CN113009017B - 一种基于抗体偶联磁珠富集技术的激素质谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法包括以下步骤：抗体和磁珠偶联，加入高浓度甲醇溶液涡旋去除抗体上携带的内源性激素小分子化合物后恢复抗体活性，得到可富集激素小分子化合物的抗体磁珠，加入检测血清或标准曲线样本得到第一溶液；向第一溶液加入内标物后室温涡旋孵育，加入低浓度甲醇洗涤，得到富集到激素小分子化合物的抗体磁珠；将富集激素小分子化合物的抗体磁珠置于80％的甲醇水溶液中重悬涡旋，得到包含激素小分子化合物的洗脱液；质谱检测激素小分子化合物，利用磁珠固定抗体并配合80％甲醇水溶液洗脱激素小分子化合物，随后利用质谱法检测激素小分子化合物，提高检测的特异性。

Description

一种基于抗体偶联磁珠富集技术的激素质谱检测方法
技术领域
本发明涉及激素检测领域，特别涉及一种基于抗体偶联磁珠富集技术的激素质谱检测方法。
背景技术
目前临床检测内源性激素通常使用基于抗体的化学发光方法，利用特异性抗体捕获所需检测物质，通过抗体磁珠分离所需检测的物质后用酶标法进行检测，但该方法存在特异性差、线性范围窄，不能准确的检测激素等目标化合物的浓度的缺陷；液质联用质谱仪(LC-MS/MS)检测作为一种新型的检测技术，由于其特异性高，线性范围宽，并且可以同时检测多个指标，可针对性地克服化学发光方法在检测激素时存在的缺陷。
然而，目前的液质联用质谱法检测激素的样本前处理方式是非特异性的富集方法，含有较多不必要的基质物质，而使得检测过程中造成较高的基质效应，且能以分离结构相似的物质，故液质联用质谱法在激素检测中的应用并不广泛。
另外，目前的方式难以应用于检测抗体表达的激素内源性小分子化合物，抗体在血清中表达时都会产生激素内源性小分子化合物，并且抗体会和激素内源性小分子化合物紧密的结合，使用简单的抗体纯化步骤并不能有效地分离激素内源性小分子化合物，进而导致无法对此类激素进行后续精准的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，利用磁珠固定抗体并配合10％甲醇作为富集缓冲体系，80％甲醇水溶液洗脱抗体磁珠上富集得到的激素小分子化合物，随后利用质谱法检测激素小分子化合物，提高检测的特异性。
根据本发明的第一方面，提供一种基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，包括以下步骤：
准备抗体磁珠：抗体和磁珠偶联，置于磁力架上静置，并弃除上清液，加入50％-80％甲醇溶液涡旋去除抗体上携带的内源性激素，弃去上清液后，恢复抗体活性，得到可富集激素小分子化合物的抗体磁珠，加入检测血清或标准曲线样本得到第一溶液；
富集检测样本：向第一溶液加入内标物后室温涡旋孵育，加入5-20％甲醇溶液洗涤，得到富集到激素小分子化合物的抗体磁珠；
洗脱检测样本：将富集到激素小分子化合物的抗体磁珠置于80％的甲醇水溶液中重悬涡旋，得到包含激素小分子化合物的洗脱液；
质谱检测激素小分子化合物：将洗脱液置于设定的质谱条件下进行检测。
在一些实施例中，在抗体偶联磁珠后抗体上携带的内源性激素小分子化合物的去除后还可重新恢复抗体活性，包括步骤：置于浓度自高至低的有机溶剂水溶液中梯度洗涤抗体磁珠。具体的，可将抗体磁珠先用80％甲醇水溶液洗涤3 至5次，再依次置于65％-55％有机溶剂水溶液、55-45％有机溶剂水溶液、45-35％有机溶剂水溶液、35-25％有机溶剂水溶液、25-15％有机溶剂水溶液和15-5％有机溶剂水溶液中洗涤1次，最终将抗体磁珠保存在15-5％有机溶剂水溶液中。在抗体活性恢复阶段，用不同浓度的有机溶剂水溶液梯度恢复抗体活性时，抗体磁珠置于对应浓度的有机溶剂水溶液中重悬，颠倒混匀2-4min，并丢弃当前浓度的有机溶剂水溶液。
其中，有机溶剂水溶液为甲醇水溶液。
富集检测样本：向准备好的抗体磁珠加入检测血清或10％甲醇配制的标准曲线样本，以及10％甲醇配制的内标物，室温涡旋孵育30min，置于磁力架上静置并弃去上清液，加入10％甲醇溶液颠倒洗涤1-2min，弃上清，重复洗涤3次，得到富集到激素小分子化合物的抗体磁珠。
在洗脱检测样本阶段，将富集到激素小分子化合物的抗体磁珠置于80％的甲醇水溶液中重悬涡旋1-2min，得到包含激素小分子化合物的洗脱液。本方案利用10％甲醇作为富集缓冲体系代替PBS，利用磁珠配合80％甲醇水溶液洗脱抗体上的激素小分子化合物，现有技术中磁珠大多是用于纯化抗体，但在本方案中，磁珠起到的不是纯化抗体的作用，而是辅助固定抗体并配合80％的甲醇水溶液洗脱抗体上吸附的激素小分子化合物。
