KR101515020B1 - 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는 면역학적 측정 방법 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정장치 - Google Patents

햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는 면역학적 측정 방법 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는, 면역학적 측정 방법 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면, 시료, 장치의 온도, 시료 주입량 및 성분, 장치의 다변성 등의 외부 요인들에 의해 변화된 시험 영역에서의 수치를 표준 영역에서도 반영하여 변화시켜 결과값을 보정하는 등 주변 환경을 반영하여 면역 분석에 이용할 수 있으며, 시료 속 물질과의 비-특이 반응을 유발할 가능성이 낮아 분석 오류를 최소화할 수 있다.

Description

햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는 면역학적 측정 방법 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정장치{IMMUNOASSAY USING REFERENCE ANTIBODY COMPRISING HAPTEN AND ANTIBODY BONDED THERETO AND IMMUNOLOGICAL ANALYZER USING THE REFERENCE ANTIBODY}
본 발명은 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는, 면역학적 측정 방법, 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치에 관한 것이다.
토끼 IgG 및 항-토끼 IgG를 레퍼런스 항체로 이용하는 기존의 면역학적 측정 방법은, 접합 영역(conjugate zone)에는 테스트하고자 하는 물질에 특이적으로 결합하는 프로브 및 토끼 항체에 특이적으로 결합하는 프로브를 고정하고, 시험 영역(test zone)에는 테스트하고자 하는 물질의 포획 항체를 고정하고, 표준 영역(reference zone)에는 항-토끼 항체를 고정해 둔 바이오칩을 이용하는 것으로서(국제특허공개 제WO2013/125855호), 상기 레퍼런스 항체를 이용하여 시료를 정량하는 경우에는 동일한 양의 시료를 주입한다고 할지라도 시료 내 존재하는 다량의 물질들에 의한 점도 및 성분 차이, 및 항-토끼 항체 등에 의한 비-특이반응 등과 같은 요인에 의하여 측정값이 달라질 수 있다. 또한, 기존의 레퍼런스 항체를 이용하면 시료를 주입할 때의 양에서도 오차가 발생할 수 있으며, 시료가 측정되는 환경에 의해 시료 및/또는 장치의 온도가 높거나 낮을 수 있기 때문에 시험 영역의 값이 매번 달라질 가능성이 있다. 뿐만 아니라, 앞서 언급한 요인들에 의하여 테스트 및 표준 영역에서의 항체 결합력도 달라질 수 있다.
한편, 햅텐은 그 자체로는 면역 반응을 유발하지 않아 체내에 항체가 존재하지 않는 물질로서, 체내에 존재하기 어려운 독성 성분의 햅텐을 사용할 경우 시료 내 비-특이반응이 거의 발생하지 않을 것이라 예상된다. 또한 햅텐에 대하여 친화도 상수가 서로 다른 항체는 다양한 온도에 대해서 항원 결합력이 다르다. 하지만 아직까지 이러한 특성의 햅텐에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 사용한 예는 없다.
이에 본 발명자들은 사용자 환경의 변수에 따른 결과값을 보완하고, 시료와의 비-특이반응을 감소시킴으로써 정량 측정의 정확성을 향상시킬 수 있는 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 포함하는 레퍼런스 항체를 포함하는 면역학적 측정 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 시료 정량의 정확성을 향상시킬 수 있는 면역학적 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 레퍼런스 항체를 이용하는 면역학적 측정 장치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는, 면역학적 측정 방법을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 포함하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치를 제공한다.
본 발명에 따르면, 시료, 장치의 온도, 시료 주입량 및 성분, 장치의 다변성 등의 외부 요인들에 의해 변화되는 시험 영역에서의 수치를 표준 영역에서도 반영하여 변화시켜 결과값을 보정하는 등 주변 환경을 그대로 반영하여 면역 분석에 이용할 수 있으며, 시료 속 물질과의 비-특이반응을 유발할 가능성이 낮아 분석 오류를 최소화할 수 있다.
도 1은 마이크로플루이딕스 기반 정량 분석 장치에서 분석 오차를 나타내는 요인을 나타내는 그림으로, 상기 요인에 의해 같은 사람의 혈액이 다른 검사 결과를 나타냄을 보여준다.
도 2는 아트라진에 대한 항체 친화도 분석 결과(ELISA)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 항-아트라진 항체 중 2번 항체의 표면 플라즈몬 공명법(SPR) 센소그램 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 항-아트라진 항체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것으로, SM은 사이즈 마커이고, R 및 NR은 각각 환원 및 비환원 조건을 의미한다.
도 5는 본 발명에 따른 항-아트라진 항체의 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 기존의 진단장비를 이용하여 측정한 TSH의 농도를 본 발명의 아트라진 항체 및 기존의 컨트롤 항체를 이용한 분석 장치에서 측정한 농도를 표현값으로 환산하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 항-아트라진 항체를 이용한 측정 온도에 따른 시그널 세기 값 및 T/R 비를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 기존의 항-토끼 항체를 이용한 측정 온도에 따른 시그널 세기 값 및 T/R 비를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 항-아트라진 항체들의 측정 온도에 따른 반응성을 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대해서 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 햅텐 및 이에 결합하는 항체(이하, 햅텐 항체로 지칭함)를 레퍼런스 항체로 이용하는, 면역학적 측정 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 항원-항체 반응을 이용하여 측정하고자 하는 테스트 물질의 양을 정확하게 측정하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따르면, 시료, 장치의 온도, 시료 주입량 및 성분, 장치의 다변성(variation) 등의 요인들에 의하여 발생되는 시험 영역에서의 오차만큼을 표준 영역에서도 반영하여 보정함으로써, 예를 들어, 시험 영역 시그널 세기 값/표준 영역 시그널 세기 값의 비율(이하, T/R 비)을 일정하게 유지시킴으로써 분석, 특히 정량 분석 오류를 최소화할 수 있다. 구체적으로, 동일한 사람의 시료라도 시료 내 존재하는 다량의 물질들에 의한 점도 및 성분 차이, 비-특이 반응, 시료 주입 시 양, 시료가 측정되는 환경 등과 같은 요인들에 의하여 측정되는 수치가 다르게 표현될 수 있는데, 본 발명의 면역학적 측정 방법은 외부 요인에 의해 변화된 시험 영역에서 측정된 수치를 표준 영역에서도 반영하여 변화시켜 T/R 비가 일정해지도록 한다.
또한, 본 발명에 따르면 시험 영역에서의 온도에 따른 항원-항체 결합 특성과 유사한 레퍼런스 항체를 사용자의 편의에 의해 자유롭게 선택가능하므로 진단하고자 하는 질병에 적합한 레퍼런스 항체의 구성을 가능하게 한다.
본 발명에서 햅텐은, 스스로는 면역 반응을 유도할 수 없지만 일단 캐리어 분자에 부착되면 면역 반응을 유도하는 저분자 유기 화합물로서, 본 발명에서는 제초제에 널리 쓰이는 아트라진(Atrazine, 화학명: 2-클로로-4-(에틸아미노)-6-(이소프로필아미노)-s-트리아진) 또는 이의 유도체를 사용할 수 있다.
