CN114460198A - 一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。本发明结合了免疫法和质谱法的优点，将分离纯化睾酮的所需试剂制备成封闭试剂条，有效避免试剂交叉污染带来的实验错误，样品前处理过程引入睾酮和雄烯二酮自身稳定同位素内标实时校正，有效消除系统误差，同时配备定标曲线和质控品，只需要简单的将样品加入到试剂条中，将处理好的样品取出上LC‑MS/MS检测，无需常规的液相色谱串联质谱法检测中常用的固相萃取等所需的各种试剂、耗材和仪器设备等，简单高效，易于临床检测和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒。
背景技术
睾酮，又称睾丸素、睾丸酮或睾甾酮，是一种雄激素，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。通过测定睾酮值，根据测定的睾酮值偏高或偏低，可提示睾丸间质细胞瘤。先天性肾上腺皮质增生症、肾上腺肿瘤、多囊卵巢综合征、隐睾、睾丸炎、睾丸间质细胞瘤等疾病。
男性雄烯二酮是由睾丸及肾上腺分泌的一种类固醇激素，为雄激素的组成成分。雄烯二酮的生理作用为维持男性性腺特征，促进性器官发育。女性雄烯二酮由肾上腺皮质及卵巢少量分泌，维持性腺正常功能。血清雄烯二酮检测可以辅助诊断肾上腺皮质功能，如肾上腺皮质功能减退以及女性卵巢、内分泌疾病，如多囊卵巢综合征、多毛症等。
临床检测睾酮和雄烯二酮的方法主要有免疫法、气相色谱法(GC-MS)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。
免疫法自动化分别检测睾酮和雄烯二酮，检测速度快，成本低，但只能单独检测，用血量高，且由于睾酮和雄烯二酮结构非常接近，抗体特异性难以保证只识别其中之一，本发明经过验证发现睾酮抗体识别睾酮和雄烯二酮，因此免疫法检测值可能偏高，给临床检测带来不能克服的困难。GC-MS特异性好，可同时检测这两种激素，但样品提取、纯化和衍生步骤非常复杂，阻碍其临床应用。LC-MS/MS主要采用电喷雾离子源结合三重四级杆分析器质谱，检测睾酮和雄烯二酮有以下优势：特异性和准确性高、检测限可以达到pg/mL，不受特殊抗体和发光试剂的限制，方法建立简单，一次处理同时检测睾酮和雄烯二酮，每个检测指标的成本相对较低，样品用量低等特点，因而成为国内外临床检验的热点。
LC-MS/MS方法检测前需要对血清或血浆样品中的睾酮和雄烯二酮提取，去除蛋白质、脂类和多糖及其他小分子干扰物，主要有蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取和化学衍生法等，这些方法都需要用到甲基叔丁基醚、二氯甲烷、二乙醚或正己烷等刺鼻且有毒的有机试剂，环境污染严重，操作需要特殊防护装备。理想的样品处理方法是操作简单最好能自动化、降低基质干扰、样品纯化足够干净—仅保留目标检测物、延长色谱柱及其液相和质谱使用寿命，目前尚缺乏这样的操作方法。固相萃取可以降低样品的复杂程度使样品更干净，但是由于其成本高昂、难以自动化、批处理不均一等特点限制其应用。此外质谱法检测中，需要等待样品处理后才能上质谱检测，而样品处理通常需要花费很长时间，在消耗检测人员的精力同时且极容易出错导致误诊，极大增加了检测时间，患者和检测人员均体验较差，极容易造成医患矛盾。
发明内容
为了解决现有游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法复杂，免疫法检测睾酮存在抗体特异性的缺陷，本发明提供了一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，本发明的试剂盒基于免疫法和质谱法的结合，处理后的样品仅包含目标物睾酮和雄烯二酮及其内标，样品足够干净，有效克服基质效应、极大延长色谱柱和LC-MS/MS使用寿命，简单高效，易于临床检测和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，所述试剂盒包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。
