KR100876435B1 - 살충제 비스트리플루론 잔류물의 효소면역학적 분석에이용되는 합텐-단백질 복합체 및 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 살충제 비스트리플루론의 효소면역학적 분석에 이용되는 합텐-단백질 복합체 및 그로부터 생성된 항체에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 비스트리플루론의 특정 합텐 화합물과 단백질이 결합된 복합체에 대한 항체를 이용함으로써 살충제 비스트리플루론을 신속하고 정량적으로 검출할 수 있다.
Description
도 1은 단백질 A 칼럼을 이용하여 합텐 I-KLH 결합물(I-KLH)에 대한 항체를 정제하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 2는 분리된 항체의 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 코팅 항원으로서 I-BSA를 이용하고, 항혈청으로서 I-KLH를 이용한 다클론 항체의 간접경쟁 ELISA 결과를 나타낸다.
도 4는 다양한 코팅 항원을 이용한 다클론 항체의 간접경쟁 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5는 간접경쟁 ELISA에 대한 다양한 블록킹 시약의 효과를 나타낸 것이다.
도 6 및 도 7은 각각 간접경쟁 ELISA에 대한 아세톤 및 메탄올의 영향을 나타낸 결과이다.
도 8은 간접경쟁 ELISA에 대한 pH의 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 간접경쟁 ELISA에 대한 이온 농도의 영향을 나타낸 것이다.
도 10은 간접경쟁 ELISA에 대한 Tween 20의 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 최적화 조건에서의 표준 곡선을 나타낸다.
도 12는 교차반응성의 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 살충제 비스트리플루론 잔류물의 효소면역학적 분석에 이용되는 합텐-단백질 복합체 및 항체에 관한 것이다.
살충제 비스트리플루론(bistrifluron)은 유기인계, 카바메이트계 살충제를 대체할 수 있는 저독성이면서 온실가루이, 나비목해충, 흰개미에 효과가 탁월하다. 비스트리플루론은 신경전달이상을 일으켜 해충을 죽이는 유기인계에 비해 사람과 동물에는 존재하지 않고 갑각류 및 곤충에만 존재하는 표피의 주성분인 키틴(chitin)의 생합성을 억제하여 곤충의 탈피를 억제시켜 결국 치사에 이르게 하는 새로운 작용기작을 가진 살충제이다. 따라서 키틴을 가지고 있지 않은 사람, 가축 및 유용동물에는 독성이 없는 환경친화적이며 유기인계에 저항성인 해충에도 효과가 우수한 살충제이다.
잔류 농약의 분석은 주로 감도와 정확도가 높은 기체 크로마토그래피(GC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등에 의해 수행되었으나, 이들 크로마토그래피 방법은 장시간의 전처리 과정과 고가의 기기, 전문적 기술을 가진 인력 등을 필요로 할 뿐만 아니라, GC의 경우 열적으로 불안정한 물질의 분석은 불가능하고, HPLC의 경우는 발색단이 없는 농약은 검출이 어려운 단점을 가지고 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 주로 생체성분의 분석이나 임상진단에 이 용되었던 면역분석법(immunoassay)을 잔류농약의 분석에 적용시키려는 시도가 1970년대에 시작되었다. 분석과정에 효소와 항체가 관련되어 효소면역학적 분석 [Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)]이라고 부르며 이 효소면역학적 분석법에 의한 잔류 농약의 분석은 감도가 매우 높고, 시료의 전처리 과정이 거의 불필요하며, 다수의 시료를 동시에 신속하게 분석할 수 있고, 비용이 적게 든다는 장점이 있다.
이와 같은 ELISA(효소면역학적 분석법)은 항체와 항원 사이의 특이적이며 친화력이 높은 결합에 근거한 분석법이므로, 면역분석법을 개발하기 위해서는 분석물질에 대한 항체를 생산하여야 하며, 따라서 적절한 항원이 준비되어야 한다. 그러나, 농약과 같은 저분자 물질은 그 자체로서 항원으로 작용할 수 없어서 항체의 생산이 불가능하므로, 농약과 구조가 유사하며, 단백질과 공유결합할 수 있는 원자단을 가진 물질, 즉, 합텐(hapten)의 합성이 요구되었다. 또한, 경쟁적 면역분석법에서 사용되는 경쟁자인 코팅항원 및 효소 트레이서(enzyme tracer)의 제조를 위해서도 합텐의 합성이 요구되었다.
농약의 ELISA는 이미 미국의 FDA를 비롯한 전세계 기관에 의해 1970년대 이후 활발한 연구가 진행되고 있고 현재 외국에서 개발된 혹은 개발중인 농약에 대한 ELISA 분석법은 살균제 7종, 살충제 30종, 살충제 28 종, 식물생장조정제 10종 등으로 약 80여종이다.
그러나 국내에서 일부 대학 및 연구 기관에서 연구목적으로 실험이 진행되어 항혈청이 생산된 농약은 7종 정도이고 상품화가 된 것은 없으며 이들 대상 농약은 대부분 개발된 지 오래된 일반적인 농약으로서 경쟁력이 크지 않고, 현재 국내에 사용 중인 농약 잔류 검출용 ELISA 키트는 전량 수입 제품이다. 따라서, 국제적으로 농산물 시장의 개방화와 더불어 국내 농업에서도 영농체제가 기술집약적이고 고품질, 고안전성을 추구하는 경향에 있으므로 유통 농산물의 잔류 농약에 대한 안전성 검정에 있어서도 그 효율성과 경제성이 높고 또한 특이성과 민감도가 탁월한 항혈청을 이용한 ELISA법이 계속적으로 절실히 요구되고 있다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 살충제 비스트리플루론에 대한 검출 방법을 연구하던 중, 비스트리플루론의 특정 합텐 화합물과 단백질이 결합된 복합체에 대한 항체를 이용함으로써 살충제 비스트리플루론을 신속하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 살충제 비스트리플루론(bistrifluron)의 합텐 화합물과 단백질이 아미드 결합에 의해 결합된 복합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 특정 구조를 갖는 비스트리플루론의 합텐 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 복합체에 반응하여 생성되는, 비스트리플루론에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 복합체로 포유동물을 면역시키는 단계 및 상기 포유동물로부터 비스트리플루론에 특이적인 항체를 선발하는 단계를 포함하는, 비스트리플루론에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 항체를 포함하는, 시료 중의 비스트리플루론을 검출하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
살충제 비스트리플루론(bistrifluron)의 합텐 화합물과 단백질이 아미드 결합에 의해 결합된 복합체를 제공한다. 합텐은 항원만으로 원활한 면역작용을 일으킬 수 없을 때, 항원과 결합하여 항원에 대한 면역반응을 유도하는 물질을 말한다. 분자량이 작은 물질도 항체와 결합할 수 있으나, 생체 내에서 면역반응을 유발하지는 않는다. 따라서 이 물질은 분자량이 큰 담체(carrier)에 연결시켜야만 한다. 대부분의 농약은 면역계를 자극할 수 있을 만큼 충분히 크지 않기 때문에 농약에 대한 항체를 얻기 위해서는 단백질과 같이 분자량이 큰 담체(carrier)에 연결시켜 실험동물에 주사하여야 한다. 담체와 결합시키기 좋은 -COOH, -SH, -OH 또는 -NH2 등의 작용기를 가진 농약들도 있으나, 대부분의 농약에는 이러한 작용기가 없기 때문에 작용기를 도입한 농약 유도체를 합성하여 이용하는데, 이렇게 단백질과 결합할 수 있는 물질을 합텐이라고 한다.