상기 아트라진 유도체로는 예를 들어, 프로파진(propazine), 프로메트린(prometryn), 프로메톤(prometon), 시마진(simazine), 시메트린(simetryn), 이파진(ipazine), 트리에타진(trietazine), 시아노진(cyanazine) 또는 이들의 유도체 등을 들 수 있다.
본 발명에서는 일례로 아트라진을 햅텐으로 이용하고, 이에 결합하는 항체를 개발하여 레퍼런스 항체로 사용함으로써 시료의 정확한 정량 측정에 이용할 수 있다.
본 발명에서 햅텐에 결합하는 항체는, 통상적인 항체 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 항체의 제조에는 한외여과법, 유안 분획, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토 그래피 등의 농축 및 정제 방법을 적당히 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 항체는 파지 디스플레이(phage display)를 이용하여 아트라진에 특이적으로 결합하는 다양한 항체들을 개발한 뒤, 친화도 상수가 서로 다르고 온도에 대한 항원 결합력이 다양한 항체 라이브러리를 제작하여 이를 햅텐 항체로 사용할 수 있다. 이에 따라 본 발명에서는 실제 시료의 측정 시에는 시험 영역의 온도에 따른 반응성의 특성과 유사한 성질을 지닌 레퍼런스 항체를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 햅텐 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 햅텐 항체는 i) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, ii) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 iii) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3; 그리고 iv) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, v) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 vi) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 방법은, (1) 시료 중의 테스트 물질에 특이적으로 결합하는 프로브(test-probe) 및 햅텐 또는 햅텐 항체에 특이적으로 결합하는 프로브(reference-probe)가 함께 함침되어 있는 접합 영역; (2) 테스트 물질에 특이적으로 결합하는 항체(이하, 포획 항체)가 함침되어 있는 시험 영역; 및 (3) 햅텐 또는 햅텐 항체가 함침되어 있는 표준 영역에서의 반응에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 접합 영역은 시료 중의 테스트 물질에 특이적인 프로브(probe)와 햅텐에 특이적인 프로브가 혼재되어 함침되어 있다. 시료를 시료 투입구에 투입하면, 시료 중의 테스트 물질과 이에 특이적인 프로브가 결합하여 복합체를 형성한다. 이렇게 형성된 복합체는 전개막을 따라 시험 영역 및 표준 영역으로 전개된다.
상기 시료 중의 분석 대상이 되는 테스트 물질은 모든 포유 동물로부터 유래한 유기 물질이나 인위적으로 합성된 유기 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 테스트 물질은 약물, 독소, 단백질, 탄수화물, 핵산 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 테스트 물질은 갑상선 자극호르몬(TSH), 전립선 특이항원(PSA), 알파태아단백질(AFP), 크레아틴 인산효소(CK-MB), 트로포닌 아이(TnI), 미오글로빈(Myoglobin), 고민감도 C-반응단백(hsCRP), D-이합체(D-dimer), 황체호르몬(Testosteron), 또는 비타민 D(Vitamin D)일 수 있다.
또한, 상기 테스트 물질의 시료 형태는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 눈물, 침, 젖, 또는 세포 배양 상등액 등의 형태일 수 있다.
상기 프로브는 대상물의 계측 내지 탐사의 목적으로 사용되며, 특이 결합반응이 일어나면 형광 발광 등을 통하여 직접 또는 간접적으로 인식 또는 검출가능한 신호를 발생시킨다. 프로브에 의해 검출가능한 신호로는 스펙트로포토메트릭, 가시신호(visible signal), 전기화학신호, 기타 전기적으로 검출가능한 신호를 포함한다.
본 발명에서 시험 영역은 테스트 물질에 대한 포획 항체가 함침되어 있는 영역으로서, 시료 중의 테스트 물질이 여기에서 포획 항체와 결합된다. 구체적으로, 상기 접합 영역에서 얻어진 복합체가 시험 영역에 함침되어 있는 테스트 물질에 대한 포획항체와 결합함으로써 시그날을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 접합 영역에서 얻어진 프로브와 TSH의 복합체는 시험 영역에 함침되어 있는 항-TSH 항체와 결합하게 되고, 상기 결합 반응에 의해 프로브가 발광함으로써 시그날을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 표준 영역은 햅텐 또는 햅텐 항체가 함침되어 있다. 예를 들어, (1) 햅텐이 표준 영역에 함침되어 있는 경우, 접합 영역에서 햅텐 항체와 이에 특이적인 프로브가 결합하여 형성된 복합체가 햅텐과 결합하여 프로브가 발광함으로써 시그날을 나타내고, 또는 (2) 햅텐 항체가 표준 영역에 함침되어 있는 경우, 햅텐과 이에 특이적인 프로브가 결합하여 형성된 복합체가 햅텐 항체와 결합하여 프로브가 발광함으로써 시그날을 나타낼 수 있다.
상기 접합 영역, 시험 영역 및 표준 영역은 각각 시약을 함유할 수도 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 면역학적 측정 방법은 분석할 시료를 수용하고 반응이 이루어지는 마이크로 채널이 구비된 마이크로 칩을 이용할 수 있으며, 상기 마이크로 칩의 하판에 존재하는 마이크로 채널에는 접합 영역, 시험 영역, 표준 영역 및 반응 종료 영역이 순서대로 존재할 수 있다. 상기 접합 영역의 표면에는 시약과 검출하고자 하는 항원(예를 들면, TSH)에 특이적으로 결합하는 프로브; 및 햅텐 또는 햅텐 항체에 특이적으로 결합하는 프로브가 고정될 수 있고, 시험 영역 표면에는 시약과 검출하고자 하는 항원(예를 들면, TSH)에 특이적으로 결합하는 포획 항체가 고정될 수 있다. 또한, 표준 영역 표면에는 시약과 햅텐 또는 햅텐 항체가 고정될 수 있다.
분석할 시료를 샘플 주입구를 통해 마이크로 채널 내에 떨어뜨린 후, 마이크로칩을 분석 장치(예를 들면, 자동화 면역검사 장비)에 장착하면 마이크로 채널의 단면이 분석 장치의 광학 센서에 노출되어 형광 시그널을 전기적 시그널로 변환시킨다. 이어, 자동적으로 각 영역의 시그널을 계산하는 방식으로 검출 항원의 존재 여부 및 분석할 시료의 양이 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 포함하는 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 방법은, 보다 구체적으로, (1) 시료를 샘플 주입구를 통해 마이크로 채널 내로 주입하는 단계; (2) 접합 영역에서 시료 중의 테스트 물질과 이에 특이적인 프로브가 결합하여 테스트물질-프로브 복합체를 형성하고, 햅텐 또는 햅텐 항체에 특이적인 프로브가 결합하여 햅텐 또는 햅텐 항체-프로브 복합체를 형성하는 단계; (3) 상기 복합체가 전개막을 따라 시험 영역 및 표준 영역으로 전개되는 단계; (4) 시험 영역에서 상기 테스트물질-프로브 복합체와 테스트 물질에 대한 포획 항체가 결합하는 단계; (5) 표준 영역에서 상기 햅텐 또는 햅텐 항체-프로브 복합체가 햅텐 항체 또는 햅텐과 결합하는 단계; (6) 시그날 측정 단계; 및 (7) 시그날 분석 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 포함하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치를 제공한다.