在本发明中，本发明的睾酮和雄烯二酮检测试剂盒，包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相。试剂条主要成分由可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、淋洗液PBS和80％甲醇组成。通过一系列的性能验证实验，证明了使用该试剂盒能够自动化、准确检测睾酮和雄烯二酮浓度，且可以稳定存储6个月。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤：
1)睾酮抗体多次离心，超滤，保存在PBS缓冲液中；
2)将磁微粒混合均匀；
3)将步骤2)的磁微粒加入去离子水，混合均匀后磁性分离去除上清液，重复多次；
4)使用PBS缓冲液重悬步骤3)得到的磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
5)使用PBS缓冲液重悬步骤4)得到的磁微粒，加入步骤1)的睾酮抗体，室温下混合；加入碳化二亚胺溶液，补足体系体积，在室温下涡旋偶联，磁性分离去除上清液；
6)使用淬灭缓冲液重悬步骤5)得到的抗体偶联磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
7)重悬步骤6)得到的抗体偶联磁微粒，以去除内源性睾酮和类固醇激素；
8)使用由高到底梯度浓度的一元醇或乙腈水溶液，恢复步骤7)得到的抗体偶联磁微粒的活性，并保存在体积分数为1-20％一元醇或乙腈溶液中。
作为本发明的一种优选方案，步骤8)的梯度浓度依次为：80-100％一元醇或乙腈、60-79％一元醇或乙腈、50-59％一元醇或乙腈、40-49％一元醇或乙腈、30-39％一元醇或乙腈、20-29％一元醇或乙腈以及0-19％一元醇或乙腈溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述试剂条上设置有1号至15号的孔；其中，3号孔、4号孔与5号孔用于放置洗涤液；6号孔用于放置睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标；7号孔用于放置睾酮抗体偶联磁微粒；9号孔用于放置洗脱液。
作为本发明的一种优选方案，所述洗涤液为100-400μL的PBS溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标为30-100μL体积分数2-30％一元醇或乙腈配制的5ng/mL睾酮-13C3与雄烯二酮-13C3。
作为本发明的一种优选方案，所述洗脱液为100-300μL的体积分数为70-100％一元醇或乙腈溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮和雄烯二酮定标曲线由2％一元醇或乙腈溶液98％PBS-30％一元醇或乙腈溶液70％PBS配制，浓度分别为：雄烯二酮：0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL以及15ng/mL；睾酮：0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL以及15ng/mL。
最优选地，睾酮和雄烯二酮定标曲线由10％甲醇90％PBS配制。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮和雄烯二酮低高质控分别为睾酮低浓度质控品0.25ng/mL与雄烯二酮低浓度质控品0.6ng/mL，睾酮高浓度质控品10.5ng/mL与雄烯二酮高浓度质控品10.5ng/mL。
作为本发明的一种优选方案，所述的流动相为0.2mol/L乙酸铵、10％甲酸与90％水。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明结合了免疫法和质谱法的优点，将分离纯化睾酮的所需试剂制备成封闭试剂条，有效避免试剂交叉污染带来的实验错误，样品前处理过程引入睾酮和雄烯二酮自身稳定同位素内标实时校正，有效消除系统误差，同时配备定标曲线和质控品，只需要简单的将样品加入到试剂条中，将处理好的样品取出上LC-MS/MS检测，无需常规的液相色谱串联质谱法检测中常用的固相萃取等所需的各种试剂、耗材和仪器设备等，简单高效，易于临床检测和应用；