합텐이 단백질과 아미드 결합을 형성하기 위해 카르복실기 또는 아미노기를 포함할 수 있다. 합텐의 카르복실기는 단백질의 아미노기와 아미드 결합을 형성할 수 있으며, 합텐의 아미노기는 단백질의 카르복실기와 아미드 결합을 형성할 수 있다. 담체 단백질에 합텐의 결합은 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 상 기 방법은 당연히 담체 단백질에 존재하는 작용기에 의존할 것이다. 본 발명에서는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 단백질, 소 혈청 알부민(BSA) 단백질 및 오발부민(OVA) 단백질을 이용하여 합텐과 결합시켰다. 카르복실기를 갖는 합텐과 단백질을 결합시키는 방법은 하기와 같은 카보디이미드와 N-히드록시숙신이미드를 이용한 활성 에스테르 방법을 이용할 수 있다.
아미노기를 갖는 합텐과 단백질을 결합시키는 방법은 하기와 같은 글루타릴 디알데히드 방법을 이용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 비스트리플루론의 합텐 화합물은 이 하기 화학식 1의 화합물이다:
<화학식 1>
[식 중,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기 또는 탄소수 1 내지 10의 할로알킬기를 나타내고,
R8은 아미노기 또는 카르복실기를 나타내며,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 단순결합, 탄소수 6 내지 20의 아릴렌기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타내며, 상기 아릴렌기에 존재하는 하나 이상의 수소 원자는 할로겐 원자로 치환되고,
m은 0 내지 3의 정수를 나타내며, n은 1 내지 3의 정수를 나타낸다].
본 발명의 명세서에서, 용어 "알킬"은 탄소수 1 내지 10의 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함하며, 바람직한 알킬 라디칼은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬이다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, iso-아밀, 헥실 등을 들 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬 라디칼이 더욱 바람직하다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "할로겐"은 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드 및 요오디드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "아릴렌"은 카르보시클릭 방향족 고리 또는 고리계를 의미하는 아릴의 2가 형태이며, 예로서는 페닐렌, 나프틸렌, 비페닐렌, 플루오레닐렌 및 인데닐렌 등이 있다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "알킬렌"은 상기에 정의한 "알킬"기의 2가 형태이다.
더욱 바람직하게는, 상기 비스트리플루론의 합텐 화합물은 하기 합텐 I, II, III, IV 또는 V의 화합물일 수 있다:
<합텐 I>
<합텐 II>
<합텐 III>
<합텐 IV>
<합텐 V>
상기 비스트리플루론의 합텐 화합물 선정시 고려한 사항은 하기와 같다.
1) 분석물질에 있는 거의 모든 기능기가 합텐에도 있어야만 특이성과 친화력이 뛰어난 항체를 얻을 수 있기 때문에 합텐은 형태와 전자분포 면에서 분석물질의 특징을 보유하여야 한다.
2) 분석물질에서 어떤 원자나 기가 치환되어야 할 경우에는 염소 대신에 황 같이 유사한 치환체로 치환하여야 한다.
3) 합텐의 링커 또는 스페이서 암(arm)의 길이는 탄소수 4-6 개가 적절하다. 또한 스페이서 암에는 항체가 인식할 수 있는 특징적인 기능기나 덩치가 큰 키가 포함되어서는 안 된다.
4) 특징적인 기능기나 원자가 있는 위치에 인접하여 스페이서 암을 만들면 좋지 않다. 스페이서 암의 입체장애 등으로 인한 항체가 합텐의 특징적인 구조물 또는 기능기를 인식하지 못하는 경우가 있을 수 있기 때문이다.
5) 면역반응유발 합텐과 분석 합텐(플레이트 코팅 합텐 또는 트레이서 합텐 또는 분석 복합체)은 서로 다른 것이 좋다. 왜냐하면 다를 경우에는 스페이서 암에 인한 항체의 친화력에 결부된 문제(bridging effects)를 제거할 수 있는 이점이 있 다.
상기와 같은 사항을 고려하여 벤조일 페닐 우레아 살충제 중 비스트리플루론 (하기 그림)의 특징적인 구조인 2-클로로-3,5-비스트리플루오로메틸 아닐린 구조를 인식할 수 있도록 2,6,-디플루오로 벤조산 위치 (위치 a)에 가장 많이 도입하는 작용기인 COOH 또는 NH2를 가진 스페이서를 부착시킨 합텐을 설계하여 합텐 I 내지 V를 합성하였으며, 이렇게 합성된 합텐의 구조는 NMR과 MS를 이용하여 확인하였으며, 면역원과 코팅 항원으로 사용하였다.
본 발명의 복합체에서, 상기 단백질은 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, 오발부민, 티로글로불린(thyroglobulin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 담체 단백질은 T-세포를 자극할 수 있고, 이어서 B-세포로 하여금 전체 합텐-담체 복합체 분자에 대한 항체를 생산하도록 유도하는 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 함유하는 분자를 포함한다. 에피토프의 결정 인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹들로 구성되며, 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정한 3차원 구조적 특성을 갖는다. 면역원성을 가지기 위해서는 단백질 또는 폴리펩티드가 T-세포를 자극할 수 있어야 한다고 여겨진다. 그러나, T-세포 에피토프가 결핍된 담 체 단백질도 또한 면역원성을 가질 수 있다.
