого устаткування, яке дорого способів здійснення таких аналізів і наборів, які обслуговувати і на якому повинні працювати фахі- містять реагенти для застосування на практиці вці високої кваліфікації. Виробничі об'єкти для об- таких способів. Винахід має специфічне застосу- робки насіння та виробники сільськогосподарської вання для визначення та кількісної оцінки неоніко- продукції звичайно не мають такого устаткування тиноїдних інсектицидів у зразку. або кадрового складу, тому насіння повинно відп-

Інсектициди равлятися в зовнішні аналітичні лабораторії. Якщо

Застосування інсектицидів для контролю ко- зразки аналізуються такими лабораторіями на мах-шкідників у сільськогосподарських культурах є основі швидкої оборотності, виробничий об'єкт, універсальною практикою. Дана практика досягла який обробляє насіння, може одержувати аналіти- високого ступеня комерційного успіху, оскільки чні дані приблизно через двадцять чотири години було показано, що такий контроль може підвищити після відправлення. Сповільнені аналізи приво- врожайність. Однак ефективне застосування інсе- дять до більш тривалих перерв у роботі. Ці перер- ктицидів вимагає правильної організації з погляду ви приводять до незайнятого машинного часу в стійкості комах і торкається впливу на навколишнє об'єктах, які піддають обробці. Затримки у відпра- середовище і працівника. Одним з рішень, які за- вленні обробленого насіння також неминучі. стосовуються для вирішення цієї проблеми, було У цій галузі існує нагальна потреба удоскона- забезпечення нових, більш активних інсектицидів, лити існуючі методики вимірювання, щоб зробити щоб зменшити необхідність у більш старих, висо- їх менш дорогими, більш ефективними та більш котоксичних інсектицидах та знизити навантажен- легко здійснюваними. Необхідні способи також ня на навколишнє середовище. повинні бути застосовні за межами лабораторії, у

Одним новим класом інсектицидів, які одер- польових умовах, так щоб вони могли швидко і жали значне визнання на ринку, є, так звані, «не- вірогідно забезпечити персонал, який обробляє онікотиноїдні» інсектициди. Сполуки даного класу рослину або насіння, інформацією про наявність включають, наприклад, імідаклоприд, ацетаміприд та концентрації даного інсектициду в зразку насін- ї тіаметоксам, які описані в (патентах 5 ня. У цьому відношенні важливо, щоб способи до- мМе4742060 і Ме5304566 і в ЕР580О55ЗАЗ2І, відповід- зволяли диференціювати пестицидний матеріал но. від інших продуктів, роблячи можливим кількісне

Пряма обробка рослинних відтворюваних ма- визначення потрібного активного інгредієнта, який теріалів (таких, як насіння) інсектицидами є цільо- присутній у насінні Однак усе ще залишається вим застосуванням, яке спрямовано на необхід- багато серйозних обмежень, які властиві класич- ність зниження впливу на навколишнє середовище ним аналітичним методам. Деякі з цих обмежень і працівника і накопиченої стійкості комах при на- можна було б подолати шляхом використання ме- несенні окремо або в сполученні з нанесенням тодики імунологічного аналізу. інсектицидів на листя і борозну. Однак необхідно Імунологічні аналізи та визначення пестицидів звернути увагу, що апарат для покриття насіння Створені спочатку для використання в меди- калібрований належним чином для того, щоб інсе- цині і ветеринарії, імунологічні аналізи почали зна- ктицид рівномірно наносився на насінний матеріал ходити все більше застосування в сільськогоспо- з метою уникнути, окрім інших, проблеми ефекти- дарській галузі. Наприклад, доступні імунологічні вності дії інсектицидів і фітотоксичності насіння. аналізи для визначення і кількісної оцінки хвороб

Можна використовувати аналітичні вимірювання, сільськогосподарських культур, афлатоксинів та щоб визначити, чи працює належним чином устат- деяких антибіотиків. Незважаючи на те, що імуно- кування для покриття насіння, якщо воно калібро- логічні аналізи для визначення пестицидів описані вано правильно, і чи може оброблена маса насін- в науковій літературі (дивись нижче), вони стали ня бути випущена для поставки. Однак традиційні доступні на комерційній основі лише протягом способи визначення залишків інсектицидів на на- останнього десятиліття. сіннях надзвичайно тривалі і вимагають великих Імунологічні аналізи грунтуються на високос- витрат, оскільки вони вимагають високоспеціалі- пецифічних антитілах і відносно простих аналітич- зованих та дорогих аналітичних методик, таких, як них приладах для визначення і/або кількісної оцін-

ки великої розмаїтості матеріалів-мішеней. Антиті- Спосіб із застосуванням «міченого антитіла» у ло, а не прилад або умови роботи, забезпечує звичайному застосуванні означає твердофазний аналітичну специфічність. Отже, імунологічні ана- імуноферментний аналіз (ЕГІЗА). У даному випад- лізи можуть проводитися на відносно неочищених ку білковий кон'югат пестициду (що називається зразках. Більш того, імунологічні способи були антигеном «з покриттям» або «скринінговим» ан- оптимізовані для застосування у віддаленому, не тигеном) одержують, використовуючи білок, який лабораторному оточенні, що допускає їх викорис- не є структурно споріднений до білка-переносника, тання в полі так само, як і в спеціалізованій лабо- що застосовують в пестицидному імуногені, проти раторії. якого вироблялися антипестицидні антитіла. Кон'-

Відомі імунологічні способи для визначення югат антигену з покриттям іммобілізують на твер- деяких гербіцидів, включаючи 2,А- дофазній основі, такій, як лунка мікропланшета, дихлорфеноксіоцтову кислоту (Ріеекег У., У. А55об. що приводить до фіксованого на твердій фазі кіль-

ОН. АпаІ. Спет. 70:874-878 (1986)), хлорсуль- кості пестициду на реакцію. Поряд з досліджува- фурон ІКеїеу М. і ін., у. Адгісє. Роса Спет. 33:962- ним зразком додають відому кількість антитіла. 965 (1985)), галоацетаміди (УМіпгепригдег Р.А. і ін., Іммобілізований пестицид конкурує з вільним пес-

Еигореап Раїепі Рибіїсайоп ЕР 340198, 19891 і ба- тицидом у дослідному зразку за обмежену кіль- гато пестицидів, включаючи дифлубензурон (ММе кість ділянок зв'язування антитіл. Взаємодія між

З.І. і ін., У. Адгіс. Роса Спет. 30:949-957 (1982)|, антитілом і речовиною, яку визначають при аналі- металаксил Мемузоте МУ.Н., 9. Адгіс. Роса Спет. зі, в рідкій фазі пригнічує зв'язування антитіла з 33:528-530 (1985)) і паратіон (Егсеюомісп СО. і ін., іммобілізованим на твердій фазі пестицидом. Ан-

У. Адгісє. Роса Спет. 29:559-563 (1981)). Описаний титіло, зв'язане з твердою фазою, визначають за також спосіб для імунологічного визначення атра- допомогою другого антитіла, специфічного до не- зину (патент 5 Ме45307861|. Відомі також імуноло- змінної ділянки важкого ланцюга антипестицидно- гічні аналізи для ціаназину, диклофоп-метилу, пе- го антитіла. Багато пов'язаних з ферментом других нтахлорфенолу, 2,4,5-Т і тербутрину. антитіл комерційно доступні для такого застосу-

В усіх згаданих вище імунологічних способах вання. Після відмивання незв'язаного другого ан- використовували поліклональні антисироватки, які титіла іммобілізоване друге антитіло звичайно одержували від тварин-хазяїнів (звичайно від кро- визначають додаванням хромогенного субстрату ликів), імунізованих відповідним антигеном (імуно- ферменту, що приводить до забарвленого продук- геном). Зовсім недавно розкриті моноклональні ту реакції, який утворений в прямій пропорції до антитіла (тАбБ5), специфічні до атразину, його по- кількості другого зв'язаного антитіла. Таким чином, хідних та продуктів розпаду, і використання таких кількість продукту реакції обернено пропорційно тАр5 в імунологічних аналізах (Зсіпаеррі і ін., кількості аналізованої речовини в досліджуваному

Ешигореап Раїепі Рибіїсайоп ЕР 365818(1990))|. зразку.