상기 햅텐, 이에 결합하는 햅텐 항체 및 레퍼런스 항체는 앞서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서 상기 면역학적 측정 장치는, 모세관 힘, 마이크로 채널, 크로마토그래피 또는 나이트로셀룰로스 막을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 면역학적 측정 장치는 레퍼런스 항체(햅텐 항체)를 포함하는 마이크로 채널이 구비된 마이크로 칩을 이용할 수 있으며, 상기 마이크로 채널은 (1) 시료 중의 테스트 물질에 특이적으로 결합하는 테스트 프로브, 및 햅텐 또는 햅텐 항체에 특이적으로 결합하는 레퍼런스 프로브가 함께 함침되어 있는 접합 영역; (2) 테스트 물질에 특이적으로 결합하는 포획 항체가 함침되어 있는 시험 영역; 및 (3) 햅텐 또는 햅텐 항체가 함침되어 있는 표준 영역을 포함할 수 있다.
본원에서 "항체"는, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 항체는 동물 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 단편, 예컨대, Fab도 포함한다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 아트라진-캐리어 동물 면역
본 발명에서는 사람 체내에 존재하지 않고 면역 반응을 유발하지 않아 체내에 항체가 존재하지 않는 햅텐으로서 아트라진(Biocell)에 대한 다양한 항체를 개발한 뒤, 친화도 상수가 다르고 온도에 대한 항원 결합력이 다양한 항체 라이브러리를 구축하였다.
먼저, 아트라진에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 이 라이브러리는 동물에 아트라진-캐리어 단백질(키홀 리펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin, KLH) 또는 오브알부민(Ovalbumin, OVA))을 면역한 후, 면역 세포로부터 mRNA를 얻은 후, 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 통해 항체 유전자를 증폭시키고 파지 디스플레이를 위한 벡터 내로 클로닝하는 방식으로 수행되었다.
구체적으로, 화이트 레그혼 종의 닭 3마리에 아트라진-KLH 또는 아트라진-OVA (BioSell, 미국) 100 ug를 완전 프로인트 면역증강제 (complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 면역증강제(Sigma, 미국)와 1:1로 혼합하여 번갈아 가며 3주 간격으로 마리당 0.5ml를 4회 피하 주사하였다.
면역한 동물로부터 혈청을 얻은 후, 상기 혈청을 PBSB(3% BSA를 포함하는 PBS)를 이용하여 1:100, 1:500, 1:2,500, 1:12,500 및 1:62,500의 농도로 희석하여 보관한 후, 면역에 사용되지 않은 아트라진-BSA를 이용하여 아트라진에의 결합 여부를 효소 면역 측정법(ELISA)으로 확인하였다. 방법은 ELISA 플레이트에 아트라진-BSA 1ug/ml을 넣어 4℃에서 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBST (0.1% tween 20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 항-닭 면역글로불린-HRP (horse radish peroxidase)를 1:2,000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS (Thermo, 미국) 50 μL을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청 대비 면역 후 아트라진-BSA와 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.
실시예 2. 항체 라이브러리 제작
(2-1) cDNA 합성
상기 실시예 1에서 마지막 피하 주사 후 5일 후에 선별된 닭의 골수, 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 상기에서 수득한 조직을 10ml 트리졸(Trizol, Invitrogen, 미국)과 혼합하여 호모게나이저로 분쇄하고, 20ml 트리졸을 추가한 후 3500 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모-3-클로로프로판(1-bromo-3-chloropropane, BCP, 시그마, 미국) 3ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액에 이소프로판올 15ml을 넣어 total RNA를 침전시킨 후 원심 분리하여 얻었다.
상기에서 수득한 total RNA를 Oligo dT를 프라이머로 이용하고 수퍼스크립트 전사 시스템 (Invitrogen, 미국)을 이용하여 역전사 반응 (65℃에서 5분, 4℃에서 5분, 50℃에서 50분, 85℃에서 5분)을 수행하였다. 상기 역전사 반응의 결과물인 cDNA를 포함하는 반응액 2μl를 1% 아가로스 젤에 로딩하여 전기 영동하여 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다.
(2-2) 항체 유전자 증폭
상기 2-1에서 얻은 cDNA로부터 닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 VH와 VL 를 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 실시예 2-1에서 합성한 cDNA를 주형으로 하여, VH와 VL 도메인을 먼저 증폭하고 이들 각각을 정제한 후 PCR을 통해 VH와 VL을 연결하여 scFv (single chain Fv)를 제작하였다.
구체적으로, 상기 2-1에서 얻은 cDNA 라이브러리 0.5μl, 하기 표 1에 개시된 VH와 VL 도메인에 대한 각각의 순방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 9 및 10, 및 서열번호 11 및 12) 30 pmole, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시켰다. 이어, 94℃에서 15초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 90초간 반응시키는 과정을 30사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 이어, 상기 PCR로 증폭된 항체 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트 (Gel extraction kit, 엘피스, 한국)를 이용하여 정제하였다.
한편, scFv DNA를 얻기 위해, 정제된 VH 50ng 및 VL 50ng DNA를 주형으로 하여 하기 표 1에 개시된 scFv 순방향 및 역방향 프라이머 (서열번호 13 및 14) 30 pmole, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시켰다. 이어, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 2분간 반응시키는 과정을 20사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(엘피스, 한국)를 이용하여 정제하였다.
PCR 반응에 사용된 프라이머
구분 프라이머 서열 서열번호
VH 정방향 GGT CAG TCC TCT AGA TCT TCC GGC GGT GGT GGC AGC TCC GGT GGT GGC GGT TCC GCC GTG ACG TTG GAC GAG 9
역방향 CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GGA GAC GAT GAC TTC GGT CC 10
VL 정방향 GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TC 11
역방향 GGA AGA TCT AGA GGA CTG ACC TAG GAC GGT CAG G 12
scFv 정방향 GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG 13
역방향 GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GG 14
(2-3) 항체 라이브러리 제작
상기 2-2에서 제조된 scFv DNA와 파지미드 벡터인 pComb3X (the Scripps Research Institute, 미국)를 제한효소 SfiI (Roche, 미국)로 절단하였다.