具体的，抗体在表达过程中会结合内源性激素等小分子抗原，这些内源性激素小分子抗原和抗体均是可溶有机溶剂的成分，在本方案中磁珠固定抗体但不会固定内源性激素小分子抗原，80％甲醇水溶液从抗体上洗脱内源性小分子抗原。且本方案利用80％甲醇水溶液洗脱抗体上携带的内源性小分子抗原后依旧能保持抗体的活性，目前大多报道更为缓和的试剂(比如0.1M甘氨酸，pH3.0 左右的甘氨酸洗脱液，还有柠檬酸洗脱液等)洗脱抗原，但是洗脱效果不佳；抗体上有两个抗原结合位点，一分子抗体可以结合两分子抗原，抗体是一个蛋白，高浓度有机试剂可以使抗体变性，抗体变性后抗原结合位点被破坏，进而使得抗原和抗体洗脱，同时高浓度有机试剂可以去除疏水作用。本申请人做了大量可验证的实验验证80％甲醇水溶液不仅可洗脱抗体上的抗原，洗脱后的抗体在梯度甲醇水溶液的作用下可恢复活性。
在富集检测样本阶段，可选用PBS混合溶液，也可选用10％甲醇水溶液。优选地，10％甲醇水溶液富集激素小分子化合物。因为类固醇激素在PBS中的溶解性较差，在10％甲醇中能溶解充分；且PBS接近中性，10％甲醇的也接近中性。
值得一提的是，在富集检测样本阶段可选用多种抗体偶联磁珠混合的方式，但不影响抗体活性，即，至少两抗体偶联磁珠混合使用，提高富集效果。
在质谱检测阶段，将洗脱液吹干后复溶或直接转移到微孔板中，利用Waters TQD质谱仪进行检测，针对不同的激素小分子化合物提供不同的质谱条件。
本方案的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法特别适用于检测类固醇激素以及其他小分子化合物。
在本方案的一实施例中，选用皮质醇、睾酮、孕酮以及醛固酮四种抗体。对应检测醛固酮、皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、雄烯二酮、睾酮、孕酮等激素小分子化合物。
第二方面，提供一种基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测试剂盒，包括：磁珠，抗体，50-80％甲醇溶液，5-20％甲醇溶液洗涤，浓度自高至低的有机溶剂水溶液，80％甲醇水溶液，利用上述所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法进行激素质谱检测。
相较现有技术，本技术方案利用抗体磁珠富集并配合80％的甲醇水溶液洗脱得到激素小分子化合物，且洗脱得到的激素小分子化合物可被利用质谱检测。
附图说明
图1到图7依次是醛固酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、雄烯二酮、睾酮、孕酮的激素小分子化合物的质谱图。
图8到图14依次是醛固酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、雄烯二酮、睾酮、孕酮的素小分子化合物的线性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
以下结合实施例说明本方案提供的基于抗体偶联磁珠富集技术的激素质谱检测方法的检测效果。
实施例一：抗体上含有内源性激素小分子化合物。
试剂准备：
选用皮质醇、睾酮、孕酮以及醛固酮四种抗体，抗体购自Thermo；甲醇，购自默克，甲醇混水制备得到80％甲醇水溶液；
实验仪器准备：
1.5ml离心管自制磁力架；1.5ml离心管；涡旋振荡器(Scientific Industries*Vortex-Genie2公司，Vortex-Genie 2)；Waters TQS质谱仪(Waters公司)；
实验过程：
分别取5μl抗体(醛固酮、孕酮、睾酮或皮质醇)到1.5ml离心管中，加 100μl 80％甲醇水溶液，置于涡旋振荡器内涡旋3min，12000g 4℃离心10min，取上清液50μl到96孔板中，再加入50μl水，混匀后Waters TQS上检测。
质谱和色谱检测方法
一、色谱条件
1、色谱柱和预柱的型号和规格：Waters HSS T3(2.1*50mm，1.8μm)，HSS T3 (2.1*5.0mm，1.8μm)。
2、流动相A：0.1％甲酸、2mM乙酸铵水溶液；流动性B：0.1％甲酸、2mM 乙酸铵甲醇溶液。