Через свою низьку молекулярну масу інсекти- Модифікація способу «міченого антитіла» ви- циди не є імуногенними і не викликають утворення ключає застосування антигену з покриттям. При специфічних антитіл у тварини-хазяїна. Отже, імуноферментному аналізі (ЕІА) антипестицидне створення імунологічного аналізу інсектицидів ви- антитіло іммобілізують на твердій фазі. Пестицид- магає багатьох стадій, починаючи зі створення ний гаптен ковалентно зв'язують з ферментом, і гаптенів, похідних інсектициду, які підтримують ферментний кон'югат, який утворюється, інкубують структурну специфічність молекули інсектициду й зі зразками в мікрокомірках або пробірках культи- у той же час допускають кон'югацію з білком- вування, покритих антипестицидним антитілом. «переносником», який має більш високу молеку- Пестицид у зразку конкурує з кон'югатом пестици- лярну масу. Крім того, для скрінингу антитіл при дного гаптену і ферменту за зв'язування з іммобі- здійсненні способу їх продукції можуть бути також лізованим антитілом. Тверду фазу промивають одержані додаткові гаптени, які за хімічною струк- для видалення незв'язаних матеріалів і кон'югат турою відрізняються від гаптену, який використо- антитіло-зв'язаний фермент визначають додаван- вується для імунізації тварин. Нарешті, як тільки ням хромогенного субстрату. Дивись, наприклад, препарат антитіла одержаний (чи поліклонально- ІВизпмау В.У., І.Р.Рекіпв, 5.А.бамаде, го, чи моноклонального), повинен бути створений 5ЗІ.Гекоиві, В.5.Регдизоп. 1988. ЮОеєїептіпайоп ої досить чутливий імунологічний аналіз. ашйаіпе гевідцез іп маг апа зої Бу епгуте

Основні концепції, які використовуються в су- іттипоаззау. Ви. Епмігоп. Сопіат. Тохісої!. часних імунологічних аналізах, описані в числен- 40:647-654; РіІвекКкег .В., І.М.Соок. 1991. Веїарійну них посиланнях |дивись, наприклад, Моїег А. і ін. ог соттегсіа! епгуте іттипоаззау іп дегесііп ої (ред.), Іттипоавззау5 Рог Тпе 805, Опімег5йу Рак, ашйаліпе іп мае» Р.78-85 у М.Мапаепапп, 1981; МоПег А., "пе Епгуте ГГ іпкей Іттипозогрепі Г.Н.еіапкег, В.Е.УМаїкіп5, О.М/Корегпі5 (ред.),

Авзау (ЕПІЗА)", Оіадповіїс Ногігопе 2:1-7, 1978, Іттипоаззауз їог Тгтасе СПпетіса! Апаїузіз. АС5

МісгоБіоіодіса! Аввосіаїєз Опцапепу Рибіїсайоп, Зутровішт бепез 451. Мазпіпдіюоп, О.С: Атепсап

УуаїКегемійе, ма; МоПег А. і ін., У. Сііп. Раїйої. Спетісаї! босієцу). 31:507-520 (1978); ВиШег 9.Е., Меїй. Епгутої. У сільськогосподарській галузі існує необхід- 73:482-523(1981); Маддіо БЕ. (ред.), Епгуте ність у способі аналізу насіння, обробленого акти-

Іттипоаззау, САС Ргезз, Воса ВНашюп, Ріа., 1980). вними інгредієнтами, такими, як інсектицид, який

При кожному підході істотним є побудова калібру- можна проводити в полі або всередині виробничо- вальних кривих з використанням відомих кількос- го приміщення для обробки насіння. тей потрібної аналізованої речовини.

Даний винахід забезпечує неонікотиноїдні гап- таких аналізів можна використовувати гетероген- тени та імуногени для вироблення антинеонікоти- ний або гомогенний режими і можна застосовувати ноїдних антитіл, а також способи, реагенти та на- планшети з мікрокомірками, пробірки для культи- бори для визначення наявності одного або вування і латексні кульки або частинки як тверді декількох неонікотиноїдних інсектицидів у зразку фази. за допомогою імунологічного аналізу. Даний вина- Імунологічні аналізи за даним винаходом за- хід має особливе застосування для визначення стосовують для визначення концентрації неоніко- концентрації неонікотиноїдних інсектицидів, нане- тиноїдних інсектицидів, таких, як імідаклоприд, сених на рослинні відтворювані матеріали, такі, як нітенпірам, ацетаміприд, тіаметоксам, тіаклоприд і насіння. клотіадин, у зразку, а також у рослинному відтво-

Спосіб імунологічного аналізу за винаходом рюваному матеріалі. дозволяє персоналу виробничих приміщень для Даний винахід забезпечує імунологічні аналізи обробки насіння, де неонікотиноїдні інсектициди для дослідження зразка на присутність неонікоти- наносять на насіння, кількісно вимірювати нанесе- ноїдних інсектицидів. У таких імунологічних аналі- ний активний інгредієнт. Спосіб включає швидку зах реакція неонікотиоїдного (антигену)/антитіла екстракцію активних інгредієнтів з насіння і швидке може бути визначена різноманітними способами, вимірювання екстракційнного розчину, яке грунту- які використовують різні маркери для введення ється на імунологічному аналізі. Дані вимірювання мітки або в антиген, або в антитіло, щоб уможли- можна використовувати, щоб визначити, чи пра- вити визначення продукту реакції. Більш того, у цює належним чином устаткування для покриття багатьох випадках іммобілізація або антигену, або насінин, якщо воно калібровано правильно, і чи антитіла буде сприяти визначенню. може оброблена маса насіння бути випущена для Аналізи антигену/антитіла можна розділити на постачання. Створюваний аналіз повинний бути дві категорій: гетерогенну і гомогенну. Гетерогенні простим у здійсненні, що вимагає лише звичайного аналізи перед визначенням продукту реакції пот- лабораторного устаткування і реагентів. Тому пер- ребують відділення компонента зі зв'язаною міт- сонал, позбавлений досвіду проведення імунологі- кою від компонента з вільною міткою. При гомо- чних аналізів, зможе успішно проводити дослі- генному аналізі такий етап відділення не потрібно. дження після декількох практичних експериментів. Крім того, аналізи можуть бути (1) конкурентними,