구체적으로, 상기 2-2에서 제조된 scFv를 코딩하는 PCR 절편 10ug, 360 units SfiI 및 20ul 10x 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤새 반응시켰다. 또한, pComb3X 벡터 20ug, 120 units SfiI 및 20ul 10x 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤새 반응시켰다. 상기에서 제한 효소로 절단한 각각의 절편을 1% 아가로스 젤에 전기 영동한 후 겔 추출 키트 (엘피스, 한국)를 이용하여 정제하였다.
scFv 절편을 pComb3X 벡터에 삽입하기 위하여, 상기에서 제한효소 SfiI를 이용하여 절단한 scFv 절편 700ng과 pComb3X 벡터 1.4ug을 혼합하고, T4 DNA 라이게이즈 (Invitrogen, 미국)를 첨가하여 16℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 라이게이션 혼합물을 2배 부피의 에탄올과 0.3M 아세테이트 나트륨을 이용한 에탄올 침강법으로 정제하고, 대장균 ER2738 (New England Biolab, 미국)에 전기 천공법 (electroporation)으로 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 대장균을 50ug/ml 카베니실린 및 70ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 1x109 complexity를 가진 라이브러리를 제작하였다.
실시예 3. 항-아트라진 항체 선별
상기 실시예 2에서 수득한 scFv의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 아트라진에 결합하는 항체를 고체에 지지된 아트라진-BSA를 이용하여 선별하였다.
(3-1) 아트라진에 결합하는 scFv를 포함하는 파지 선별
먼저, 마그네틱 비드에 아트라진-BSA 3μg을 컨쥬게이션시켰다.
또한, 상기 2-3에서 제작한 라이브러리를 포함하는 대장균에 100ug/ml 카베니실린, 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지 (1:1,000, Stratagene, 미국)를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파지의 증식을 유도하였다. 상기 대장균 배양물을 원심 분리하여 상층액만을 회수하여 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 침전된 파지를 모아 PBS로 재현탁하였다.
상기에서 얻은 항체 라이브러리를 발현하는 파지와 마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 아트라진-BSA를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 아트라진에 친화력을 가진 파지를 결합시킨 후, 이를 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고, 0.1M 글리신 (pH 2.2) 용액으로 용출하여 1M 트리스 (pH 9.0) 용액으로 중화시켰다(패닝(panning)). 용출된 파지는 다음 라운드 패닝을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시킨 후, 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 이용하여 회수하였다. 이와 같은 방법으로 패닝을 4차례 반복하여 진행하였으며 패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수를 증가시켜 결합력이 높은 파지를 축적하였다.
3차와 4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰 (deep well) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린, 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파지 (1:1000)를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파지의 증식을 유도하였다. 파지가 포함된 배양액을 얻은 후 아트라진-BSA를 이용하여 효소 면역 측정법(ELISA)를 시행함으로써 아트라진에 결합하는 항체 클론을 포함하는 파지를 확인하였다. 방법은 ELISA 플레이트에 아트라진-BSA 1ug/ml을 넣어 4℃에서 밤새 코팅한 후, PBST(0.1% Tween 20이 포함된 PBS)로 3회 세척하였다. 이어, 1% BSA (Sigma, 미국)가 포함된 PBS로 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 상기에서 얻은 파지가 포함된 배양액을 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후, HRP가 컨쥬게이션 되어 있는 항-HA(scFv에 결합되어 있는 헤마글루티닌 태그(hemagglutinin tag))를 1:2,000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS 100 μL을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)로 측정하였다. 아트라진-BSA에 대하여 양성 시그날을 나타내는 항체 클론을 포함하는 파지를 선별하였다.
(3-2) 선별된 항체의 시퀀싱
상기 3-1에서 선별한 아트라진에 양성 시그날을 나타내는 클론을 포함하는 ER2738 대장균을 SB 배지 (30g/L 트립톤, 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS, pH7.0) 로 밤새 배양한 후 원심 분리하여 형질전환 대장균을 얻었다. 이로부터 DNA 미니 프렙 키트 (진올, 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다.
염기서열 결정을 위해서는 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 ScFv 시퀀싱 프라이머를 이용하여 분석하였으며, 선별된 항체들은 숫자로 명명하였다. 또한, 실험에 사용한 항체 중 1번 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR의 구체적인 아미노산 서열 정보를 표 3에 나타내었다.
scFv 시퀀싱 프라이머
서열 서열번호
정방향 ACA CTT TAT GCT TCC GGC TC 15
역방향 CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG 16
실험에 사용한 항체 1종의 중쇄와 경쇄 CDR의 아미노산 서열
서열 서열번호
HCDR1 GFSIGDYGMG 3
HCDR2 SIRSDGSSTYYGSAVKG 4
HCDR3 DGVGWSATIDA 5
LCDR1 SGGGGSYG 6
LCDR2 YNNKRPS 7
LCDR3 GSTDIRSTPI 8
실시예 4. 항체의 생산
상기에서 선별된 항체의 친화도 및 특성 분석을 위하여, 닭 가변영역과 마우스 불변영역 (IgG2a subtype의 CH 및 Ck)이 결합된 키메릭 항체를 IgG 형태로 생산하였다.
먼저, 가변영역의 절편은 상기에서 scFv 시퀀싱을 위하여 얻은 scFv 유전자를 포함하는 pComb3x 플라스미드로부터 PCR을 통해 얻었다. 이때 중쇄와 경쇄의 가변영역 절편은 각각 하기 표 4에 기재된 서열번호 17 및 18, 및 서열번호 23 및 24의 프라이머의 조합을 이용하여 수득하였다.
불변영역의 절편인 CH와 Ck는 마우스 IgG2a의 CH 및 Ck를 포함하는 플라스미드를 주형으로 PCR을 통해 얻었다. 이때 CH와 Ck는 각각 하기 표 4에 기재된 서열번호 19 및 20, 및 서열번호 25 및 26의 프라이머 조합을 이용하여 수득하였다.
상기에서 수득한 가변영역과 불변영역을 하기 표 4에 기재된 서열번호 21 및 22의 프라이머 조합을 이용하여 중쇄 절편(HC)을 수득하고, 서열번호 23 및 24의 프라이머 조합을 이용하여 경쇄 절편(LC)을 수득하였다. 이때 PCR 조건은 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방식으로 수행하였다.
상기에서 얻어진 항체의 중쇄 및 경쇄의 DNA를 각각 pcDNA3.3TM-TOPO®TA 클로닝 키트 및 pOPTIVECTM-TOPO®TA 클로닝 키트 (Invitrogen, 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 즉, 중쇄와 경쇄 DNA를 각각 pcDNA3.3TM-TOPO® 벡터와 pOPTIVECTM-TOPO® 벡터 1ul와 섞은 후, 200 mM NaCl 및 10 mM MgCl2이 포함된 완충액에 총 6ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켜 라이게이션하였다. DH5a 대장균 경쟁세포(competent cell)에 열충격을 가하여 형질전환하고 콜로니를 얻은 후 SB 배지에서 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다.
상기에서 제조된 플라스미드를 HEK293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질주입한 후, 7일 동안 135rpm 및 8% CO2 조건 하에서 배양하여 배양액을 얻었다. 배양액 중의 항체를 단백질 A 컬럼 (GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체(IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH3.0)로 용출하고 인산염 버퍼로 중화하였다. 이후, SDS-PAGE를 통해 중쇄와 경쇄의 분자량이 이론적 값과 일치하는 것을 확인하였으며, 정제된 단백질의 높은 순도도 확인하였다.