2)本发明所述试剂盒配制一次至少可稳定保存半年，无需频繁配制，利于生产和检测使用，使用本发明的试剂盒检测睾酮和雄烯二酮，无需传统的LC-MS/MS检测方法所需的各种刺鼻有毒试剂、耗材、仪器设备、特殊装置和实验台面等，12min可完成一次前处理，直接上质谱检测，然后再处理下一轮样品，质谱检测和样品前处理同时进行，加急样品可在半小时内出结果，简单高效，易于临床检测和应用，患者和检验人员体验良好，有效降低因检测引起的医患矛盾。
附图说明
图1是本发明睾酮抗体偶联磁微粒富集睾酮和雄烯二酮LC-MS/MS检测色谱图。
图2是本发明睾酮线性结果。
图3是本发明雄烯二酮线性结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，如未特别说明，％是指代体积分数，所采用的试剂可从市场购得。
实验试剂和材料
甲酸购自于阿拉丁，透析袋、10kD和30kD超滤管、甲醇、睾酮和睾酮-13C3购自于默克，超纯水购自于屈臣氏，睾酮抗体购自于Thermo，磁微粒和磁力架购自于英芮诚生化科技有限公司。
本发明中所用的质谱仪为Waters TQS，样品前处理所用的仪器是杭州佰辰医学检验所的iMS-1000设备。
实施例1
本实施例提供了检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。
其中，睾酮抗体偶联磁微粒配制：
1、抗体溶液预处理：使用10kD超滤管将1mg睾酮抗体于4℃，12000g离心10min，加500μL PBS，12000g离心10min，重复3次，使睾酮抗体保存液置换为PBS缓冲液。
2、磁微粒混合均匀，取1000μL(10mg)磁微粒加入到2mL EP管中，磁力架上磁性分离去除上清液。
3、加入去离子水，混合均匀，磁性分离去除上清液，再重复2次。
4、加入100μL PBS重悬磁微粒，磁性分离去除上清液，再重复2次。
5、加入50μL PBS重悬磁微粒，加入1mg睾酮抗体(提前溶于PBS)，室温旋转混合30min。
6、加入10μL现配的10mg/mL碳化二亚胺溶液，补充PBS使体系到总体积为1000μL，室温涡旋偶联1～3hr，磁性分离去除上清液。
7、加入100μL淬灭缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4)重悬磁微粒，涡旋混合30min，磁性分离去除上清液；
8、加入1000μL PBS，混合重悬磁微粒，磁性分离去除上清液，再重复2次。
9、偶联好的抗体偶联磁微粒加1mL 80-100％甲醇重悬，颠倒混匀3min，去除内源性睾酮和其它类固醇激素，重复数次，直至上清液中检测不到睾酮和其它类固醇激素，弃掉80-100％甲醇。
10、加60-79％甲醇重悬抗体偶联磁微粒，颠倒混匀3min，弃掉60-79％甲醇。再依次用50-59％甲醇、40-49％甲醇、30-39％甲醇、20-29％甲醇、0-19甲醇梯度恢复抗体活性，并将抗体偶联磁微粒保存在1-20％甲醇溶液中，使得抗体偶联磁微粒浓度达到0.5-3mg/mL。
睾酮试剂条配制
试剂条包括1号孔至15号孔，3号孔，4号孔与5号孔分别加入100-400μL PBS，作为洗涤液。6号孔加入30-100μL 10％甲醇配制的5ng/mL睾酮-13C3(Testosterone-13C3)和雄烯二酮-13C3(Androstenedione-13C3)内标。7号孔加入5-50μL睾酮抗体偶联磁微粒。9号孔加入100-300μL 70-100％甲醇，作为洗脱液。然后试剂条用封口铝膜密封，制成睾酮和雄烯二酮纯化试剂条，4℃保存。
睾酮和雄烯二酮定标曲线配制
用2％甲醇98％PBS-30％甲醇70％PBS配制溶液配置定标曲线，如表1所示，单位ng/mL，每管250μL封装，﹣80℃保存。
表1睾酮和雄烯二酮定标曲线浓度
睾酮和雄烯二酮质控品配制
血清用透析袋透析数次，去除血清中的睾酮和雄烯二酮，加入标准品配制低、高浓度质控品，睾酮和雄烯二酮低浓度质控品分别为0.25ng/mL和0.60ng/mL，高浓度质控品均为10.5ng/mL，每管250μL封装，﹣80℃保存。经前处理后上LC-MS/MS检测低、高质控靶值。
睾酮和雄烯二酮流动相配制
睾酮和雄烯二酮流动相成分为0.2mol/L乙酸铵、10％甲酸、90％水，配制时称取0.154g乙酸铵加入9mL纯净水和1mL甲酸的混合配置。使用8mL安瓿瓶分装，每瓶5.0mL进行分装，2-8度保存。