2、梯度洗脱程序：0min：A：B＝55：45；4.0min:A：B＝40：60；6.5min： A：B＝25：75；7.5min：A:B＝10：90；7.6min：A:B＝55：45；8.0min：A:B＝55： 45。
3、流速：0.45mL/min；柱温：45℃；进样：10μL。
二、质谱条件
1、质谱型号和扫描模式：I-class Waters TQS，正离子模式
2、毛细管电压：3.2kv；脱溶剂温度：650℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：0L/hr；
3、扫描模式：多反应监测(MRM),各化合物质谱参数如下:
Figure GDA0003192001280000061
Figure GDA0003192001280000071
检测结果：
四种抗体上均可检测得到内源性激素小分子化合物，激素小分子化合物包括醛固酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、雄烯二酮、睾酮、孕酮，检测得到的激素小分子化合物的质谱图如图1-图7所示，激素小分子化合物峰面积的数据如下表一所示：
表一 抗体上内源性激素峰面积
Figure GDA0003192001280000072
实施例二：利用0.1M甘氨酸pH2.8洗脱液和20％甲醇溶液均不能有效去除抗体偶联磁珠上的内源性激素
试剂准备：
甘氨酸购自Sigma，配制成0.1M甘氨酸pH2.8；磷酸盐缓冲液(PBS)购自Sigma，去离子水购自默克；碳化二亚胺购自sigma，加水配制成10mg/mL； Tris购自sigma,加水配制成50mM Tris-HCl,pH7.4，羧基磁珠购自英芮诚生化科技有限公司。其它试剂同实施案例一。
实验仪器准备：同实施案例一
实验过程：
1.抗体磁珠偶联：将磁珠混合均匀，取10mg磁珠加入到1.5mL EP管中，磁力架上磁性分离去除上清液，加入去离子水后混合均匀，磁性分离去除上清液，再重复2次。加入100μL PBS重悬磁珠，磁性分离去除上清液，再重复2次。加入50μL PBS重悬磁珠，分别加入1mg(醛固酮、孕酮、睾酮或皮质醇)抗体，室温旋转混合30min。加入10μL现配的10mg/mL 碳化二亚胺溶液，补充PBS使体系总体积为1000μL。室温涡旋偶联1小时，磁性分离去除上清液。加入100μL淬灭缓冲液(50mM Tris-HCl, pH7.4)重悬磁珠，涡旋混合30min，磁性分离去除上清液；加入1000μL PBS，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液，再重复2次，将磁珠分散于1000μL 10％甲醇中，4℃保存，得到抗体偶联磁珠。
2.分别取30μl 1mg/ml抗体偶联磁珠(醛固酮、孕酮、睾酮或皮质醇)加100 μl0.1M Gly pH2.8或20％甲醇重悬，颠倒数次洗脱抗体上的内源性激素，置于磁力架上磁性分离抗体偶联磁珠，取上清100μl至96孔板中，再重复洗脱2次，最后再用80％甲醇洗脱1次，取每步的上清液50μl至96孔板中，加50μl水混匀，Waters TQS质谱检测。
检测结果：
0.1M甘氨酸pH2.8洗脱液清洗3次(Gly1,2,3)的情况，并不能很好地洗脱内源性小分子化合物，检测得到的激素小分子化合物峰面积数据如下表二。
20％甲醇也不能很好地洗脱内源性小分子化合物，检测得到的激素小分子化合物峰面积数据如下表三：
表二 0.1M甘氨酸pH2.8洗脱液对抗体上内源性激素洗脱峰面积
Figure GDA0003192001280000081
Figure GDA0003192001280000091
表三 20％甲醇洗脱液对抗体上内源性激素洗脱峰面积
Figure GDA0003192001280000092
实施例三：80％甲醇可有效去除抗体偶联磁珠上的内源性激素，且不影响抗体活性，10％甲醇作为富集体系和4种抗体混合使用富集效果更优
试剂准备：
各激素化合物和内标均购自Sigma，其它试剂同实施案例一或二，分别用 10％甲醇配置内标(表四)和校准品(表五)
表四 各化合物内标浓度
Figure GDA0003192001280000093
表五 校准品各化合物浓度
Figure GDA0003192001280000094
Figure GDA0003192001280000101
其它试剂和实验仪器准备同实施例一或二。
实验过程：
制备抗体偶联磁珠的方式同于实施例二中的介绍。