구분 프라이머 서열 서열번호
VH 정방향 GCT AGC CGC CAC CAT GGG CTG GTC CTG CAT CAT CCT GTT CCT GGT GGC CAC CGC CAC CGG CGC CGT GAC GTT GGA CGA GTC CGG G 17
역방향 AGA TGG TGC GGT AGT TTT AGC GGA GGA GAC GAT GAC TTC 18
CH 정방향 GCT AAA ACT ACC GCA CCA TCT 19
역방향 GGA TCC CTT GCC GGC CGT CGC 20
HC 정방향 CTA GCT AGC CGC CAC CAT GGG 21
역방향 GAC ACC TAC TCA GAC AAT GC 22
VL 정방향 AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGC TGG TCC TGC ATC ATC CTG TTC CTG GTG GCC ACC GCC ACC GGC GCC CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG 23
역방향 CAC GGT TGG GGC TGC ATC GGC TAG GAC GGT CAG GGT TGT 24
Ck 정방향 GCC GAT GCA GCC CCA ACC GTG 25
역방향 TCT AGA CTA ACA CTC ATT TCT GTT 26
LC 정방향 CCC AAG CTT GCC GCC ACC ATG 27
역방향 GGA CAC CTA GTC AGA CAA AAT G 28
실시예 5. 친화도 분석
상기 실시예 4에서 얻어진 선별된 항체의 아트라진에 대한 친화도를 ELISA와 표면 플라즈몬공명법(SPR, Surface Plasmon Resonance)으로 분석하였다.
먼저 ELISA법으로 분석하기 위해 1ug/ml 아트라진-BSA를 96웰 면역 플레이트 (Corning, 미국)에 넣고, 4℃에 밤새 보관하여 플레이트 바닥을 코팅한 후, PBST (0.1% Tween 20이 포함된 PBS)로 3회 세척하였다. 이어, 1% BSA (Sigma, 미국)가 포함된 PBS로 37℃에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 3회 세척하고, 순차적 농도 (0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 및 100nM)로 희석한 각각의 항체를 웰 당 50μL씩 처리하였다. 항원에 항체가 결합할 수 있도록 37℃에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. 항-마우스 면역글로불린 Fc-HRP (Jackson, 미국)를 1:2000으로 희석하여 웰 당 50 μL씩 처리한 후, 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PBST로 3회 세척한 후, ABTS 50 μL씩 넣고 20분간 발색시켰다. 마이크로플레이트 리더 (Biotek, 미국)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2에서 보는 바와 같이, 아트라진에 대한 항체 친화도 분석 결과, 선별된 항체 클론이 아트라진에 대해 높은 친화도를 가지고 결합함을 알 수 있었다
한편, 선별된 항체의 아트라진에 대한 친화도를 또 다른 방법인 SPR로 분석하기 위해, 아트라진-BSA를 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE, 미국)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 커플링하였다. 결합 및 해리 속도 측정을 위해 Biacore®(GE, 미국) 기기에 아트라진-BSA가 커플링된 칩을 장착하고 각 클론의 항체 단백질을 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM, 3.13nM 및 1.56nM로 2배 연속 희석하여 주입하였다. 아트라진에 대한 항체의 결합 및 해리는 센소그램 (sensogram)으로 표시되고, 단순 일대일 랭뮈어 결합 모델 (BIAcore X100 평가 소프트웨어, 버전2.0)을 이용하여 결합속도상수와 해리속도상수를 계산하였다. 평형해리상수 (KD)는 해리 속도 상수 (Kd)를 결합 속도 상수 (Ka)로 나눈 값으로서, 실제 값을 계산한 결과 nM 이하로 높은 수준의 KD 값을 확인하였다.
클론들의 SPR 센소그램 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과, 높은 Kon, Koff 값을 가지며 항체 클론이 아트라진에 빨리 결합하고 천천히 떨어지는 것을 알 수 있었다.
실시예 6. 물리화학적 특성분석
선별된 항체의 물리 화학적 특성을 분석하였다.
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen, 미국)을 이용하여, 항체 단백질을 (1) 디티오트레이톨(DTT)을 처리하여 이황화 결합을 제거한 환원조건(R; reduced) 및 (2) DTT를 처리하지 않은 비환원 조건(NR; non-reduced)에서 준비한 후 각각 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동(SDS-PAGE)하였다. 겔 상에서 전기적 힘에 의해 분자량에 따라 분리된 단백질을 쿠마시 용액 (0.1% 쿠마시, 45% 메탄올, 10% 아세트산)을 이용하여 염색하였다. 본 발명에서 선별된 항체 11종의 중쇄와 경쇄 및 이들이 결합된 형태의 분자량 측정 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에서 보는 바와 같이, 환원 조건(R)에서 분석한 결과, 55 kDa 사이즈 마커와 20.1 kDa 사이즈 마커 부근에서 각각 1개의 주요 밴드가 관찰되었으며 이는 항체의 중쇄와 경쇄에 해당된다. 비환원 조건에서 분석한 검체는 116 kDa 사이즈 마커와 205 kDa의 사이즈 마커 사이에 1개의 주요 밴드가 관찰되며 이는 중쇄와 경쇄가 결합된 형태의 항체를 나타낸다. 또한, 항체의 중쇄와 경쇄 및 이의 결합 형태에 해당되는 밴드 외에 다른 밴드가 관찰되지 않으므로 정제된 단백질의 순도는 90% 이상으로 예상된다.
또한, 정제된 항체 단백질의 순도 분석의 일종으로 수용성 응집체 (soluble aggregate)의 정도를 TSK gel G3000SWxl 칼럼 (Tosoh, 일본)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피 (size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography, SE-HPLC)로 분석하여 그 결과를 도 5에 나타냈다. 100mM 인산염 완충액 (pH6.6)을 이동상으로 하여 등용매용리 방법으로 분리하고, 흡광도 280nm에서 모니터링 하였을 때 전체 피크면적대비 단량체의 피크면적의 비율은 평균 96%로 높은 순도를 나타냈고, 응집체 피크의 비율은 0% (4종), 4~8% (4종), 12.8% (1종)로 확인되었다.
실험예 1: 시료의 점도 차이에 의해 유발되는 결과값의 차이 보정
본 발명에서 이용한 혈액 시료는 강원대학교 의과대학 진단검사의학과에 의뢰한 환자의 혈청 시료를 이용하였으며, 환자군은 무작위로 선정되었다. 환자군은 갑상선 질환 환자로서, 갑상선 특이적 항원(Thyroid Stimulated Hormone, TSH)을 바이오마커로 하여, 자동화 면역검사장비(Access 2 analyzer, Beckman Coulter)를 이용하여 환자의 혈청 내에 존재하는 TSH의 양을 측정하였다. 이 중에서 농도는 같으나, 시료의 점도가 다른 시료 3개를 선별하고, 본 발명에 따른 면역학적 측정 장치에 적용하여 TSH 농도 측정을 실시하였다.