睾酮和雄烯二酮的试剂盒配制
将上述配制好的封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相组成睾酮和雄烯二酮的试剂盒。
实施例2
本实施例是采用实施例1所述的试剂盒，包括了以下的步骤：
样品处理
取待检测样品或定标曲线或质控品，加入到试剂条的孔1中，将试剂条放入iMS-1000仪器，放入对应数量的吸头，选择睾酮方法，点击开始按钮，12min后处理完成。从14孔取出100μL处理好的睾酮和雄烯二酮标线1-6、低、高质控品和待检样品到96孔板中，WatersTQS质谱仪检测。
色谱参数
1、色谱柱：Waters CORTECS C18(2.1×50mm，2.7μm)。
2、流动相A：取一瓶5mL的流动相加入495mL纯化水配制使用，配制成2mmol/L乙酸铵0.1％甲酸水溶液。
3、流动性B：取一瓶5mL的流动相加入495mL甲醇配制使用，配制成2mmol/L乙酸铵0.1％甲酸甲醇溶液。
4、液相色谱洗脱梯度见表2：
表2液相色谱洗脱梯度
| Time(min) | Flow(mL/min) | A％ | B％ |
| Initial | 0.45 | 55 | 45 |
| 1 | 0.45 | 55 | 45 |
| 2.3 | 0.45 | 10 | 90 |
| 2.5 | 0.45 | 10 | 90 |
| 2.6 | 0.45 | 55 | 45 |
| 3 | 0.45 | 55 | 45 |
4、流速：0.5mL/min；柱温：45℃；进样：15μL。
质谱参数
1、质谱型号和扫描模式：I-class Waters TQS，正离子模式；
2、毛细管电压：0.8kv；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：150L/hr；
3、扫描模式：多反应监测(MRM)，各化合物质谱参数见表3：
表3睾酮多反应监测(MRM)质谱参数
正确度验证
通过检测Chromsystems diagnostics by HPLC&LC-MS/MS公司的Masschecksteroid Panel 2 serum control商业化质控中睾酮和雄烯二酮结果来验证试剂盒的正确度。同时检测卫生部2021年第二次内分泌室间质评202121到202125的等5个样品中睾酮结果进一步验证正确度。
试剂条、标线和质控6个月存储稳定性验证
实施例3
实验结果
睾酮抗体偶联磁微粒富集样品中的睾酮和雄烯二酮
如图1与表4所示，睾酮和雄烯二酮仅17位碳原子上连接的官能团不同，羟基和酮基的差别，分子量相差2Da，睾酮抗体偶联磁微粒可识别和富集样品中的睾酮和雄烯二酮及其各自的稳定同位素内标，经过液相色谱分离睾酮和雄烯二酮，进质谱检测，2个检测指标及其内标的峰面积在LC-MS/MS检测到的峰面积达到百万数量级，可应用于样品中这2个指标的检测。在样品处理开始加入同位素内标时校准，有效消除系统误差，使检测结果更可靠。与传统的液液萃取或固相萃取相比，本发明所述方法应用抗体特异性识别抗原的特征，使得富集后的睾酮和雄烯二酮样品成分单一，同时又加入同位素内标，几乎消除了基质效应。同时，富集后的样品更干净，不会造成管路和色谱柱堵塞，色谱柱更耐用，对质谱离子源和内部四级杆等部件不会产生污染，使得LC-MS/MS的维护频率和成本极大降低。
表4睾酮抗体偶联磁微粒富集到的睾酮和雄烯二酮LC-MS/MS检测峰面积
富集反应体系优化
比较PBS、10％甲醇90％水和10％甲醇90％PBS溶液等3种富集反应体系，检测3种条件下睾酮和雄烯二酮的峰面积，结果见表5。结果表明10％甲醇90％PBS溶液富集反应体系得到的睾酮和雄烯二酮及其内标峰面积最高，说明10％甲醇90％PBS富集反应体系更优。因为睾酮和雄烯二酮在PBS中溶解性较差，至少需要10％甲醇才能充分溶解，但是抗原抗体结合需要PBS这种缓冲液中的盐离子强度和pH值，因此结合PBS和10％甲醇的优点，可以使富集达到最佳效果。
表5不同富集体系中睾酮和雄烯二酮LC-MS/MS检测峰面积
抗体偶联磁微粒用量优化
比较20μL、30μL和40μL抗体偶联磁微粒对定标曲线最高点(15ng/mL)富集后化合物的峰面积来确定抗体偶联磁微粒的用量，结果如表6所示，20μL磁微粒比30μL和40μL的睾酮和雄烯二酮及其内标峰低很多，而30μL和40μL峰面积接近，说明20μL抗体偶联磁微粒不能全部富集标线最高点样品中的睾酮和雄烯二酮及其内标，30μL可以满足实验需求。