1.抗体偶联磁珠上内源性激素去除：分别取1ml 1mg/ml抗体偶联磁珠(醛固酮、孕酮、睾酮或皮质醇)置于磁力架上磁性分离抗体偶联磁珠，弃上清，加1ml 80％甲醇重悬，颠倒数次去除抗体上的内源性激素，磁性分离后弃上清，再用80％甲醇洗涤2次，磁性分离后弃上清，然后依次用1ml 70％、60％、50％、 30％、20％和10％甲醇梯度洗涤1次，使抗体偶联磁珠恢复活性，最后抗体偶联磁珠保存在10％甲醇中。
2.4种抗体混合实验：分别取20μl 1mg/ml抗体偶联磁珠(醛固酮、孕酮、睾酮、皮质醇)或各取20μl 1mg/ml 4种抗体偶联磁珠混合，加200μl标准品6 (表五)和30μl内标(表四)，室温涡旋孵育30min，磁性分离，弃上清，加 200μl 10％甲醇/90％水重悬抗体磁珠，涡旋1min，弃上清，再用200μl 10％甲醇/90％水洗涤磁珠2次，加50μl 80％甲醇/20％水重悬抗体磁珠，涡旋1min,洗脱抗体磁珠上的激素，磁性分离，取上清50μl到96孔板上，加50μl水混匀，上Waters TQS质谱仪检测。
3.富集方法优化：分别比较PBS和10％甲醇两种富集反应体系和洗涤体系，按照上述实验方法富集，检测两种条件下的各激素化合物的峰面积。
检测结果：
如表六所示，对醛固酮、皮质醇、睾酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、皮质素和11-脱氧皮质酮等7种激素检测发现，与单个抗体偶联磁珠相比，4种抗体偶联磁珠混合后富集得得到的各化合物峰面积更高；10％甲醇组比PBS组得到的化合物峰面积更高。
表六 富集反应体系和抗体混合实验各激素峰面积
Figure GDA0003192001280000111
实施例四：测试激素小分子化合物保留时间以及线性范围：
实验过程同实施案例三
检测结果：
得到激素小分子化合物的保留时间及线性范围如表七所示，线性图8-图14 所示，从实验结果可见，各个激素化合物的相关系数＞0.99，表示线性区间可接受，符合实际实验要求。
表七 各激素保留时间和线性结果
序号 目标化合物 保留时间 线性范围(ng/ml) 线性方程 相关系数(r2)
1 醛固酮 1.7 0.01-20.0 y＝1.836x+0.0268 0.9996
2 皮质素 2.02 0.25-500.0 y＝0.064x-0.001 0.9988
3 皮质醇 2.33 0.25-500.0 y＝0.052x-0.002 0.9985
4 11-脱氧皮质醇 3.42 0.025-50.0 y＝1.806x-0.002 0.9982
5 11-脱氧皮质酮 4.49 0.01-20.0 y＝2.102x+0.145 0.9994
6 雄烯二酮 4.1 0.010-20.0 y＝1.300x+0.003 0.9997
7 睾酮 4.63 0.025-50.0 y＝2.192x-0.034 0.9995
实施例五：加标回收实验：
实验过程：
取20μl 1mg/ml 4种混合抗体偶联磁珠，加200μl标准品(表五)或血清样品和30μl内标(表四)，室温震荡孵育30min，磁性分离，弃上清，加200μl 10％甲醇/90％水重悬抗体磁珠，涡旋1min，弃上清，再用200μl 10％甲醇/90％水洗涤磁珠2次，加50μl 80％甲醇/20％水重悬抗体磁珠，涡旋1min，洗脱抗体磁珠上的激素，磁性分离，取上清50μl到96孔板上，加50μl水混匀，上Waters TQS 质谱仪检测。每个实验重复3次，根据标准曲线计算的每个实验组的浓度值，回收率＝(实验样品浓度-基础样品浓度)/理论浓度×100％。
检测结果：
得到的加标回收实验结果如表八至表十四所示。回归实验的判断标准为： 80％<低浓度平均回收率<120％为正确度验证通过，85％<中、高浓度平均回收率 <115％为正确度验证通过，可见本方案的实验可行。
表八 醛固酮加标回收结果
Figure GDA0003192001280000121
表九 皮质素加标回收结果
Figure GDA0003192001280000122
Figure GDA0003192001280000131
表十 皮质醇加标回收结果
Figure GDA0003192001280000132
表十一 11-脱氧皮质醇加标回收结果
Figure GDA0003192001280000133
表十二 11-脱氧皮质酮加标回收结果
Figure GDA0003192001280000134
表十三雄烯二酮加标回收结果
Figure GDA0003192001280000135