구체적으로, 마이크로칩의 샘플 주입구에 각각 혈청 시료 1 내지 3을 30uL의 양으로 각각 떨어뜨리고, 5분이 경과한 후 상기 마이크로칩을 측정 장치에 삽입하였다. 상기 측정장치는, 분석할 시료를 수용하고 반응이 이루어지는 마이크로채널이 구비된 마이크로 칩으로서, 마이크로 칩의 하판에 존재하는 마이크로 채널에 접합 영역, 시험 영역, 표준 영역 및 반응 종료 영역이 순서대로 존재하도록 제작하였다. 상기 접합 영역의 표면에는 TSH에 특이적으로 결합하는 프로브; 및 아트라진 또는 아트라진 항체에 특이적으로 결합하는 프로브를 고정시켰다. 시험영역 표면에는 시약과 TSH에 특이적으로 결합하는 포획 항체를 고정시켰다. 또한, 표준 영역 표면에는 시약과 아트라진 또는 아트라진 항체를 고정시켰다.
샘플 주입구를 통해 마이크로채널 내에 분석시료를 떨어뜨리고, 상기 마이크로칩을 측정 장치에 장착하면 마이크로채널의 단면이 분석장치의 광학 센서에 노출되어 형광시그널을 전기적 시그널로 변환시킨 후 각 영역의 시그널을 계산하는 방식으로 자동적으로 검출 항원의 존재 여부 및 TSH의 양이 측정된다.
마이크로 칩을 측정 장치에 삽입한 지 약 40초 후, 측정 장치의 디스플레이 화면에 샘플 내 TSH 양(정량적) 및 시험 영역과 표준 영역의 시그널 세기 값이 표시되었다. 상기 시험영역의 형광시그널 및 표준영역의 형광시그널은 각각 하기 수학식 1 및 2에 따라 측정되었으며, 시험영역과 표준 영역의 비율을 산출하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
[수학식 1]
Figure 112013103464916-pat00001
[수학식 2]
Figure 112013103464916-pat00002
상기 식들에서,
Xn = n 위치에서의 형광시그널이고;
Xtc = 시험영역 중앙지점의 형광시그널이고;
Xrc = 표준영역 중앙지점의 형광시그널이고;
Xb = 마이크로채널 0-900의 위치 중 최소 50 지점의 형광시그널 평균값, 0-900은 마이크로채널 내의 시그널 측정 영역을 일정간격으로 나눈 구획을 의미한다.
시험 영역 표준 영역 비율(T/R)
시료 1 60431 43987 1.374
시료 2 54177 41354 1.310
시료 3 35724 26763 1.335
시험 영역의 시그널만으로 보면 시료 1이 가장 높고 시료 3과 약 25000 차이가 나지만, 표준 영역의 시그널 세기로 나눈 비율 값을 비교하면, 세 개의 시료에 존재하는 TSH의 양은 동일한 것으로 확인되었다. 즉, 같은 농도의 시료라도 환자에 따라 피의 점도 차이가 존재하고, 이에 따라 시험영역에서의 시그널은 큰 폭으로 달라질 수 있다. 그러나 본 발명에 따른 면역학적 측정 장치에 따르면 표준 영역의 시그널 세기 역시 시험 영역에서 변화된 시그널을 반영하여 유사한 비율로 변화하게 되어 T/R 비가 일정해지므로 정확한 정량 분석이 가능하다.
실험예 2: 동일 샘플의 반복 측정을 통한 실험 환경 반영 검증
분석의 재현성을 확인하기 위하여, 시험 영역과 표준 영역의 시그널 세기, 및 T/R 비에서 발생하는 변동계수(coefficient of variation, CV, %) 값을 산출하였다. 변동계수는 표준편차/평균*100으로 계산하였으며, 평균 및 표준편차는 5번 반복 테스트한 결과로부터 산출하였다.
구체적으로, 대형 자동화 장비(Access 2 analyzer, Beckman Coulter)를 이용하여 환자의 혈청 내에 존재하는 TSH의 양을 측정한 것 중에서 TSH의 농도가 0.00uIU/mL로 측정되는 시료를 선별한 뒤, TSH를 5uIU/mL 및 100uIU/mL의 농도가 되도록 직접 첨가하여(Spiking) 시료 A 및 B를 제조한 후 실험에 사용하였다. 두 농도의 시료는 각각 5개의 마이크로칩에 주입한 후 분석을 실시하였다.
마이크로칩의 샘플 주입구에 혈청 시료 30uL를 떨어뜨리고 5분이 경과한 후 칩을 본 발명에 따른 면역학적 측정 장치에 삽입하였다. 약 40초 후 측정 장치의 디스플레이 화면에 샘플 내 TSH 양(정량적) 및 시험 영역과 표준 영역의 시그널 세기 값이 표시되었다. 또한 이를 이용하여 측정한 CV(Coefficient variation) 값을 하기 표 6에 나타내었다.
시료 A 시료 B
시험영역 표준영역 비율(T/R) 시험영역 표준영역 비율(T/R)
카트리지 1 15600 45870 0.340 211202 66017 3.199
카트리지 2 15637 48629 0.322 183114 60548 3.024
카트리지 3 19661 51810 0.379 148279 55952 2.650
카트리지 4 17018 47024 0.362 188573 60039 3.141
카트리지 5 21054 68214 0.309 144859 51085 2.836
CV(%) 13.82 17.53 8.43 16.10 9.49 7.62
표 6에서 보는 바와 같이, 시험 영역이나 표준 영역 각각의 시그널 차이가 발생하고 CV 값이 10%를 넘지만, T/R 비율을 계산하면 CV 값이 10% 미만으로 낮아짐을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 면역학적 측정 장치는 서로 다른 농도의 동일 시료를 반복하여 측정함으로써 실험자의 핸들링 오류 및 샘플 주입량의 미세한 차이와 장치의 다변성 등이 그대로 반영되어 항상 동일한 결과를 나타낼 수 있음을 보여주었다.
실험예 3: 시료의 농도에 따른 데이터의 비교
본 발명에 따른 아트라진 레퍼런스 항체 및 기존의 항-토끼 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 방법을 이용하여 상기 실험예 1에서 측정하여 혈청 내 TSH 농도를 미리 알고 있는, 검출 구간에 속하는 TSH 혈청시료 13개에 대한 시그널 세기 결과 값을 분석하였다.
마이크로칩의 샘플 주입구에 TSH 혈청시료 30uL를 떨어뜨리고 5분이 경과한 후 마이크로칩을 본 발명에 따른 면역학적 측정 장치에 삽입하였다. 약 40초 후 측정 장치의 디스플레이 화면에 샘플 내 TSH 양(정량적) 및 시험영역과 표준영역의 시그널 세기 값이 표시되었다.