Було знайдено, що антигенні неонікотиноїдні наприклад, якщо антиген конкурує за мічене анти- кон'югати (імуногени) можуть бути одержані кон'ю- тіло з антигеном, іммобілізованим на твердій фазі, гацією неонікотиноїдного пестицидного гаптену з або якщо антиген конкурує з міченим антигеном за молекулою-переносником, такою, як очищене біл- антитіло, іммобілізоване на твердій фазі, або (2) кове похідне (РРО, туберкулін) з вірусу Оіріпега, неконкурентними, якщо існує пряма взаємозалеж- бичачий сироватковий альбумін, людський сиро- ність між міткою і антитілом або антигеном. ватковий альбумін, овальбумін, або кон'югацією Способи імунологічного аналізу, які можуть за- гемоціаніну з молюска Кеупоїє Гітреї (Медаїпига стосовуватися на практиці за даним винаходом степшіага) з неонікотиноїдним гаптеном. Можуть для визначення неонікотиноїдних інсектицидів у бути одержані кон'югати перетворених у похідні зразку, включають ферментний, флуоресцентний, матеріалів, таких, як похідне бичачого сироватко- хемілюмінесцентний і біосенсорний імунологічний вого альбуміну, катіонований бичачий сироватко- аналіз, а також радіоімунологічний аналіз. У твер- вий альбумін тощо. Дивись (А. МисКегпеїае, В. дофазному ферментному імунологічному аналізі

Арріє, А. Резсе, 9.0. Міснає! (1987) 9У.Іттипо). (ЕСІЗА) за даним винаходом гаптени, які відпові- 138:833-837|. Дані імуногени потім можуть бути дають неонікотиноїдним інсектицидам, що пред- ін'єковані тваринам-хазяям, які виробляють анти- ставляють інтерес, можна мітити безпосередньо з тіла до неонікотиноїдного гаптену, які можна зібра- ферментом або непрямим способом з викорис- ти. Потім ці антитіла можуть бути утилізовані в танням мічених за ферментом антитіл, які при від- різноманітних методиках імунологічного аналізу повідних умовах каталізують реакцію із субстра- для визначення відповідних неонікотиноїдних інсе- том. Ферментну активність звичайно визначають ктицидів з використанням різних відомих маркерів, за допомогою утворення забарвленого продукту щоб позначити або інсектицид, або антитіло. У реакції, тобто, забарвленої кінцевої точки, що мо- деяких варіантах втілення імунологічних аналізів же бути легко виявлена візуально або виміряна іммобілізують або похідне неонікотиноїдного інсек- спектроскопічними або відбивальними способами. тициду, або антитіло. Як поліклональні, так і моно- У методиках флуоресцентного імунологічного клональні антитіла можуть застосовуватися в аналізу для застосування за даним винаходом практиці за даним винаходом. Антитіла можуть гаптени, що відповідають неонікотиноїдним інсек- виявитися селективно зв'язаними з потрібними тицидам, що представляють інтерес, можна мітити неонікотиноїдними інсектицидами навіть у присут- безпосередньо з флуорохромами або непрямим ності інших активних пестицидних інгредієнтів, способом з використанням мічених за флуорохро- включаючи інші неонікотиноїдні інсектициди, вве- мом антитіл. Флуорохроми представляють собою дені в суміш для покриття насіння. барвники, які поглинають випромінювання (напри-

Способи визначення, які можуть застосовува- клад, ультрафіолетове світло), при цьому збуджу- тися на практиці за даним винаходом для вимірю- ються і випромінюють світло (наприклад, видиме вання неонікотиноїдних інсектицидів у зразку, світло). включають біодатчики і ферментні, флуоресцент- ні, хемілюмінесцентні і радіометричні системи. Для

В одному варіанті втілення за даним винахо- Як відзначено вище, імунологічний аналіз за дом спосіб визначення концентрації неонікотиної- даним винаходом має особливе застосування для дного інсектициду в зразку складається з етапів: визначення кількості неонікотиноїдного інсектици- (а) забезпечення твердої фази з іммобілізова- ду, який нанесений на рослинний відтворюваний ним антитілом, селективним до згаданого неоніко- матеріал. Мається на увазі, що термін «рослинний тиноїдного інсектициду; відтворюваний матеріал» означає всі генеративні (б) контакт згаданого зразка з іммобілізованим частини рослини, такі, як насіння, які можна вико- антитілом у присутності відомої кількості кон'югата ристовувати для розмноження останньої, і вегета- неонікотиноїдний інсектицидний гаптен-фермент; тивний рослинний матеріал, такий, як обрізки і (в) промивання твердої фази етапу (б) для ви- бульби (наприклад, картоплі). Можна згадати, на- далення будь-якого незв'язаного гаптен- приклад, насіння (у строгому розумінні слова), ко- ферментного кон'югата або зразка; рені, плоди, бульби, цибулини, кореневища і час- (г) взаємодія хромогенного субстрату, специ- тини рослин. Можна також згадати пророслі фічного до згаданого гаптен-ферментного кон'юга- рослини і молоді рослини, що повинні бути пере- ту, із промитою твердою фазою етапу (в) для того, саджені після проростання або після появи над щоб генерувати хромоген; і грунтом. Ці молоді рослини можна захистити пе- (д) вимірювання кількості хромогену, одержа- ред пересадженням за допомогою повної або час- ного на етапі (г), для визначення кількості кон'юга- ткової обробки шляхом занурення. та антитіло-зв'язаний гаптен-фермент і, отже, кіль- В одному варіанті втілення неонікотиноїдний кості неонікотиноїдного інсектициду в згаданому інсектицид, який визначається аналізом за даним зразку. винаходом, представлений формулою

В одному варіанті втілення винаходу імуноло- я у гічний аналіз забезпечується у вигляді набору, І І який включає покриті антитілом пробірки, кон'югат М неонікотиноїдний гаптен-фермент, субстрат фер- ут й е () менту і розчин для припинення утворення колори- в? Х метричного сигналу.

Незважаючи на те, що в описі винаходу часто де А означає 2-хлорпірид-5-ил або 2- згадується застосування поліклональних антитіл, хлортіазол-Б5-іл; фахівці в цій галузі зрозуміють, що моноклональні В і 83 незалежно один від одного означають антитіла могли бути використані як альтернатива водень або (Сі-Сдалкіл; до застосування поліклональних антитіл. Термін В'ї 2 незалежно один від одного означають «антитіла», який використовується у контексті, за водень або (Сі-Сг)алкіл, або походженням стосується поліклональних або мо- В! і В разом з атомами азоту, до яких вони ноклональнихантитіл. , . приєднані, утворюють імідазолідинове або оксаді-

Моноклональні антитіла до неонікотиноїдних азинове кільце; і інсектицидів для застосування в практиці за даним Х означає -М-МО» або -М-СМ. винаходом одержують, використовуючи методики В іншому варіанті втілення неонікотиноїдний імунізації! та культивування гібридом, добре відомі інсектицид, який визначається аналізом за даним фахівцям. Відповідні лінії клітин гібридоми одер- винаходом, представлений формулою жують злиттям клітини, яка продукує антитіло, і мієломної клітини, одержаної з мишиних видів.