表6不同磁微粒用量睾酮和雄烯二酮LC-MS/MS检测峰面积
洗脱液甲醇浓度优化
磁微粒富集定标曲线最高点(15ng/mL)后用70％、80％和90％甲醇作为洗脱液洗脱，确定洗脱液甲醇浓度。结果如表7所示，70％甲醇组，睾酮和雄烯二酮及其内标峰面积较低，80％和90％甲醇组峰面积接近，说明70％甲醇不能充分洗脱抗体偶联磁微粒上富集到的睾酮和雄烯二酮及其内标，80％甲醇做为洗脱液可满足实验需求。
表7洗脱液甲醇浓度睾酮和雄烯二酮LC-MS/MS检测峰面积
线性结果
睾酮和雄烯二酮定标曲线范围均为0.05～15ng/mL，相关系数分别为0.9999和0.9994，符合要求(要求R2≥0.99)，结果见表8，图2与图3。
表8睾酮和雄烯二酮线性和保留时间
试剂盒检测正确度验证
通过检测Chromsystems diagnostics by HPLC&LC-MS/MS公司的Masschecksteroid Panel2serum control商业化质控低、中、高3个水平的睾酮和雄烯二酮结果来验证试剂盒的正确度，结果见表9。
表9商业质控检测结果
结果表明，检测值与理论靶值接近，均在允许范围内。
进一步的，检测卫生部2021年第二次内分泌室间质评202121到202125的等5个样品中睾酮结果来验证试剂盒的正确度，检测值与理论靶值接近，均在允许范围内，结果见表10。
表10. 2021年卫生部第二次室间质评样本检测结果
综合商业质控和卫生部室间质评结果判断，本发明所述试剂盒检测结果准确。
试剂条4℃存储6个月稳定性
分别于4℃存储1个月、3个月和6个月，检测试剂条稳定性，用试剂条分别检测低和高质控品的靶值，与0天(刚生产好的试剂条)的低和高质控靶值做比较，来判断试剂条的稳定性，要求CV<15％，偏差<15％，结果见表11。
表11试剂条4℃存储6个月稳定性测试结果
表11显示CV和偏差均<8％，符合要求，表明睾酮和雄烯二酮纯化试剂条可稳定6个月。质控品-80℃存储6个月稳定性
分别于-80℃存储1个月、3个月和6个月，检测低和高质控品的靶值，与0天(刚生产好的质控品)的低和高质控靶值做比较，来判断质控品稳定性，要求CV<15％，偏差<15％，结果见表12。
表12质控品-80℃存储6个月稳定性测试结果
表12显示CV和偏差均<8％，符合要求，表明睾酮和雄烯二酮低和高质控品可稳定6个月。
标线-80℃存储6个月稳定性
分别于-80℃存储1个月、3个月和6个月，检测标线2和标线5的靶值，与理论值做比较，来判断标线的稳定性，要求CV<15％，偏差<15％，结果见表13。
表13标线-80℃存储6个月稳定性测试结果
表13显示CV和偏差均<15％，符合要求，表明睾酮和雄烯二酮标线可稳定6个月。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括封闭化的单人份睾酮分离纯化试剂条、睾酮和雄烯二酮定标曲线、睾酮和雄烯二酮低高质控和流动相；所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标、洗涤液和洗脱液。
2.根据权利要求1所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述睾酮抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤：
1)睾酮抗体多次离心，超滤，保存在PBS缓冲液中；
2)将磁微粒混合均匀；
3)将步骤2)的磁微粒加入去离子水，混合均匀后磁性分离去除上清液，重复多次；
4)使用PBS缓冲液重悬步骤3)得到的磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
5)使用PBS缓冲液重悬步骤4)得到的磁微粒，加入步骤1)的睾酮抗体，室温下混合；加入碳化二亚胺溶液，补足体系体积，在室温下涡旋偶联，磁性分离去除上清液；
6)使用淬灭缓冲液重悬步骤5)得到的抗体偶联磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
7)重悬步骤6)得到的抗体偶联磁微粒，以去除内源性睾酮和类固醇激素；