Figure GDA0003192001280000141
表十四 睾酮加标回收结果
Figure GDA0003192001280000142
实施例六：5天精密度实验：
实验过程：同实施方案五，高低两个浓度水平样品，每天3次重复，连续测5天。
检测结果：
得到的方法精密度如表十五至表十九所示，可见本方案的批内，批间精密度CV值小于10％，满足实验要求。
表十五 醛固酮5天精密度
Figure GDA0003192001280000143
表十六 皮质素5天精密度
Figure GDA0003192001280000144
Figure GDA0003192001280000151
表十七 11-脱氧皮质酮5天精密度
Figure GDA0003192001280000152
表十八 雄烯二酮5天精密度
Figure GDA0003192001280000153
表十九 睾酮5天精密度
Figure GDA0003192001280000154
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
准备抗体磁珠：抗体和磁珠偶联，置于磁力架上静置，并弃除上清液，加入50-80%甲醇溶液涡旋去除抗体上携带的内源性激素，弃去上清液后，恢复抗体活性，得到可富集类固醇激素小分子化合物的抗体磁珠，加入检测血清或标准曲线样本得到第一溶液；
富集检测样本：向第一溶液加入内标物后室温涡旋孵育，加入5-20%甲醇溶液洗涤，得到富集到类固醇激素小分子化合物的抗体磁珠；
洗脱检测样本：将富集到类固醇激素小分子化合物的抗体磁珠置于80%的甲醇溶液中重悬涡旋，得到包含类固醇激素小分子化合物的洗脱液；
质谱检测激素小分子化合物：将洗脱液置于设定的质谱色谱条件下进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，恢复抗体活性的步骤包括：将抗体磁珠置于浓度自高至低的有机溶剂水溶液中梯度恢复抗体活性。
3.根据权利要求1所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，在富集检测样本阶段，抗体磁珠单独使用或者组合使用。
4.根据权利要求1所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，富集检测样本步骤中，甲醇溶液选用10%甲醇溶液。
5.根据权利要求1所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，抗体为皮质醇抗体、睾酮抗体、孕酮抗体以及醛固酮抗体。
6.根据权利要求1所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，磁珠为纳米级羧基磁珠。
7.根据权利要求5所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，类固醇激素小分子化合物为醛固酮、皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、雄烯二酮以及睾酮。
8.根据权利要求1所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法，其特征在于，色谱条件：色谱柱和预柱的型号和规格：规格为2.1*50mm，1.8μm的Waters HSS T3，规格为2.1*5.0mm，1.8μm 的HSS T3，流动相A：0.1%甲酸、2 mM乙酸铵水溶液；流动性B：0.1%甲酸、2mM乙酸铵甲醇溶液，梯度洗脱程序：0 min：A：B=55：45；4.0 min :A：B=40：60；6.5 min：A：B=25：75；7.5min：A:B=10：90；7.6min：A:B=55：45；8.0 min：A:B=55：45，流速：0.45mL/min；柱温：45℃；进样：10μL。
9.一种基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测试剂盒，其特征在于，包括：
磁珠，抗体，50-80%甲醇溶液，5-20%甲醇溶液，用于恢复抗体活性的浓度自高至低的有机溶剂水溶液，80%甲醇溶液，利用上述权利要求1到8任一所述的基于抗体偶联富集技术的激素质谱检测方法进行激素质谱检测。
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