Клітинами, які продукують антитіла, переважно є М 5 клітини селезінки. Може бути використана будь- й й (1) яка відповідна мієломна клітинна лінія, однак ба- в у жано застосовувати добре охарактеризовані лінії клітин, деякі з яких звичайно застосовуються. де А, ВЗ і Х мають наведені вище значення

Подібним чином поліклональні антитіла до не- для формули (1). онікотиноїдних інсектицидів для застосування в У переважному варіанті втілення імунологіч- практиці за даним винаходом також одержують, ний аналіз за даним винаходом використовує полі- використовуючи методики, добре відомі фахівцям. клональні антитіла для неонікотиноїдного інсекти-

Даний винахід забезпечує також препарат по- циду. Ці антитіла можуть бути одержані із ліклонального антитіла до дос (імуноглобуліну б), сироватки імунізованої тварини. Імунізація може який зв'язує принаймні один неонікотиноїдний ін- бути здійснена шляхом ін'єкції імуногену (антиген- сектицид, препарат антитіла одержують способом, ний кон'югат гаптен-РРО) видам тварин, які проду- який складається з етапів: (а) введення хазяїну кують антитіла, звичайно ссавцю і переважно кро- попередньо визначеної кількості композиції, що лику або вівці. Як правило, початкова ін'єкція включає неонікотиноїдний інсектицид або імуноло- супроводжується серією послідовних бустерних гічний еквівалент, з'єднаний з біологічно прийнят- ін'єкцій, щоб викликати максимальне утворення ним білком-переносником, (б) збирання сироватки антитіл. Оптимально режим введення складається хазяїна і (в) очищення антитіла до Ідс від сироват- з багаторазових доз, які вводяться білим кроликам ки. Імунологічний еквівалент антигену має здат- породи Мем 7еаіапа. Кількість імуногену, яка вво- ність при введенні хазяїну викликати вироблення диться ін'єкцією, змінюється, але повинна бути антитіл до антигену. адекватною до вироблення кількості антитіл, що визначається. Одержання антитіл може бути підт-

верджено аналізом сироватки, одержаної в дослі- В' ї 22 незалежно один від одного означають дних пробах, із застосуванням ЕЇІА, ЕГІЗА або не- водень або (Сі1-Са)алкіл, або прямого флуоресцентного імунологічного аналізу. В! ї БВ? разом з атомами азоту, до яких вони

Ті ж самі мітки, які використовують у відомих приєднані, утворюють імідазолідинове або оксаді- імунометричних аналізах, можуть застосовуватися азинове кільце; п означає ціле число 1-5 (перева- для мічення гаптену за даним винаходом. Серед жно ціле число 3-5); і Х означає О, -М-МО» або -М- них можна згадати репортерні молекули (ЕМ), які СМ. включають ферменти, такі, як лужна фосфатаза, Гаптен (ІВ) пероксидаза хрону і р-галактозидаза. Крім того, І: ще) можуть бути використані флуоресцентні, люмінес- центні або радіоактивні мітки, такі, як флуоресце- А Мом он (ІВ)

Тн, родамін, люмінол, акридій і радіоактивні ізотопи т Мій і25| і т.д., або колоїдні частинки, такі, як золото і ох селен і т.д. Нарешті, флуорофори лантанідів, які де А, В", В2, ВЗ і Х мають значення, як у фор- утворюють хелати, таких, як європій і тербій, мож- мулі (ІА); і на використовувати для понерувения авбільш роз. Е означає одинарний ковалентний зв'язок або за часом флуоресцентних сигналів. Найбільш роз- залишок зв'язувальної групи формули -(СНг)т-, У повсюдженими ферментними маркерами є перок- не : сидаза хрону (НЕР) і а фосфатаза якій т означає ціле число 1-3. ид хрону ( 7) і лужн фосфатаза. й Приклад 1: гаптен (ША)

В одному варіанті втілення для визначення кі- о лькості неонікотиноїду в зразку використовують А спектрофотометр. Однак способи за даним вина- сн он ходом можуть бути адаптовані фахівцями в цій й галузі до інших типів хромогенних детекторів. По- (ША) дібним чином продукт реакції, що визначається, не А М З обмежений наявністю хромофора, а може містити т Мій інші мітки, як описано вище. фо х

Було знайдено, що гаптени наступних формул де А, КЗ, Х і п мають значення, як у формулі (ІА), (ІВ) ї (ПА) застосовні для утворення антиген- (ІА) них неонікотиноїдних кон'югатів (імуногенів) і ана- Гаптен (ПІВ) лізованих кон'югатів.

Гаптен (ІА) о я в

ІІ о Бай

А М М ве че- (А) "в

А Я 8 ех я т вх де . .

А означає 2-хлорпірид-5-ил або 2-хлортіазол- де А, ЕЗ і Х мають значення, як у формулі (ІА), 5Б-іл: і Е має значення, як у формулі (ІВ).

ВЗ означає водень або (Сі-Сдалкіл; Гаптени формул (ША) і (ПІВ) можуть бути оде- ржані за аналогією з наступними методиками: со " ОМе ДОМе Кі с йгй ой со;н несасномно М Моск -- сон у, піс)

Похідне (Мі-ціаної бо Заміщений -амі :; -ціаноїмідо)карбонат "'аміноетантіолу д щи 2-(М-ціаноіміно)- «с , Ж касоз А К , тіазолідин -- - - -ьух

А СІ но й

М в

Потрібний гаптен (ША) або (ІВ) одержують, або використовуючи відповідне похідне 2- нзаснен.нн, аміноетантіолу, вибране із сполук формул ; й Е (ПЕ) сн сов

Ї чі, (Шо) со де К має значення, наведене вище, для фор- ги мули (0).

Було знайдено, що наступні гаптени особливо т ев корисні в практиці за даним винаходом: І І о в г В БИ ву (1)

Бій тек в (сна в сні т х Мн-л

Мо он Мод он

ТЯ , о , де А, Б, Р-, ВУ, п і Х мають значення, наведені о вище для формули (ІА), і РЕ означає залишок біл- сом І (сна 7 --в в ка: (1) молекули-переносника, такої, як очищене

Пе он но ЯК ин М (в) похідне білка (РРО, туберкулін) з вірусу Оіріпепла, д кн я чена бичачий сироватковий альбумін, людський сиро- й Мо он ватковий альбумін, овальбумін або гемоціанін з 4 ; я молюска Кеупоїе І ітреї у випадку імуногена, або де п у кожному випадку означає ціле число 1- (2) репортерної молекули (КМ), такої, як лужна 5; переважно п означає ціле число 3-5. фосфатаза, пероксидаза хрону і р-галактозидаза.

Антигенні неонікотиноїдні кон'югати (імуноге- Крім того, гаптенові кон'югати наступної фор- ни) і аналізовані кон'югати можуть бути одержані мули також є прийнятними: з'єднанням неонікотиноїдного пестицидного гапте- ЕЕ в Е о ну з переносником або репортерною молекулою І І залежно від обставини, використовуючи методики, А М. им Мн- т (ПА) відомі фахівцям у цій галузі. Два основних підходи т М можуть бути вибрані. Перший використовує лінке- В х ри, які стають частиною кон'югата. Дані лінкери є гомобіфункціональними або гетеробіфункціональ- де А, Р, В, ВУ, Е і Х мають значення, наведе- ними і включають ті, які здатні утворювати, напри- ні вище для формули (ІВ). клад, дисульфідні зв'язки з тіольними групами за- Було показано, що наступні кон'югати особли- лишків цистеїну в білкових субстратах або во корисні в практиці за даним винаходом: утворювати амідні зв'язки між М-кінцевою аміног- дж "з рупою або аміногрупами в бокових ланцюгах або в ов ий ой юр -й залишках лізину, і активовані ацильні залишки, й а 7 нер такі, як сукцинімідні складні ефіри. Загалом, даний т. підхід включає наявність у лінкера функціональних 5 " груп з високою реакційною здатністю і є досить шк же. ЕЕ . . . ш- зи хх ре ДКЗ МН, х легким у відношенні субстратів для кон'югації. Од- І ОО о тп А т-т- тА нак у багатьох випадках вигідно використовувати скит юрій Її, у функціональні групи, які можуть бути менш реак- ну нене А ційноздатними, такі, як ті, які здатні утворити гід- ХУ й ЩЕ ; разони. «