본 발명의 복합체는 살충제 비스트리플루론의 효소면역학적 분석에 이용될 수 있다. ELISA 분석을 위해서는 검출하고자 하는 항원에 결합하는 항체를 필요로 하는데, 본 발명의 복합체에 의해 생성된 항체가 비스트리플루론에 선택적으로 결합하게 된다면, 비스트리플루론의 효소면역학적 분석에 이용될 수 있는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 화학식 1의 구조를 갖는 비스트리플루론의 합텐 화합물을 제공한다:
<화학식 1>
[식 중,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기 또는 탄소수 1 내지 10의 할로알킬기를 나타내고,
R8은 아미노기 또는 카르복실기를 나타내며,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 단순결합, 탄소수 6 내지 20의 아릴렌기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타내며, 상기 아릴렌기에 존재하는 하나 이상의 수소 원자는 할로겐 원자로 치환되고,
m은 0 내지 3의 정수를 나타내며, n은 1 내지 3의 정수를 나타낸다].
상기 합텐 화합물은 살충제 비스트리플루론의 효소면역학적 분석에 이용된다. 바람직하게는 상기 비스트리플루론의 합텐 화합물은 하기 합텐 I, II, III, IV 또는 V의 화합물일 수 있다:
<합텐 I>
<합텐 II>
<합텐 III>
<합텐 IV>
<합텐 V>
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 복합체에 반응하여 생성되는, 비스트리플루론에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 비스트리플루론의 합텐 화합물과 단백질의 복합체에 의해 생성되는 항체는 합텐에 특이적인 항체, 단백질에 특이적인 항체 및 합텐 및 단백질의 복합체에 특이적인 항체가 생성될 수 있다. 이 중에서, 합텐에 특이적인 항체가 비스트리플루론에 특이적으로 결합할 수 있으므로 바람직하다. 상기 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체일 수 있다. 단클론성 항체의 제조 기술은 당업계에 공지되어 있다. 단클론성 항체는 합텐-담체 복합체를 포함하는 조성물을 쥐에 주사하고, 이어서 혈청 시료를 제거하여 항체 생성을 확인하며, 비장을 제거하여 B-림프구를 얻고, 이 B-림프구와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마를 제조하고, 이 하이브리도마를 클로닝하고, 합텐-담체 복합체에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선발하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리함으로써 얻을 수 있다.
단클론성 항체는 잘 확립된 각종 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술로는 단백질-A 세파로오스를 이용한 친수성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 들 수 있다. 예를 들면, 콜리간(Coligan)의 2.7.1~2.7.12 페이지 및 2.9.1~2.9.3 페이지를 참조한다. 또한, 바인스(Baines) 등의 "Purification of Immunoglobulin G(IgG)"(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, 79~104 페이지, The Humana Press, Inc. 1992)을 참조한다.
다클론성 항체의 제조 기술도 당업계에 공지되어 있다. 다클론성 항체는 공지된 표준 기술에 따라 제조된다. 다클론성 항체를 제조하기 위하여, 면역원성 물질을 동물에 주사하고 주사된 면역원의 수많은 에피토프에 대한 항체 혼합물을 함유하는 혈청을 채취한다. 항체 생산용으로 적합한 숙주 포유동물로는 인간, 쥐, 마우스, 토끼 및 염소를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 복합체로 포유동물을 면역시키는 단계 및 상기 포유동물로부터 비스트리플루론에 특이적인 항체를 선발하는 단계를 포함하는, 비스트리플루론에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 복합체에 대한 항체를 포함하는, 시료 중의 비스트리플루론을 검출하는 키트를 제공한다. 본 발명의 항체는 또한 시료 중의 비스트리플루론 수준을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있는 키트를 제조하는데 유용하다. 본 발명에 따른 키트는 적합한 용기 내에 본 발명에 따른 비스트리플루론-특이적 항체를 포함한다. 방사면역분석법에서는 상기 키트는 표지된 비스트리플루론을 포함해도 좋다. 시료 중의 비스트리플루론은 표지된 비스트리플루론을 항체에 결합시킨 후, 항체로부터의 비스트리플루론과 검사할 시료를 경쟁시킴으로써 검출한다. ELISA 키트도 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하며, 추가로 비스트리플루론-특이적 항체에 특이적인 효소 표지된 2차 항체, 상기 효소가 분해하여 발색 반응을 야기할 수 있는 기질 용액 등을 포함할 것이다. 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 우레아제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 합텐의 합성
1) 합텐 I의 합성
① I-2 (2,6-디플루오로-3-요오도벤조산)의 합성
2,6-디플루오로벤조산 (I-1, 15.8g)과 요오드 (12.7g)을 250mL 삼구 플라스크에 놓은 후 아세트산 30mL를 가하여 용해시켰다. 온도를 85-90℃로 유지시키고, 질산 4.8mL와 황산 10.6mL의 혼합액을 적가 깔대기를 이용하여 천천히 가하였다. 승화되어 나오는 요오드는 소량의 사염화 탄소를 이용하여 반응용액 안으로 녹여 들였다. 6시간 가열 환류 후 용매를 감압농축하고, 잔사를 80mL 에틸 아세테이트에 녹인 후 Na2S2O3 용액으로 남아있는 요오드를 제거하였다. 유기용매 층을 증류수와 포화식염수로 씻어주고, 수용액 층을 에틸 아세테이트로 재추출하여 유기용매 층을 합한 후, 무수 Na2SO4로 탈수하고 갑압증류하여 25g의 생성물을 얻었다.
NMR(CDCl3): 6.84(1H, m), 7.86(1H, m), 10.62(1H, br)
② I-3 (2,6-디플루오로-3-요오도벤즈아미드)의 합성
화합물 I-2 20g을 과량의 티오닐클로라이드에 가하고 2시간 동안 가열 환류하였다. 가열 환류 후 용매를 감압건고 후 잔사에 차가운 포화암모니아 용액을 얼음 욕조 안에서 가하였다. 10분간 격렬하게 흔든 후, 생성된 고체를 여과하고 포화 암모니아 용액을 세척 후 19.5 g의 조(crude) 화합물을 얻었다. 이 조 화합물을 에 탄올/물 = 8:3 용액에서 재결정하여 흰색의 목적 화합물 16.1g을 얻었다.