8)使用由高到低梯度浓度的一元醇或乙腈溶液，恢复步骤7)得到的抗体偶联磁微粒的活性，并保存在1-20％一元醇或乙腈溶液中。
3.根据权利要求2所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，步骤8)的由高到低梯度浓度依次为：80-100％一元醇或乙腈、60-79％一元醇或乙腈、50-59一元醇或乙腈、40-49％一元醇或乙腈、30-39％一元醇或乙腈、20-29％一元醇或乙腈以及0-19％一元醇或乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述试剂条上设置有1号至15号的孔；其中，3号孔、4号孔与5号孔用于放置洗涤液；6号孔用于放置睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标；7号孔用于放置睾酮抗体偶联磁微粒；9号孔用于放置洗脱液。
5.根据权利要求4所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为100-400μL的PBS溶液。
6.根据权利要求4所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述睾酮和雄烯二酮稳定同位素内标为30-100μL体积分数2-30％一元醇或乙腈配制的5ng/mL睾酮-13C3与雄烯二酮-13C3。
7.根据权利要求4所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为100-300μL的体积分数为70-100％一元醇或乙腈溶液。
8.根据权利要求1所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述睾酮和雄烯二酮定标曲线由2％一元醇或乙腈溶液98％PBS-30％一元醇或乙腈溶液70％PBS配制，浓度分别为：雄烯二酮：0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL以及15ng/mL；睾酮：0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL以及15ng/mL。
9.根据权利要求1所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述睾酮和雄烯二酮低高质控分别为睾酮低浓度质控品0.25ng/mL与雄烯二酮低浓度质控品0.6ng/mL，睾酮高浓度质控品10.5ng/mL与雄烯二酮高浓度质控品10.5ng/mL。
10.根据权利要求1所述的一种检测睾酮和雄烯二酮的试剂盒，其特征在于，所述的流动相为0.2mol/L乙酸铵、10％甲酸与90％水。
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|---|---|---|---|---|
| CN108982880A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-12-11 | 湖南远璟生物技术有限公司 | 一种睾酮磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN109633180A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-04-16 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种游离睾酮化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
| CN113009017A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-22 | 杭州佰辰医学检验所有限公司 | 一种基于抗体偶联磁珠富集技术的激素质谱检测方法 |
-
2022
- 2022-02-09 CN CN202210121155.5A patent/CN114460198A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|
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