Другий підхід, особливо зручний при кон'югації руда у; е двох білкових частин, використовує дегідратуючий о дюн агент, такий, як карбодімід, щоб вплинути на ва Ма--РЕ утворення, наприклад, пептидних зв'язків при вза- у ємодії карбоксильної групи одного компонента де п у кожному випадку означає ціле число 1- кон'югата з вільною аміногрупою іншого. У цьому 5; переважно п означає ціле число 3-5. випадку реагент не стає частиною кон'югата. Ця Немічене поліклональне антитіло, яке засто- реакція не є особливо зручною, оскільки карбокси- совується в способі за даним винаходом для зв'я- льна група не активована; карбодіїмід утворює зування антигенного неонікотиноїдного кон'югата активну проміжну сполуку і зрушує рівновагу шля- або кон'югата гаптен-КМ у тестованому зразку, хом видалення елементів води для утворення пе- може бути іммобілізоване на будь-якій з основ, які птидного зв'язку. звичайно застосовують у імунометричних аналі-

Обидва підходи до кон'югації, як правило, зах. Серед тих. які можуть застосовуватися, філь- здійснюють у водних розчинниках, оскільки білко- трувальний папір, латексні або полістирольні куль- вий матеріал, який утворює кон'югат, легко дена- Ки і поліетиленовий, полістирольний, турує. Білки, розраховані на те, щоб бути стійкими поліпропіленовий або інший придатний планшет з у водному навколишньому середовищі, як відомо, мікрокомірками або пробірка. Ця основа може бути денатурують навіть у таких розчинниках, як ета- зроблена з будь-якого полімеру природного або нол, що, здавалося б, є досить подібним до водно- синтетичного походження або з аморфного мате- го середовища. Крім того, компоненти білкового ріалу, такого, як скло. Вигідно використовувати кон'югата мають тенденцію бути відносно нероз- мембрани з нітроцелюлози або нейлону для реак- чинними в неводних розчинниках. ційних смуг і полівінільні, поліпропіленові, полісти-

Було знайдено, що гаптенові кон'югати насту- рольні або інші пластмаси для кульок або мікро- пної формули застосовні в практиці за винаходом: планшетів. Можуть також використовуватися гелі або частинки, в основі яких агароза, акриламід або латекс. Крім того, будь-які З імуно- хроматографічних пристроїв, смуг для тестування і пристроїв з горизонтальним розтіканням, відомі їду до діапазону калібрувальної кривої. Було знай- фахівцям, можуть бути адаптовані до способу за дено, що розведення від 1000- до 60000-кратного даним винаходом. Серед відповідних пристроїв з є зручними. Імунологічний аналіз займає приблиз- горизонтальним розтіканням можна згадати, на- но тридцять п'ять хвилин для свого виконання. приклад, тип такого пристрою, розкритий у (патенті Екстракція і приготування екстракту для аналізу уБМе43662411. Методики для прив'язування анти- займають приблизно тридцять хвилин. Отже, зра- тіл до таких матеріалів добре відомі фахівцям. зок насіння може бути екстрагований і аналізова-

Відповідним джерелом одержання антитіл, зв'яза- ний приблизно за одну годину і п'ять хвилин. В них з основою, є, наприклад, (Веасоп Апаїуїісаї одному варіанті втілення винаходу до двох зразків

Зузієтв, Іпс. (Ропапа, Маїпе))|. насіння (разом з вибірками - до п'яти проб на зра-

Щоб приготувати зразок насіння для викорис- зок насіння) можуть аналізуватися одночасно. тання в аналізі, вибірку з обробленої неонікотиної- Концентрації неонікотиноїдних інсектицидів від дом серії (наприклад, 5-100г насіння рапсу; 10- приблизно десяти тисяч частин на мільйон до од- 200г насінин сорго, пшениці, бавовни, польової нієї другої частини на мільярд можуть бути визна- кукурудзи або цукрової кукурудзи) диспергують у чені в імунологічних аналізах за даним винаходом. відповідному розчиннику, такому, як ацетон, аце- Однак спосіб придатний для будь-якої кількості тонітрил, етанол, ізопропанол, метанол або суміші присутнього неонікотиноїдного інсектициду за цих розчинників з різним процентним вмістом во- умови, що неонікотиноїдний інсектицид у зразку ди. Прийнятні суміші води і розчинників включа- або в екстракті зразка випадає в осад або може ють, наприклад, 1-5095 метанолу/води і 1-2095 бути відповідним чином розведений, щоб випасти ацетонітрилу/води. Дисперговане насіння змішу- в осад у межах калібрувальної кривої. ють за допомогою обертання і потім поміщають у Одержання антигену, вироблення поліклона- баню, яка опромінюється ультразвуком, приблизно льних антитіл і імунологічний аналіз ілюструються на двадцять хвилин з наступним додатковим обе- більш докладно наступними прикладами, які не ртанням. Вмісту дають відстоюватися. Визначену обмежують винахід. частину рідкого екстракту видаляють і додають Приклади відому кількість розчину, наприклад, 1905 ацетоніт- Приклад 1 - синтетична методика для тіаме- рил/вода. Екстракт розбавляють додатково, щоб токсамового гаптену довести концентрацію екстрагованого неонікотино-

Ома о ОоМме нюн,со, ' ни «но, -н очне 2 14

Сульфат О-метилізосечовини води. МОН "а а 1.12 о мо, о

І ка М н ра нити сов, нон 9 9 з Оме де, - Ин о Мо,

Із 1.2 а к.,со, | а- Ка

М мо, м'о,

А пн ! 5 М 7 сосн, -- 5 Ж р а а- |! С 4 а- у Я; м сон

М о Ме (Ф р) о 4 1.1 2-Метил-1-нітрозосечовина тий лід фільтруванням. Розчиняли голчасті крис-

Розчиняли сульфат О-метилізосечовини тали в етилацетаті і підлуговували розчин дода- (38,5г) у суміші азотної кислоти (120мл)у/сірчаної ванням карбонату калію. Сушили розчин над су- кислоти (280мл) при 0"С і перемішували протягом льфатом магнію і фільтрували. Концентрували 2год при 0"С. Обережно виливали суміш на коло- фільтрат, одержуючи білу порошкоподібну речо- тий лід при перемішуванні і потім . видаляли коло- вину (5г).

1.2 утворення масла, яке очищали флеш-

Готували розчин з Зг гідрохлориду метилового хроматографією у суміші дихлорме- ефіру 4-аміномасляної кислоти (1.1а) і 15мл води. тан/ацетонітрил (1:11), одержуючи потрібний про-

Доводили рН до 11, додаючи по краплях 2н. МаАОН дукт 1.5 (100мг). при охолодженні розчину в бані з льодом. Реак- -Мо, ційну колбу обладнували електродом для вимірю- к вання рН і термометром, одержаний прозорий 5 муч оон (5) основний розчин швидко перемішували в міру до- а- Ка у 2 ; давання невеликими порціями 2-метил-1- М о нітрозосечовини (2,38г), щоб підтримувати темпе- Приклади 2-5-тіаметоксамові гаптени ратуру розчину нижче 27С. Коли додавання заве- Використовували синтетичні методики прик- ршувалося, реакційну суміш перемішували протя- ладу 1 для одержання наступних тіаметоксамових гом 1,5год при 0"С; відзначити, що значення рн гаптенів, показаних у таблиці 1, шляхом заміни стабілізувалося при 9,6. Додавали ТГФ (1мл) і пе- проміжної сполуки 1.1а відповідним аналогом фо- ремішували протягом додаткових 2год. Реакційну рмули МНа(СНг)пСО2в (1.15), де п означає ціле суміш розбавляли водою і виливали в етилацетат. число 1-5 і КЕ означає Н або (С1і-Са)алкіл.