NMR(CDCl3); 5.98(2H, br), 6.82(1H, m), 7.80(1H, m)
③ I-4 (2,6-디플루오로-3-[2-(에톡시카르보닐)비닐]벤즈아미드)의 합성
11.3g의 I-3 화합물을 40mL의 아세토니트릴에 녹인 후, 저어 주면서 2.8g의 디클로로 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 촉매와 44mL의 에틸 아크릴레이트, 8.1g의 트리에틸아민을 질소 환류하에서 가하였다.
무수 염화칼슘 트랩을 설치한 후, 반응 혼합액을 밤새 가열 환류하고 용매를 감압 건고하여 잔사를 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 목적 화합물 5.3g 을 분리하였다.
NMR (CDCl3); δ 1.31 (t, 3H), 4.21 (q, 2H), 6.04 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 6.45 (d, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.70 (d. 1H)
GC-MS; m/z 255 (M+, 30), 210 (100), 191 (55), 119 (35).
④ I-5 (2,6-디플루오로-[2-(에톡시카르보닐)에틸]벤즈아미드)의 합성
I-4 1.3g을 130mL의 에틸 아세테이트에 녹인 후 0.26g의 산화백금 촉매를 가하고, 수소를 불어넣어 주면서 환원시켰다. 더 이상의 수소가 소모되지 않을 때에 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)를 이용하여 여과하고 용매를 감압 건고하여 생성된 고체를 에틸 아세테이트/석유 에테르 혼합 용액으로 재결정하여 목적 화합물 1.2g을 얻었다.
NMR (CDCl3); δ 1.19 (t, 3H), 2.56 (t, 2H), 2.93(t, 2H), 4.09 (q, 2H), 5.97 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 6.85 (m, 1H), 7.35 (m. 1H),
GC-MS; m/z 257 (M+, 10), 140 (100), 126 (65), 95 (90).
⑤ I-6 (2-클로로-3,5-비스트리플루오로메틸 아닐린)의 합성
23g의 3,5-비스트리플루오로메틸 아닐린을 100mL 사염화 탄소에 녹인 후 N-클로로숙신이미드 15g을 가하고 4시간 동안 가열 환류하였다. 반응액을 얼음 욕조에서 냉각시킨 후, 침전된 이미드를 제거하고 증류수 100mL로 유기층을 3회 세척하고, 유기용매 층을 Na2SO4로 탈수 후 감압 건고하여 조 추출물을 얻었다. 조 추출물에 헥산 20mL를 가하고, 영하 20도 냉장고에서 재결정하여 목적 화합물 21g을 얻었다.
NMR (CDCl3); δ 4.53 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 7.22 (s, 1H).
GC-MS; m/z 263 (M+, 100), 265 (M+2+, 32), 244 (15), 208 (13)
⑥ I-7 (1-[2-클로로-3,5-비스트리플루오로메틸]-3-[2,6-디플루오로-3-(2-에톡시카르보닐에틸)벤조일]우레아)의 합성
통상적인 방법에 따라 2,6-디플루오로-[2-(에톡시카르보닐)에틸]벤조일 이소시아네이트를 제조하기 위해 화합물 I-5를 신선하게 증류된 옥살릴 클로라이드와 반응시켰다. 다음, 사염화 탄소 중의 조 이소시아네이트의 용액을 사염화 탄소 중의 화합물 5의 교반 용액에 직접 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고, 용매를 감압 증류에 의해 제거하고, 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 생성물을 얻었다.
NMR (CDCl3); δ 1.21 (t, 3H), 2.61 (t, 2H), 2.97 (t, 2H), 4.10 (q, 2H), 6.98 (m, 1H), 7.43 (m, 1H), 7.70 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 11.43 (s, 1H)
⑦ I-8 (1-[2-클로로-3,5-비스트리플루오로메틸]-3-[2,6-디플루오로-3-(2-카르복시에틸)벤조일]우레아)의 합성
화합물 I-7 (0.3 g)의 가수분해 반응을 2 당량의 KOH와 함께 이소프로필 알코올 (30 mL)에서 수행하였다. 8시간 후에, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 수성상을 6 M HCl을 이용하여 pH 2로 산성화하고, 에틸 아세테이트 (3 × 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 이어서 Na2SO4로 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체(0.1 g)로서 합텐 I을 얻었다:
NMR (CDCl3); δ 2.65 (t, 2H), 2.97 (t, 2H), 7.12 (m, 1H), 7.61 (m, 1H), 9.08 (s, 1H), 10.79 (s, 1H), 11.53 (s, 1H).