한편, 기존의 항-토끼 레퍼런스 항체를 이용한 측정 방법은, 표준영역에 항-토끼 항체를 고정하고, 접합영역에는 TSH에 특이적으로 결합하는 프로브 및 항-토끼 항체에 특이적으로 결합하는 프로브(염소-항 토끼 항체)를 고정하는 형태로 제작한 마이크로칩을 이용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방식으로 수행하였다(국제특허공개 제WO2013/125855호 참고). 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
아트라진 항체를 이용한 측정 기존 항-토끼 레퍼런스 항체를 이용한 측정
TSH 농도 시험영역 표준영역 T/R 시험영역 표준영역 T/R
0 3025 66201 0.046 103 63356 0.002
0.32 4403 61931 0.071 2414 71066 0.034
1 15121 65789 0.230 4474 51907 0.086
1.5 26448 82746 0.320 5170 45527 0.114
2 29793 76689 0.388 10007 63647 0.157
3 56779 89275 0.636 12454 60564 0.206
3.38 31930 66310 0.482 10466 52429 0.200
5.37 53908 60230 0.895 21380 57541 0.372
6.68 53206 60901 0.874 21399 46373 0.461
10.16 65724 56800 1.157 42264 63195 0.669
13.25 113709 63342 1.795 56566 56710 0.997
16.31 126499 71101 1.779 57326 50438 1.137
24.52 155941 62522 2.494 95615 57430 1.665
표 7에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 아트라진 레퍼런스 항체를 이용하여 측정하는 경우, 시료의 농도가 증가함에 따라 각 영역의 시그널의 세기 및 T/R 비가 비례하여 증가하였다.
이에, 시험영역에만 특이적으로 반응하는 각 농도별 표준 물질을 사용하여 표준 농도 그래프(Standard Curve)를 미리 그린 후, 상기 그래프에 상응하는 함수에 해당 T/R 비를 대입하여 TSH 농도를 환산함으로써, T/R 비를 통한 시료 속 TSH 농도를 표현값으로 나타내었다. 대형자동화 기기와의 상관 관계를 그래프로 만들어 도 6에 나타내었다.
변수 사이의 관계를 분석하는 수단의 하나인 회귀분석은 회귀모형을 설정한 후 실제로 관측된 표본을 대상으로 회귀모형의 계수를 추정하여 변수 사이의 관계를 나타내 주는 선형 회귀식을 도출하는 과정을 거친다.
결정계수는 이와 같이 표본 관측으로 추정한 회귀선이 실제로 관측된 표본을 어느 정도 설명해 주고 있는지, 즉 회귀선이 실제관측치를 어느 정도 대표하여 그 적합성(goodness of fit)을 보여주고 있는가를 측정하는 계수로 나타낸 것인데, 이 값은 0과 1 사이의 값을 나타낸다. 이러한 결정계수는 두 변수 사이의 상관관계의 정도를 나타내는 상관계수(correlation coefficient, 일반적으로 r로 나타냄)를 제곱한 것과 같으며, 따라서 Rㅂ(R-Squared)로 표시한다. R2 = 1 일 경우 모든 표본 관측치가 추정된 회귀선 상에만 있다는 것을 의미하며 따라서 추정된 회귀선이 변수 사이의 관계를 완전히 설명해 주고 있음을 의미한다. 반면, R2 = 0 일 경우에는 추정된 회귀선이 변수 사이의 관계를 전혀 설명해 주지 못함을 의미한다.
도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 레퍼런스 항체를 이용하는 경우 R2 값이 0.9883으로, 토끼 IgG 및 항 토끼 항체를 이용하는 기존 레퍼런스 항체를 이용하는 경우의 R2 값이 0.9805인 것과 비교할 때 동등 수준 이상임을 확인하였다.
실험예 4: 측정 온도에 따른 데이터의 비교
본 발명에 따른 아트라진 레퍼런스 항체 및 기존의 항 토끼 레퍼런스 항체를 이용한 측정 방법을 이용하여, 검출 범위 내의 혈청 시료 한 농도인 5μIU/mL에 대하여, 각각 4℃, 15℃, 25℃, 30℃ 및 37℃에서의 검출 테스트를 실시하였다. 하나의 온도 조건 당 5개의 카트리지를 사용하여 측정하였고, 검출 결과를 얻은 뒤 5개 결과의 평균을 구하였다.
구체적으로, 카트리지 및 시료를 각각 4℃, 15℃, 25℃, 30℃ 및 37℃에서 1시간 방치하여 해당 온도와 동일해지도록 세팅한 뒤, 카트리지의 샘플 주입구에 시료 30uL를 떨어뜨리고 해당 온도 조건에서 전개시켰다. 5분이 경과하면 마이크로칩을 면역학적 측정 장치(상온에 설치)에 삽입하고, 약 40초 후 측정 장치의 디스플레이 화면에 샘플 내 TSH 양(정량적) 및 시험영역과 표준영역의 시그널 세기 값이 표시되었다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
T/R 시그널 비
T/R 측정회수 37℃ 30℃ 25℃ 15℃ 4℃
1 0.328 0.389 0.327 0.279 0.269
2 0.363 0.285 0.306 0.275 0.308
3 0.334 0.304 0.398 0.254 0.261
4 0.367 0.295 0.305 0.326 0.248
5 0.321 0.284 0.358 0.252 0.295
AVE (평균) 0.34 0.31 0.34 0.28 0.28
SD (표준편차) 0.021 0.044 0.040 0.030 0.025
CV(%) 6.23 14.19 11.67 10.68 8.95
표 8에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 아트라진 레퍼런스 항체를 이용하였을 경우에는 측정 온도가 4℃, 15℃, 25℃, 30℃ 및 37℃로 증가함에 따라 T/R 비의 평균 값이 각각 0.28, 0.28, 0.34, 0.31 및 0.34로 일정하게 나타나 온도의 변화에 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
또한, 각 영역의 시그널 세기 값과 T/R 비를 이용하여 그래프로 나타낸 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 왼쪽 축은 시그널 세기를, 오른쪽 축은 T/R 비를 의미한다. 도 7에서 보는 바와 같이, 측정 온도가 높아질수록 TSH 시험 영역의 시그널이 증가함을 알 수 있는데 이는 항원 항체 반응이 온도에 따라 증가하기 때문인 것으로 판단된다.
반면, 기존의 항토끼 레퍼런스 항체를 이용하는 경우를 테스트하기 위하여 PSA(prostate specific antigen) 검출 마이크로칩을 이용하였다. 이 실험에 사용한 혈액 시료는 분당 서울대병원 진단검사의학과 외래 검사실에 의뢰한 환자의 혈액시료를 이용하였으며, 환자군은 무작위로 선정되었다. 환자군은 전립선암 환자이고, 환자의 혈청에서 PSA(prostate specific antigen)이라는 종양표지자의 양을 측정하였다.
마이크로칩은, 시험영역에는 PSA 포획 항체, 표준영역에 항 토끼 항체를 고정하고, 접합영역에는 PSA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 항 토끼 항체에 특이적으로 결합하는 프로브(염소-항 토끼 항체)를 고정하는 형태로 제작하였으며, 이렇게 제조된 마이크로칩을 이용하여 상기 실험예 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 PSA를 검출하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 기존의 항 토끼 레퍼런스 항체를 이용하는 경우 온도 변화에 따라 시험영역(T)의 시그널 세기가 증가하는 반면, 표준영역(R)의 시그널은 거의 변동이 없어서 T/R 비율이 증가하여, 온도 변화에 따라 PSA의 검출량이 달라짐을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 측정 온도에 따른 레퍼런스 항체들의 반응 정도 차이 비교
본 발명에 따른 아트라진 레퍼런스 항체를 이용한 TSH의 측정 방법을 이용하여, 검출 범위 내의 하나의 혈청시료 농도인 5μIU/mL에 대하여, 각각 4℃, 15℃, 25℃, 30℃ 및 37℃에서의 검출 테스트를 실시하였다. 나머지 조건은 상기 실험예 4에서 기재한 것과 동일한 방식으로 수행하였다.