Після відділення органічної фази її сушили над сульфатом магнію, розчин фільтрували. Концент- рація фільтрату дала прозоре масло. Флеш- Таблиця і хроматографія неочищеного масла на силікагелі при елююванні сумішшю дихлорметан/ацетонітрил (3:11) привела до 750мг необхідного продукту у ч о. вигляді білої твердої речовини. Ур-в й З го. 1.3 но им Моюн и

Об'єднували продукт із досліду 1.2 (1,44г) з т ко; параформальдегідом (422мг), метансульфоновою моде он кислотою (0,02Змл) і мурашиною кислотою (10мл) і В: нагрівали при 557"С впродовж 15год. Реакційну ттентттн нище Щ суміш концентрували у вакуумі. Одержане корич- Приклад п неве масло суспендували в толуолі і за допомогою З 7 азеотропу упарювали розчин досуха. Масло, що З і 5 утворюється, розчиняли в суміші | 7

ТГФ/діоксан/ацетонітрил (1:1:1) і обробляли його 4 ! 5 надлишком діазометану. Даний розчин перемішу- х Ї Кі вали протягом ЗОхв і реакційну суміш обробляли 4 оцтовою кислотою. Концентрували реакційну су- міш до утворення масла. Знову розчиняли масло в Приклади 9 - тіаметоксамові гаптени етилацетаті промивали розведеним розчином Використовували синтетичні методики прик- бікарбонату натрію, сушили над сульфатом магнію ладу 1 для одержання наступних гаптенів тіаме- і знову концентрували до утворення масла. Очи- токсаму, показаних у таблиці 2, шляхом заміни щали це масло флеш-хроматографією у суміші проміжної сполуки 1.1а відповідним аналогом фо- дихлорметан/ацетонітрил (3:11), одержуючи 658мг рмули 1.1с необхідного складного ефіру оксадіазинаміномас- Е ляної кислоти (1.3) у вигляді прозорого масла. чут 1.4

Розчиняли продукт із досліду 1.3 (1,1г) в аце- о а тонітрилі (ХОмл) і додавали Зг карбонату калію. де Е означає ковалентний одинарний зв'язок

Додавали (хлорметил)хлортіазол однією порцією і або лінкер -(СНе)т-, в якому т означає ціле число реакційну суміш нагрівали при 557 впродовж 1-3; К означає Н або (С1-Са)алкіл. 20год. Охолоджували реакційну суміш до кімнатної Таблиця 7 температури і фільтрували для видалення твер- дих речовин. Одержаний коричневий фільтрат са о концентрували до утворення масла. Очищали ма- Уук-в г З сло флеш-хроматографією у суміші дихлорме- А им М. тан/ацетонітрил (3:1), одержуючи 894мг необхідної й ет сполуки у вигляді жовтого/коричневого масла. мені 1.5 і.

Розчиняли сполуку 1.4 (372мг) у Змл концент- о рованої соляної кислоти і 1мл води і перемішували те в М о протягом бгод при кімнатній температурі. Розбав- пит ляли реакційну суміш водою й обережно підлуго- вували, додаючи 1н. Масон доти, поки значення рн в не досягло 4,5. Екстрагували етилацетатом, орга- нічну Фракцію сушили над сульфатом магнію. най

Концентрували висушену органічну фракцію до 7 Ко й со Приклад 10 - синтетична методика для дезніт- роімінотіаметоксамового гаптену і

ШО, вагрівання. Хе) її З год при 65 5 ви - х б - о А Баня І Ще рнйнех М М ит овн

З т тк бо ще я і

М -

Методика ! - мо 0 ісвюненсвснян

Об'єднували гаптен тіаметоксаммасляної кис- сен лоти (100мг, 0,275ммоля) і анізол (6,5мл) у кругло- З що донній колбі на 10мл, обладнаній магнітною міша- лкою і зворотним холодильником. Колбу поміщали ! в масляну баню і нагрівали при 16573 впродовж | 2 ис 2год. Анізол видаляли при зниженому тиску при 16 50"С впродовж 5год. Одержаний маслянистий | ; продукт мав чистоту 9390 за аналізом методом

ВЕРХ. і7 і сон

Спектроскопічні дані для характеристики і !

ВЕРХ: сорбент Кеузіопе Зсіепіййс Адцавії! С-18, 5мкм (колонка 25х0,46бсм); ацетонітрил-20мМ фо- сфорна кислота (40:60); 1,0мл/хв; Її 402С; УФ- Ів оуєи детектор при 240нм (ширина смуги 10Онм); час І Ох пробігу 13хв; час утримування 4,6бхв. фпепттяя етеетрететет тент тесеткопеттнтх

ТШХ: (діольний гель) дихлорме- тан/ацетонітрил (2:11), К-0,25. Приклади 19-27 - імідаклопридні гаптени

Н-ЯМР (СОзЗСМ, З0ОМГЦ), 6:7,43 (т, 1Н), 4,78 Використовували синтетичні методики прик- (с, АН), 4,75 (с, АН), 4,48 (д, 2Н), 3,29 (т, 2Н), 227 ладу 1 для одержання наступних гаптенів іміда- (т, 2Н), 1,73 (кв, 2Н). ши о. клоприду, представлених у таблиці 4, використо-

Мас-спектр (електронна іонізація (ЕП/пристрій вуючи нітрогуанідильне похідне, одержане в прямого введення (ОБР): т/х 319 (М") досліді 1.2, або його аналог, одержаний заміною

Елементний аналіз: обчислено, 90: С 41,32; Н проміжної сполуки 1.1а на відповідний аналог фо- 158 М 13,14; знайдено, бо: С 40,13; Н 4,43; М рмули 1.16 або 1.1с, як показано в прикладах 2-9.

Приклади 11-18 - дезнітроіїмінотіаметоксамові Табииця 4 гаптени

Використовували синтетичні методики прик- і ладу 10 для одержання наступних дезнітроіміно- Я. М тіаметоксамових гаптенів, наведених у таблиці 3. С. Ї Ї заміняючи сполуку, одержану в прикладі 1, відпо- -й ие відним аналогом із прикладів 2-9. й й

Ж

ЕД

Тайлиця З й п промо, пр, ук ГО Ії СНО р щи ее чи я 20 «пєнюСьн у

Я зі «ССО

Приклад ЕК 22 «свв ВеНнии

І КНКО 23 МНН НИьи

І2 ГсвСнАСьН і сен

Ї во 0 сбвешенетосьн мо) 85 ї ї по Таблиця 8 що | р. мог МН НН. де во ї

І Кон пи й 27 у У

Приклад п

ШИ; СПО пи

Приклади 28-36 - гаптени дезнітроіміноіміда- з сно клоприду 39 «свСВСТЬСОЯ

Використовували синтетичні методики прик- що п НО, ладу 10 для одержання наступних гаптенів дезніт- 40 сан роіміноімідаклоприду, наведених у таблиці 5, замі- а ісшее сиюВетосьн няючи сполуку, одержану в прикладі 1, нини відповідним аналогом із прикладів 19-27. | со

Тяйниця З і :