2) 합텐 II 의 합성
① II-2 (2,6-디플루오로-3-니트로벤조산)의 합성
2,6-디플루오로벤조산 (I-1, 3.2g)에 질산 3ml 와 진한 황산 12ml를 얼음 욕조 안에서 천천히 적가하고, 2시간 동안 저어 주었다. 반응이 종결된 후, 물을 가하고 에틸 아세테이트 100ml로 2회 추출하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 목적 화합물 3.1g을 얻었다. (에 틸 아세테이트/메탄올 = 2:1)
GC-MS; m/z 203 (M+, 82), 186 (10), 173 (37), 153 (31), 140 (27), 125 (33), 112 (63), 101 (100), 63 (85)
② II-3 (2,6-디플루오로-3-니트로벤즈아미드)의 합성
화합물 II-2 2.5g을 과량의 티오닐클로라이드에 가하고 2시간 동안 가열 환류하였다. 가열 환류 후 용매를 감압 건고 후 잔사에 차가운 포화암모니아 용액을 얼음 욕조안에서 가하였다. 10분간 격렬하게 흔든 후, 생성된 고체를 여과하고 포화 암모니아 용액을 세척 후 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 목적 화합물 2.3g을 얻었다 (에틸 아세테이트/헥산 = 1:2)
GC/MS; m/z 202 (M+, 90), 186 (100), 140 (87), 112 (67)
③ II-4 (1-[2-클로로-3,5-비스트리플루오로메틸]-3-[2,6-디플루오로-3-니트로벤조일]우레아)의 합성
화합물 II-3 1.0g을 50ml 플라스크에 넣은 후, CCl4 30ml를 가하고, 옥살릴 클로라이드 2ml를 적가한 후, 12시간 이상 환류하였다. 반응이 종결된 후, 감압 증류하여 용매와 옥살릴 클로라이드를 날려 버린 후, 클로로포름 10ml에 재용해하였다. 화합물 I-6 800 mg을 클로로포름 10ml에 녹여서 천천히 적가하고 1시간 동안 저어 주었다. 용매를 감압 건고 후 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 목적 화합물 653 mg을 얻었다. (에틸 아세테이트/헥산 = 1:7)
④ II-5 (1-[2-클로로-3,5-비스트리플루오로메틸]-3-[2,6-디플루오로-3-아미 노벤조일]우레아)의 합성
화합물 II-3 0.5g 과 PtO2 0.5g을 100ml 플라스크에 넣어 에틸 아세테이트 30ml에 녹인 후, 수소를 풍선으로 버블링하였다. 더 이상의 수소가 흡수되지 않으면 셀라이트로 여과 후 감압 증류하여 칼럼 크로마토그래피로 분리하였다. (에틸 아세테이트/헥산 =1:3)
LC-MS; m/z 462 ([M+H]+, 100), 464 (34), 426 (19), 263 (18), 173 (54), 156 (31)
3) 합텐 III 의 합성
① III-1 의 합성
합텐 II 500mg과 에틸 4-클로로-4-옥소 부티레이트 370mg을 에틸 아세테이트 20ml에 녹인 후 물 20ml에 K2CO3 300mg을 녹여서 가하였다. 4 시간 동안 저어준 후, 에틸 아세테이트 층을 취하여 무수 Na2SO4로 탈수 감압 건고하였다. 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 목적 화합물 570mg을 얻었다.
② 합텐 III의 합성
III-1 500mg과 LiOHH2O 50mg을 이소프로판올 20ml에 녹인 후 반응 종결시까지 저어 주었다. 반응 종결 후 1N HCl로 pH2로 맞춘 후, 에틸 아세테이트 50ml로 2회 추출하였다. 추출 후 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 목적 화합물 230mg을 얻었다.
LC-MS; m/z 562 ([M+H]+, 100), 544 (25), 462 (20), 263 (37)
4) 합텐 IV 의 합성
① IV-1 의 합성
I-6 500mg과 메틸 4-클로로-4-옥소 부티레이트 370mg을 에틸 아세테이트 20ml에 녹인 후 물 20ml에 K2CO3 300mg을 녹여서 가하였다. 4 시간 동안 저어준 후, 에틸 아세테이트 층을 취하여 무수 Na2SO4로 탈수 감압 건고하였다. 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 목적 화합물 220mg을 얻었다.
NMR (CDCl3); δ 1.21 (t, 3H), 2.81 (m, 4H), 4.16 (q, 2H), 7.69 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.96 (s, 1H).
GC-MS; m/z 377 (M+, 3), 346(10), 322(5), 263(8), 115(100), 87(19), 55(48)
② 합텐 IV의 합성
IV-1 100mg과 LiOHH2O 30mg을 이소프로판올 20ml에 녹인 후 반응 종결시까지 저어 주었다. 반응 종결 후 1N HCl로 pH2로 맞춘 후, 에틸 아세테이트 50ml로 2회 추출하였다. 추출 후 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 목적 화합물 70mg을 얻었다.
NMR (CDCl3); δ 2.83 (m, 4H), 7.69 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.98 (s, 1H).
GC-MS (TMS) m/z 435 (M+, 0.3), 420 (10), 263 (100), 173 (34), 101 (90), 73 (84), 55 (54)
5) 합텐 V 의 합성
① V-1 의 합성
I-6 500mg과 메틸 4-클로로-4-옥소 헥사노에이트 370mg을 에틸 아세테이트 20ml에 녹인 후 물 20ml에 K2CO3 300mg을 녹여서 가하였다. 4 시간 동안 저어준 후, 에틸 아세테이트 층을 취하여 무수 Na2SO4로 탈수 감압 건고하였다. 칼럼 크로마토 그래피로 분리하여 목적 화합물 57mg을 얻었다.
NMR (CDCl3); 1.78 (m, 4H), 2.39 (t, 2H), 2.53 (t, 2H), 3.70 (s, 3H), 7.68 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 9.00 (s, 1H).
GC-MS; m/z 405 (M+, 3), 374(12), 350(8), 263(14), 143 (55), 111 (100), 55(83)
② 합텐 V의 합성
V-1 50mg과 LiOHH2O 20mg을 이소프로판올 20ml에 녹인 후 반응 종결시까지 저어 주었다. 반응 종결 후 1N HCl로 pH2로 맞춘 후, 에틸 아세테이트 50ml로 2회 추출하였다. 추출 후 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 목적 화합물 33mg을 얻었다.
NMR (CDCl3); δ 1.21 (t, 3H), 1.70 (d, 3H), 4.20 (q, 2H), 4.79 (q, 1H), 6.81-8.18 (m, 10H), 9.21 (s, 1H).
GC-MS (TMS); m/z 463(M+, 0.3), 448 (13), 412 (8), 263 (7), 201 (43), 111 (100), 73 (42)
실시예
2:
합텐
-
담체
단백질 결합
1) 합텐 I, III, IV, V 와 단백질 결합
COOH 작용기를 포함한 합텐과 1.1 당량의 N-히드록시숙신이미드, 1.3 당량의 DCC를 DMF 1ml에 녹인 후 밤새 저어 주었다. 원심분리하여 우레아 침전을 제거하고, pH9.0 완충용액에 녹아 있는 단백질(KLH, BSA, OVA)에 0.5m씩 천천히 적가하였다. 12시간 동안 저어준 후, PBS 용액을 하루에 2회씩 갈아주면서 3일 동안 투석하 였다.
2) 합텐 II 와 단백질 결합
NH2 작용기를 포함한 합텐 II 10mg 과 BSA 15mg을 2.5 ml의 PBS:디옥산 = 2:1 용액에 용해시켰다. 이 용액에 25% 글루타릭 디알데히드 200ul를 가하여 5시간 동안 4℃에서 저어 주었다. 반응 용액을 Sephadex G 25 (2g)을 이용하여 탈염 후, PBS 용액을 하루에 2회씩 갈아주면서 3일 동안 투석하였다. 결합에 사용한 단백질과 합텐의 양을 표 1에 나타내었다.