각 온도에서 5번 반복한 결과에 대한 평균값을 측정하였으며 왼쪽 축을 표준 영역의 시그널값으로 하여 그래프를 나타낸 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 항체에 따라 온도 상승에 대한 항원-항체 결합 반응성의 변화율이 서로 다름을 알 수 있다. 예를 들면, #6 항체(클론 6)는 온도 변화에 거의 반응하지 않지만, #15 항체(클론 15)는 가장 민감하게 증가하고, #18 항체(클론 18)는 중간 정도의 수준으로 증가하였다.
이와 같이, 본 발명에 따른 햅텐 및 이에 결합하는 항체(레퍼런스 항체)를 이용한 면역학적 측정 방법 또는 장치는 다양한 온도에 대해 다른 반응성을 지닌 항체들을 포함하는 항체 라이브러리를 구축하고, 시험 영역의 온도에 따른 반응성의 특성과 유사한 성질을 지닌 레퍼런스 항체를 골라 사용할 수 있다.
<110> SK TELECOM CO., LTD. <120> IMMUNOASSAY USING REFERENCE ANTIBODY COMPRISING HAPTEN AND ANTIBODY BONDED THERETO AND IMMUNOLOGICAL ANALYZER USING THE REFERENCE ANTIBODY <130> FPD/201309-0031 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of reference antibody <400> 1 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Ile Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Gly Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Val Gly Trp Ser Ala Thr Ile Asp Ala Trp Gly His 100 105 110 Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region (VL) amino acid sequence of reference antibody <400> 2 Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Gly Thr Val 1 5 10 15 Lys Leu Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln 20 25 30 Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Tyr Asn Asn Lys 35 40 45 Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Phe Gly Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Gly Ser Thr Asp Ile Arg Ser Thr Pro Ile Phe Gly Ala 85 90 95 Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 amino acid sequence of heavy chain variable region (HCDR1) of reference antibody <400> 3 Gly Phe Ser Ile Gly Asp Tyr Gly Met Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of heavy chain variable region (HCDR2) of reference antibody <400> 4 Ser Ile Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Ser Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of heavy chain variable region (HCDR3) of reference antibody <400> 5 Asp Gly Val Gly Trp Ser Ala Thr Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of light chain variable region (LCDR1) of reference antibody <400> 6 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of light chain variable region (LCDR2) of reference antibody <400> 7 Tyr Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of light chain variable region (LCDR3) of reference antibody <400> 8 Gly Ser Thr Asp Ile Arg Ser Thr Pro Ile 1 5 10 <210> 9 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of VH domain <400> 9 ggtcagtcct ctagatcttc cggcggtggt ggcagctccg gtggtggcgg ttccgccgtg 60 acgttggacg ag 72 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of VH domain <400> 10 ctggccggcc tggccactag tggaggagac gatgacttcg gtcc 44 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of VL domain <400> 11 gtggcccagg cggccctgac tcagccgtcc tcggtgtc 38 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of VL domain <400> 12 ggaagatcta gaggactgac ctaggacggt cagg 34 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of scFv domain <400> 13 gaggaggagg aggaggaggt ggcccaggcg gccctgactc ag 42 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of scFv domain <400> 14 gaggaggagg aggaggagga gctggccggc ctggccacta gtggagg 47 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFV sequencing forward primer <400> 15 acactttatg cttccggctc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFV sequencing reverse primer <400> 16 caaaatcacc ggaaccagag 20 <210> 17 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of VH domain for reference antibody <400> 17 gctagccgcc accatgggct ggtcctgcat catcctgttc ctggtggcca ccgccaccgg 60 cgccgtgacg ttggacgagt ccggg 85 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of VH domain for reference antibody <400> 18 agatggtgcg gtagttttag cggaggagac gatgacttc 39 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of heavy chain constant region (CH) for reference antibody <400> 19 gctaaaacta ccgcaccatc t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of CH domain for reference antibody <400> 20 ggatcccttg ccggccgtcg c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of heavy chain (HC) for reference antibody <400> 21 ctagctagcc gccaccatgg g 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of heavy chain (HC) for reference antibody <400> 22 gacacctact cagacaatgc 20 <210> 23 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of VL domain for reference antibody <400> 23 aagcttgccg ccaccatggg ctggtcctgc atcatcctgt tcctggtggc caccgccacc 60 ggcgccctga ctcagccgtc ctcggtg 87 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of VL domain for reference antibody <400> 24 cacggttggg gctgcatcgg ctaggacggt cagggttgt 39 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of kappa chain constant region (Ck) domain for reference antibody <400> 25 gccgatgcag ccccaaccgt g 21 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of Ck domain for reference antibody <400> 26 tctagactaa cactcatttc tgtt 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer of light chain (LC) for reference antibody <400> 27 cccaagcttg ccgccaccat g 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer of light chain (LC) for reference antibody <400> 28 ggacacctag tcagacaaaa tg 22

Claims (13)

  1. 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하며,
    상기 항체가 i) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, ii) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 iii) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3; 그리고 iv) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, v) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 vi) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역학적 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역학적 측정 방법이 시료 중의 테스트 물질의 정량 분석인 것을 특징으로 하는, 면역학적 측정 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 햅텐이 아트라진(Atrazine) 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는, 면역학적 측정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 아트라진의 유도체가 프로파진(propazine), 프로메트린(prometryn), 프로메톤(prometon), 시마진(simazine), 시메트린(simetryn), 이파진(ipazine), 트리에타진(trietazine), 시아노진(cyanazine) 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는, 면역학적 측정 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역학적 측정 방법.
  7. 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 포함하며,
    상기 항체가 i) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, ii) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 iii) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3; 그리고 iv) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, v) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 vi) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 햅텐이 아트라진 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 아트라진의 유도체가 프로파진, 프로메트린, 프로메톤, 시마진, 시메트린, 이파진, 트리에타진, 시아노진 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 면역학적 측정 장치가 모세관 힘, 마이크로 채널, 크로마토그래피 또는 나이트로셀룰로스 막을 이용하는 것을 특징으로 하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치.
  13. 제 7 항에 있어서,
    상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치가 (1) 시료 중의 테스트 물질에 특이적으로 결합하는 테스트 프로브, 및 햅텐 또는 햅텐 항체에 특이적으로 결합하는 레퍼런스 프로브가 함께 함침되어 있는 접합 영역; (2) 테스트 물질에 특이적으로 결합하는 포획 항체가 함침되어 있는 시험 영역; 및 (3) 햅텐 또는 햅텐 항체가 함침되어 있는 표준 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정 장치.
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