І но о М 43 в! ря Ша о фе я птнннтідттнндотеттттттттттттттткадлннх З

Прикаая Е Є 28 «НеССОН 45 | сов 25 СНиП ей сн дтп тість | сгрнння пппваннеи о пооеегеюоеооюоюю 3 кенеВвенвьосН рими зка рт Приклади 46-54 - гаптени дезнітроіміноклоті- 32 яєпеНнениТЬспильН адину ; он Використовували синтетичні методики прик- 43 зЗ-- ладу 10 для одержання наступних дезнітроімінок-

Що й лотіадинових гаптенів, наведених у таблиці 7, за- сом міняючи сполуку, одержану в прикладі 1, за | у Й відповідним аналогом із прикладів 37-45. ! шт як 4

Габхлиця 7

Ме ОН її с ї-о

Мо иМН ую бує ! ие и п пе тт аю еще й У «Кен

Приклади 37-45 - гаптени клотіадину ? Щ жо

Використовували синтетичні методики прик- яв ССС ладу 1 для одержання наступних гаптенів клоті- 49 СтСНТЬСТЬСОВ адину, наведених у таблиці 6, з використанням Їде тт ле тру ля от нітрогуанідильного похідного, одержаного в досліді 50 спе НеНниСьЯ 1.2, або його аналога, одержаного заміною промі- | сод жної сполуки 1.1а відповідним аналогом формули г | бр 1.15 або 1.1с, як показано в прикладах 2-9. й | ЧУ дод

53 у 64.3 ї Розчиняли 1мг гідрохлориду 1-

Й (диметиламінопропіл)-3-етилкарбодііміду (ЕЮС) у 1б0Омкл дистильованої деіонізованої води. Негайно «а чу додавали розчин ЕОС до розчину гаптен-РРО з й і : досліду 3.2. Змішували розчин гаптен-РРО-ЕОС і шляхом обертання протягом 2год при кімнатній па п температурі. Переносили реакційну суміш у діаліз- ний мішок з відокремленням молекулярної маси

Приклади 55-63 - гаптени тіаклоприду 1000-2000Да. Піддавали діалізу екстенсивно проти

Використовували синтетичні методики, описані гл ЗФР при 47С при трьох змінах/день протягом для гаптенів формул (ПА) ії (ПВ), для одержання сорока восьми годин. с, й наступних гаптенів клотіадину, наведених у табли- вену 65 - одержання імідаклопридного іму- ці 8. Використовували методики прикладу 64 для

Табання 8 одержання імідаклопридного імуногену з застосу- що ванням гаптену з прикладу 21. пок да Приклад 66 - одержання клотіадинового імуно- сах я гену

Я. Й Використовували методики прикладу 64 для 2 Мия одержання клотіадинового імуногену з застосу-

М ванням гаптену з прикладу 39. шт Приклад 67 - одержання тіаклопридного імуно-

М гену

Використовували методики прикладу 64 для нин: доки пон их вин одержання клотіадинового Імуногену з застосу-

Приклад | нь ванням гаптену з прикладу 57. 53 ЯНЬСОИ. | Приклад 68 - схема імунізації і збирання анти- ще «СНСТССН Тл панни ! !

Для початкової імунізації розчиняли імуноген із 7 уСваснсвьсоя прикладу 64 у повному ад'юванті Фрейнда. Робили «8 кстсвснсНсоВ щеплення білим кроликам-самкам породи Мем поливи 7еаапа, вводячи приблизно 25мкг імуногену в 59 попсвстсненюья кожну ділянку. Подібним чином імунізували овець

І сов за винятком того, що в кожну ділянку вводили (7 приблизно З8мкг імуногена.

В: При наступних імунізаціях розчиняли імуноген

Що у неповному ад'юванті Фрейнда. Тварини відпочи-

Й : ом вали протягом чотирьох тижнів між імунізаціями і ві ТУ кров в них брали через десять днів після імунізації.

Застосовували активаторні ін'єкції і відбирали і : кров у тварин протягом дев'яти місяців, наприкінці : сон яких вони були знекровлені. ай і Поліклональні антитіла збирали, використову- ' ючи методики, відомі фахівцям у цій галузі. й і ра, сан Приклад 69 - одержання кон'югатів гаптен- 53 | х й фермент 7 69.1 пня пи Гаптен тіаметоксаму з прикладу 1 (3,1мг), М-

Приклад 64 - одержання тіаметоксамового ідроксисукцинімід (МАВ) (40мг) ! гос (абмо) об- й єднували в невеликому флаконі. Дані матеріали

МУ сушили під слабким струменем азоту протягом

Готували розчин очищеного білкового похідно- Тохе дри кімнатній температурі. го (туберкуліну, РРО) у 0,01 ЗФР, рН 7,4 до конце- Додавали сухий диметилформамід (2,Омл) і нтрації мг/мл. Доводили рН б,5мл аліквотної про- суміш опромінювали ультразвуком протягом 1хв. би даного розчину до 4,5-5,0 3 0,1М соляною Одержаний розчин інкубували протягом ночі при подо кімнатній температурі. " . 69.3 мул ВОМКИ, М рин М У невеликому флаконі розчиняли пероксидазу ' дк хрону (8,5мМг карбонатному буфері (2,0мл морфоліно)етансульфонової киспоти, рН 4,5. 06" о ОМ, сн 96). Флакон поміщали в блнов лесдом, єднували розчини гаптену і РРО. во 4

Усі 100мкл розчину гаптен-МН5О-ЕО5З з досліду 6.2 повільно додавали протягом год і суміш інку-

бували при перемішуванні протягом 2год. Реакцій- за рівнянням У--.191І п(Х)-1,23, --.999, де У ну суміш пропускали через колонку із сефадексом означає аналітичну відповідь і Х означає концент- 1-25М, врівноважену із ЗФР (0,01М, рН 7,2). Фер- рацію тіаметоксамових стандартів. ментний кон'югат збирали в перших 3,0 мл елюату Приклад 71 - тест перехресної реактивності і додавали рівний об'єм гліцерину; зберігали при - насіння сільськогосподарських культур, обробле- 2076. них тіаметоксамом.

Приклад 70 - імунологічний аналіз насіння ра- 71.1 Екстракція насіння псу, обробленого тіаметоксамом Зразки обробленого насіння піддавали вибірці

Частина екстракту насіння розбавляли суміш- шляхом довільного додавання в широкогорлу по- шю 195 метанол/вода доти, поки очікувана концен- судину на 8 унцій 50г насіння бавовни, польової трація тіаметоксаму не була доведена до діапазо- кукурудзи, сорго, цукрової кукурудзи і пшениці або ну калібрувальної кривої, 0,5-120част./млрд. рапсу. Насіння рапсу піддавали вибірці 4 рази,

Пробірки з нанесеними антитілами мітили і помі- використовували насіння з п'ятикратною вибіркою і щали в штатив таким чином, щоб перша й остання насіння інших видів. Додавали розчинник (15Омл) і пробірки були стандартами, а інші стандарти і зра- щільно закривали кришку. Насіння бавовни екст- зки змішували. Кожну пробірку закріплювали в рагували сумішшю 595 ацетонітрил/вода, тоді як штативі так, щоб його можна було перевернути для іншого насіння використовували суміш роз- без втрати пробірок. В усі відповідні пробірки до- чинників 2090 метанол/вода. Посудину енергійно давали аліквоту стандарту або зразка (0,5мл). Ро- струшували вручну протягом З0сек і поміщали у зчин ферментного кон'югата (0,5мл) додавали в водну баню, яка опромінюється ультразвуком, при усі пробірки. Штатив обережно струшували, щоб кімнатній температурі на 20хв. Зразки струшували змішати вміст усіх пробірок. Пробірки інкубували другий раз, як раніше описано. Вмісту посудини протягом 20хв при кімнатній температурі. Штатив давали відстоятися протягом приблизно 5хв і від- перевертали, щоб декантувати вміст усіх пробірок. бирали аліквоту (0,1О0мл) для аналізу. Аліквоту