표 1. 합텐-단백질 결합 반응
| 합텐(mg) | 단백질(mg) | 합텐(mg) | 단백질(mg) | ||
| I-KLH | 20 | 20 | IV-BSA | 16 | 50 |
| I-BSA | 20 | 20 | V-BSA | 17 | 50 |
| II-BSA | 10 | 15 | I-OVA | 5 | 50 |
| III-BSA | 23 | 50 |
3) 합텐과 단백질 결합의 확인
0.5mg/ml 농도의 단백질 (BSA, KLH)와 합텐-단백질 복합체 1.0mL에 0.05M pH9.6 탄산염 완충액 1.0mL를 가하고 1.0mL의 0.1% TNBSA (트리니트로벤젠술폰산) 용액을 가하였다. 40℃에서 2시간 반응시킨 후, 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) 용액 1.0 ml를 가하고, 1M HCl 용액 1mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응 용액의 흡광도를 335nm에서 측정하고 아래의 식에 의하여 단백질에 결합된 합텐의 비율을 구하였다.
커플링 밀도 (coupling density) = (유리 단백질 흡광도 - 합텐 복합된 단백질 흡광도)/(단백질 흡광도)*100
표 2. 합텐-단백질 결합 농도
| 항원 | 커플링 밀도 (%) | 항원 | 커플링 밀도 (%) |
| I-KLH | 88.82 | IV-BSA | 81.75 |
| I-BSA | 98.15 | V-BSA | 79.34 |
| II-BSA | 73.22 | I-OVA | 34.31 |
| III-BSA | 75.56 |
실시예
3: 항혈청 생산 및
역가
검정
1) 항혈청의 생산/역가 검정
합텐과 결합된 단백질의 양은 Bradford 법으로 정량하여(표 3) 다음 실험에 사용하였다.
표 3. 합텐-단백질 복합체의 단백질 농도
| 항원 | 단백질(mg/ml) | 항원 | 단백질(mg/ml) |
| I-KLH | 1.9 | IV-BSA | 3.36 |
| I-BSA | 3.4 | V-BSA | 2.70 |
| II-BSA | 0.78 | I-OVA | 6.56 |
| III-BSA | 1.64 |
합텐 I-KLH 결합물(I-KLH) 0.5mg이 녹아있는 PBS 용액을 프로인트완전아주번트 용액과 1:1로 혼합하여 유화액을 조제하고 2~4kg 토끼의 등 부위에 15∼20 군데 나누어서 주사하였다. 토끼는 각 항원당 2마리씩 사용하였다.
부스팅 주사시에는 합텐 I-KLH 결합물(I-KLH) 0.2mg이 녹아있는 PBS 용액을 프로인트불완전아주번트에 1:1로 혼합하여 유화액을 주사하고 최초 주사와 같은 방법으로 2주 간격으로 주사하였다.
주사 1주일 후 귀 정맥에서 혈액을 채취하여 항체 생성을 확인하고, 충분한 역가가 나타날 때까지 항원을 주사하였다.
5번째 주사 후 심장 천자(heart puncture) 방법으로 혈액을 채취하였다.
2) 항혈청의 분리
채취한 혈액을 냉장고에서 하루 정도 응고시킨 후, 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하여 사용시까지 -70℃에서 냉동보관하였다.
3) 항체의 순수 분리
항체를 순수 분리하기 위하여 PIERCE사의 단백질 A Immunoglobulin 정제 키트를 사용하였다.
키트를 실온에서 안정화시킨 후, 결합 완충액 5ml를 흘려주어 평형화시켰다. 결합 완충액과 1:1로 희석한 혈청을 로딩하고 결합 완충액 15ml로 씻어 주었다. 5ml의 용출 완충액으로 용출시켰다.
각 분획을 280nm에서 흡광도를 측정하고 흡광이 있는 E3-E5 부분을 합하여 다음 실험에 사용하였다. 도 1은 단백질 A 칼럼을 이용하여 합텐 I-KLH 결합물(I-KLH)에 대한 항체를 정제하는 것을 나타내는 그래프이다.
E3-E5 부분을 합한 분획을 SDS-PAGE한 결과, 정제 후 항체의 경쇄와 중쇄의 밴드가 나타남으로써 항체가 순수하게 분리되었음을 확인할 수 있었다. 도 2는 분리된 항체의 SDS-PAGE 결과이다. 도 2의 A는 2마리 토끼 중 토끼 1에 대한 것이며, B는 토끼 2에 대한 것을 나타낸다.
4) 체크 보드 적정(check board titration)
ELISA에 필요한 코팅 항원과 항혈청의 희석 배수를 결정하기 위하여 비경쟁 간접 ELISA에 의해 다음의 과정으로 측정하였다.
① 0.1M 카보네이트-비카보네이트 완충액 (pH 9.6)에 녹여 희석한 (1㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.1㎍/ml, 50ng/ml) 코팅 항원 100㎕를 마이크로플레이트의 웰에서 인큐베이션시켰다(4℃, 12시간 이상).
② PBST(10mM 인산염수 + 0.05% Tween 20) 100㎕로 5회 세척하였다.
③ 1% BSA/PBS 100㎕를 첨가하여 블록킹시킨 후(37℃, 1시간), PBS로 희석한 항혈청(1:1,000, 1:2,000, 1:4,000, 1:8,000, 1:16,000, 1:32,000, 1:64,000, 1:128,000) 50㎕를 웰에 넣어 인큐베이션시켰다(37℃, 1시간).
④ PBST로 5회 세척하였다.
⑤ PBST로 희석한(1:10,000) 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 염소 항-토끼 IgG 용액 100㎕를 넣어 인큐베이션시켰다(37℃, 1시간).
⑥ PBST로 5회 세척하였다.
⑦ 포스페이트-시트레이트 완충액 (pH 5.0)에 녹아 있는 효소기질 o-페닐렌디아민 (OPD)(0.4mg/ml) 100㎕를 넣은 후 37℃에서 30분간 반응시켰다.
⑧ 4N H2SO4 용액 50㎕를 넣어 반응을 중단시킨 후 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
하기 표 4는 체크 보드 적정 결과를 나타낸 것이다.