В усі пробірки додавали дистильовану воду до розводили в суміші 195 метанол/вода для дове- переповнення, використовуючи промивну склянку дення концентрації осаду до діапазону стандарт- з дозувальним ковпачком, і промивну воду декан- ної кривої. тували. Пробірки промивали додатково тричі. Піс- 71.2 Імунологічний аналіз ля останнього промивання штатив перевертали й Покриті антитілом полістирольні пробірки для обережно постукували пробірками по чистому па- культивування мітили і поміщали в штатив для перовому рушнику, щоб видалити надлишок про- пробірок таким чином, що перша й остання пробір- мивання. Додавали субстрат ферменту (0,5мл) в ки служили стандартами, а стандарти і зразки, що усі пробірки, які інкубували протягом 10хв при кім- залишилися, змішували. Зразок і стандартний роз- натній температурі. У процесі інкубації штатив чин (по 0,50мл) додавали у відповідні пробірки. обережно струшували кожні 2,5хв. Кислий розчин, Додавали такий же об'єм розчину ферментного який зупиняє реакцію (1М соляна кислота, 0,5мл), кон'югата. Штатив обережно струшували, щоб пе- додавали в усі пробірки, щоб припинити генерацію ремішати розчини, і інкубували протягом 20хв при сигналу. Як показано в таблиці 10, поглинання кімнатній температурі. Вміст усіх пробірок видаля- продукту реакції вимірювали при 450нм. Погли- ли, перевертаючи штатив над лотком з нержавію- нання стандартів використовували для побудови чої сталі. Кожну пробірку промивали, наповнюючи калібрувальної кривої, функція регресії у вигляді до країв дистильованою водою. Штатив перевер-

Уетіп(Х)-В. Поглинання кожного зразка підстав- тали над мийкою, щоб злити промивну воду. Про- ляли у функцію, щоб визначити концентрацію не- мивання повторювали чотири рази. Потім штатив онікотиноїдного пестициду в розведеному зразку. перевертали і легко постукували по паперовому

Одержану концентрацію множили на фактор роз- рушнику, щоб видалити більшу частину води, що ведення, щоб розрахувати кількість неонікотиноїд- залишається. (Деяка кількість рідини, що залиша- ного пестициду у вихідному зразку. ється в пробірках, не впливала на результати ана- лізу). Розчин субстрату ферменту (0,50мл) дода-

Таблиця 10 вали в пробірки, які інкубували протягом десяти хвилин при кімнатній температурі. Штатив обере-

Типова стандартна крива жно струшували з інтервалами в 2,5хв, щоб забез- імунологічного аналізу тіаметоксаму печити збереження достатнього постачання фер- менту субстратом. Генерацію синього сигналу

Концентрація! тіаме-| Поглинання при 45О0нм (ана- припиняли додаванням кислого розчину, який зу- кожній пробірці вимірювали спектрофотометрично при 450нм. Концентрацію аналізованої речовини у зразках визначали за функцією регресії у вигляді устіпрд. й 71.3 Визначення перехресної реакційної здат- 1 Одиниця вимірювання част/млрд ності щ ,

Оцінювали перехресну реакційну здатність

Функцію, яка описує відповідь тіаметоксамових або специфічність імунологічного аналізу, щоб стандартів, виробляли за допомогою регресійного визначити, чи будуть інші досліджувані речовини, аналізу. Цей набір даних давав стандартну криву знайдені в насіннєвих покриттях, заважати вимі-

рюванню тіаметоксаму. Досліджувані речовини кційну здатність в імунологічному аналізі (Таблиця розчиняли в суміші 190 метанол/вода до концент- 9 нижче). Отже, даний імунологічний аналіз спе- рації, яка змінюється від 1000 до 0,01нг/мол. Алік- цифічний до тіаметоксаму. воти кожної концентрації аналізували, як описано Вибірки оброблених серій насіння аналізували вище. Реакційну здатність кожної досліджуваної за допомогою імунологічного аналізу і ВЕРХ. Ре- речовини вище даного діапазону визначали, як зультати даних аналізів наведені в Таблиці 11. описано раніше Вгаду У.Р., Тигпе 9., ЗКіппег О.Н. Таблиця 11 ілюструє кореляцію середніх резуль- "Арріїсайоп ої а шіазийгоп епгуте іттипоаввзау татів імунологічного аналізу, який використовує

Ше апаїувзів ої іпсштеа гезідцев5 іп зоїЇ апа мжмагег поліклональне антитіло, і аналізу методом ВЕРХ затріев", у). Адгісє. Роса. Спет. 1995, 43:2542-2547. сорока зразків насіння для тіаметоксаму. Найкра- 71.4 Результати ща відповідність лінії регресії вказує на те, що по-

Знайдено, що серед досліджуваних аналізо- дібні результати були одержані кожним способом. ваних речовин лише тіаметоксам має значну реа-

Таблиця 9

Перехресна реакційна здатність в імунологічному аналізі тіаметоксаму тІРеакційна здатність досліджуваних речовин відносно реакційної здатності тіаметоксаму, виражена у відсотках. 2НР - нереакційноздатний.

Фахівці в даній галузі зрозуміють, що можна ходом, як описано вище, не відходячи від суті й зробити різноманітні варіації і модифікації за вина- обсягу винаходу, що широко представлені.

Таблиця 11

Порівняння аналітичних результатів, одержаних імунологічним аналізом і ВЕРХ ня Аналіз реплік! значення

Рапс

Сорго

Продовження таблиці 11 294689 | 690 | 732 | 655 | 753 | 7/0 | 708 | 7/2

Пшениця | 294690 | 930 | 817 | 690 | 794 | 898 | 826 | 745 294692 | 1057 | 994 | 893 | 740 | 845 | 906 | 73 1 Аналіз реплік (п'ять) кожного зразка супроводжувався імунологічним аналізом. Середнє значення іму- нологічних аналізів для кожного зразка зіставляли з результатом ВЕРХ для кожного зразка шляхом ре- гресійного аналізу. Це давало функцію регресії -1,00Х--10,9, г-.976, М-40, де У означає визначений імунологічним аналізом тіаметоксам у част./млн і Х означає визначений ВЕРХ тіаметоксам у част./млн.

Таблиця 11

Порівняння аналітичних результатів, одержаних імунологічним аналізом і ВЕРХ (продовження) ня Аналіз реплік значення

Бавовна нниШИожоЖоЛоХЬЄЗКННШІЛХІЕУШЮТІ,ТВВІВІТВІТВЛЛІЛТВЬЬЬИНЬНЬСЬСЬНЬЬ.! 298298 | 554 | - | 476 | 426 | 481 | 484 | 368

Зурова 71 2 2 ЛРАТТ222007020220202072.0550202007005205053530053553 гукурултя

Польова ТТН кукурудза 1 Аналіз реплік (п'ять) кожного зразка супроводжувався імунологічним аналізом. Середнє значення іму- нологічних аналізів для кожного зразка зіставляли з результатом ВЕРХ для кожного зразка шляхом ре- гресійного аналізу.

СО Компютернаверстка О.Гапоненко 00000000 Підписнеб 00101010 Тиражобаприм,о 000

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601