표 4. 체크 보드 적정 결과
| 1-KLH | |
| I-BSA | +++ |
| II-BSA | +++ |
| III-BSA | + |
| IV-BSA | + |
| V-BSA | +++ |
| +++: O.D.>1.0, ++: 1.0 > O.D. > 0.5, +: 0.5 > O.D. 코팅 항원: 100ng/웰, 1:4,000배 희석된 항혈청. | |
실시예
4: 분석방법 최적화
1) 간접경쟁 ELISA법
비스트리플루론에 대한 민감도와 표준직선을 확인하기 위하여, 실시예 3-4)에서 확인한 코팅 항원과 항혈청의 희석배수로 간접경쟁 ELISA법을 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
① 0.1M 카보네이트-비카보네이트 완충액 (pH 9.6)에 녹여 희석한 (I-BSA) 코팅 항원 100㎕를 마이크로플레이트의 웰에서 인큐베이션시켰다 (4℃, 12시간 이상).
② PBST(10mM 인산 염수 + 0.05% Tween 20) 100㎕로 5회 세척하였다.
③ 1% BSA/PBS 100㎕를 첨가하여 블록킹시킨 후(37℃, 1시간), PBST에 희석한 비스트리플루론 표준용액(100ppm~1ppt) 50㎕ 와 PBS로 희석한 항혈청(1:100) 50㎕를 웰에 넣어 인큐베이션시켰다 (37℃, 1시간).
④ PBST로 5회 세척하였다.
⑤ PBST로 희석한(1:10,000) 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 염소 항-토끼 IgG 용액 100㎕를 넣어 인큐베이션시켰다 (37℃, 1시간).
⑥ PBST로 5회 세척하였다.
⑦ 포스페이트-시트레이트 완충액 (pH 5.0)에 녹아 있는 효소기질 OPD(0.4mg/ml) 100㎕를 넣은 후 37℃에서 30분간 반응시켰다.
⑧ 4N H2SO4 용액 50㎕를 넣어 반응을 중단시킨 후 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
위의 실험법으로 비스트리플루론을 PBST에 희석하고 I-BSA를 코팅 항원으로 사용하여 실험한 결과, 비스트리플루론에 대하여 IC50이 약 1.5ppm으로 친화도가 낮았다.
2) 합텐 I-BSA 복합체를 코팅 항원으로 사용한 간접경쟁 ELISA
I-BSA (2.5 ng)이 코팅되어 있는 플레이트와 1종의 다클론 항체와 3종의 단클론 항체를 이용하여 간접경쟁 ELISA를 실시하였다. 도 3은 코팅 항원으로서 I-BSA를 이용하고, 항혈청으로서 I-KLH를 이용한 다클론 항체의 간접경쟁 ELISA 결과를 나타낸다. 1종의 다클론 항체를 이용하여 수행한 결과, 다클론 항체의 IC50 값은 토끼 1 및 2에 대해 각각 1.39 및 1.32이었다. 이렇게 낮은 민감도의 원인은 항체와 코팅 항원과의 친화력이 항체와 화합물과의 친화력보다 크기 때문이다. 민감도를 높이기 위해서는 항체와 코팅 항원과의 친화력을 낮추기 위해 코팅 항원을 바꾸는 방법이 주로 이용된다. 따라서 코팅 항원의 종류를 바꿔 실험을 실시하였다.
3) 여러 가지 코팅 항원을 이용한 간접경쟁 ELISA
II-BSA, III-BSA, V-BSA (50ng)이 코팅되어 있는 플레이트를 이용하여 1종의 다클론 항체와 3종의 단클론 항체를 이용하여 간접경쟁 ELISA를 수행하였다. 도 4는 다양한 코팅 항원을 이용한 다클론 항체의 간접경쟁 ELISA 결과를 나타낸다. 여러 가지 코팅 항원을 이용하여 간접경쟁 ELISA를 수행한 결과, II-BSA 및 V-BSA 를 코팅 항원으로 이용한 다클론 항체의 IC50 값이 각각 0.733 및 0.793으로 낮았다. 따라서 이 둘 중 안정된 흡광도 값을 나타내고, 백그라운드 값이 낮게 나오는 V-BSA 코팅 항원을 이용하여 다음의 실험을 수행하였다.
4) 블록킹 시약의 영향
다양한 블록킹 시약들의 효과를 알아보기 위하여, V-BSA (50ng)이 코팅되어 있는 플레이트에 1% 오발부민(OVA), 어류 젤라틴, 탈지분유를 PBS 용액에 조제한 블록킹 용액으로 블록킹하고 간접경쟁 ELISA를 수행하였다. 도 5는 간접경쟁 ELISA에 대한 다양한 블록킹 시약의 효과를 나타낸 것이다. 그 결과, OVA가 가장 높은 흡광도 값을 나타내었고, 탈지분유가 가장 낮은 흡광도를 보였다. 그러나 OVA는 백그라운드 흡광도도 높은 값을 보였다. 따라서, 본 발명에서는 어류 젤라틴을 블록킹 시약으로 사용하였다.
5) 용매 종류 및 농도의 영향
용매의 종류와 농도의 영향을 알아보기 위하여, V-BSA (50ng)이 코팅되어 있는 플레이트에 비스트리플루론 표준용액 제조 용매로서 메탄올 및 아세톤을 사용하여 각각의 용매 농도 5%(5% 유기용매-10mM PBS), 10%, 및 25%를 사용하여 간접경쟁 ELISA를 수행하였다. 도 6 및 도 7은 각각 간접경쟁 ELISA에 대한 아세톤 및 메탄올의 영향을 나타낸 결과이다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 아세톤의 함량이 높아질수록 흡광도 값은 0.54에서 0.25까지 줄어들고 IC50 값은 0.42ppm에서 0.04ppm 으로 감소하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 메탄올 함량이 증가함 에 따라 흡광도 값은 거의 변함이 없었고, IC50 값은 특별한 경향이 없었다. 비스트리플루론 ELISA는 용매의 영향을 많이 받는 것으로 확인되었다.
6) 완충액 pH의 영향
V-BSA (50ng)이 코팅되어 있는 플레이트에 다양한 pH 즉, pH5, 6, 7, 8, 9, 10의 PBS 용액으로 조제한 비스트리플루론 표준용액을 사용하여 간접경쟁 ELISA를 수행하였다. 도 8은 간접경쟁 ELISA에 대한 pH의 영향을 나타낸 것이다. 그 결과, 비스트리플루론 ELISA는 좁은 pH 영역 (pH7~pH8)에서 안정한 것으로 확인되었다.
7) 완충액 이온 농도의 영향
V-BSA (50ng)이 코팅되어 있는 플레이트에 완충액의 이온 강도가 5, 10, 20, 40mM인 PBS 용액으로 조제한 비스트리플루론 표준용액을 사용하여 간접경쟁 ELISA를 수행하였다. 도 9는 간접경쟁 ELISA에 대한 이온 농도의 영향을 나타낸 것이다. 그 결과, 흡광도 값은 이온 농도가 증가할수록 감소하였고, IC50 값은 감소하다가 20mM 후에는 안정적인 값을 보였다. 비스트리플루론 ELISA는 이온 농도에 영향을 많이 받는 것으로 확인되었다.
8) 세제(detergent)의 영향
간접 경쟁 ELISA에 미치는 세제의 영향을 살펴보기 위하여, V-BSA (50ng)이 코팅되어 있는 플레이트에 다양한 Tween 20 농도 즉, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4%의 PBS 용액으로 조제한 완충액에서 비스트리플루론 표준용액을 사용하여 간접경쟁 ELISA 를 수행하였다. 도 10은 간접경쟁 ELISA에 대한 Tween 20의 영향을 나타낸 것이다. 그 결과, Tween 20은 비스트리플루론 ELISA에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
9) ELISA의 최적화
위의 실험에서 정해지는 조건으로 최적화시켜 비스트리플루론에 대한 검량 곡선을 수립한다. ELISA의 민감도를 나타내는 IC50은 최대 흡광도를 50% 저해시키는 분석물질의 농도를 의미하며, 본 발명에서 제시된 이 값은 다음 식에 의해서 얻어진 것이다.
y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D
여기서 A는 최대 흡광도, B는 직선의 기울기, C는 IC50 그리고 D는 최소흡광도를 나타낸다.
25% 아세톤, 0.05% tween을 함유한 pH7.5, 20mM 인산완충염수를 이용하여 간접경쟁 ELISA를 수행하여 검량 곡선을 수립하였다. 도 11은 최적화 조건에서의 표준 곡선을 나타낸다. IC50은 82ppb 이었고 분석가능 범위(IC20 ~ IC80)는 1.0ppb~500 ppb 이었다. 본 발명의 ELISA 분석법은 민감도가 높고 넓은 범위의 분석 범위를 보여줌을 확인하였다.
10) 교차반응성 연구
최적화된 비스트리플루론 ELISA로 비스트리플루론과 유사한 구조를 가진 농약들과, 같은 계열 농약들에 대하여 교차반응성을 조사하였다. 교차반응의 정도는 다음 식에 의해서 %로 나타낸다.
교차반응성(%) = (비스트리플루론의 IC50/기타 화합물의 IC50)*100
교차반응성이 높은 물질이 간섭하는 경우 실제 농도보다 높은 값을 나타내게 된다. 따라서, 벤조일페닐 우레아 계통 살충제와의 교차반응성을 확인하기 위해, 유사계통 농약과 비스트리플루론의 대사물인 2-클로로-3,5-비스트리플루오로메틸 아닐린(CBA)에 대하여 최적화 조건으로 ELISA를 실시하여 교차반응성을 확인하였다. 도 12는 교차반응성의 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, 다른 농약들에 대해서는 교차반응성이 없는 것으로 확인되어 선택성이 높은 것으로 확인되었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 비스트리플루론의 특정 합텐 화합물과 단백질이 결합된 복합체에 대한 항체를 이용함으로써 살충제 비스트리플루론을 신속하고 정량적으로 검출할 수 있다.
Claims (11)
- 살충제 비스트리플루론(bistrifluron)의 합텐 화합물과 단백질이 아미드 결합에 의해 결합된 복합체에 있어서,상기 비스트리플루론의 합텐 화합물이 하기 화학식 1의 화합물인 것을 특징으로 하는 복합체:<화학식 1>
[식 중,R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기 또는 탄소수 1 내지 10의 할로알킬기를 나타내고,R8은 아미노기 또는 카르복실기를 나타내며,X1 및 X2는 각각 독립적으로 탄소수 6 내지 20의 아릴렌기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타내며, 상기 아릴렌기에 존재하는 하나 이상의 수소 원자는 할로겐 원자로 치환되고,m은 0 내지 3의 정수를 나타내며, n은 1 내지 3의 정수를 나타낸다]. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 비스트리플루론의 합텐 화합물이 하기 합텐 I, II, III, IV 또는 V의 화합물인 것을 특징으로 하는 복합체:<합텐 I>
<합텐 II>
<합텐 III>
<합텐 IV>
<합텐 V>
- 제1항에 있어서, 상기 단백질이 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, 오발부민, 티로글로불린(thyroglobulin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제1항에 있어서, 살충제 비스트리플루론의 효소면역학적 분석에 이용되는 것 을 특징으로 하는 복합체.
- 하기 화학식 1의 구조를 갖는 비스트리플루론의 합텐 화합물:<화학식 1>
[식 중,R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기 또는 탄소수 1 내지 10의 할로알킬기를 나타내고,R8은 아미노기 또는 카르복실기를 나타내며,X1 및 X2는 각각 독립적으로 탄소수 6 내지 20의 아릴렌기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타내며, 상기 아릴렌기에 존재하는 하나 이상의 수소 원자는 할로겐 원자로 치환되고,m은 0 내지 3의 정수를 나타내며, n은 1 내지 3의 정수를 나타낸다]. - 제7항에 있어서, 상기 비스트리플루론의 합텐 화합물이 하기 합텐 I, II, III, IV 또는 V의 화합물인 것을 특징으로 하는 합텐 화합물:<합텐 I>
<합텐 II>
<합텐 III>
<합텐 IV>
<합텐 V>
- 제1항의 복합체에 반응하여 생성되는, 비스트리플루론에 특이적으로 결합하는 항체.
- 제1항의 복합체로 비인간 포유동물을 면역시키는 단계 및 상기 비인간 포유동물로부터 비스트리플루론에 특이적인 항체를 선발하는 단계를 포함하는, 비스트리플루론에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법.
- 제9항의 항체를 포함하는, 시료 중의 비스트리플루론을 검출하는 키트.
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