CN112051348B - 一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法，包括以下步骤：(1)向血清或血浆样本中加入内标工作液，混匀后静置，加入甲醇沉淀蛋白，再加入水调整有机相与水相的体积比为1:2，离心，获得预处理样本；(2)将固相萃取板孔进行活化处理，向活化处理后的固相萃取板孔中加入步骤(1)预处理后的样本，然后依次用淋洗液和洗脱液进行处理，采用收集板收集洗脱液处理后的馏分，再向收集板孔内加入水，涡旋混匀，封膜。采用本发明的萃取方法可以将包含整个类固醇激素代谢路径的19种类固醇激素，经过一次固相萃取处理即可同时获得。

Description

一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法
技术领域
本发明涉及类固醇激素固相萃取技术领域，具体涉及一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法。
背景技术
人体内类固醇激素可分为肾上腺皮质激素和性激素，类固醇激素是脂溶性激素，由胆固醇经一系列酶催化代谢产生，它们在结构上都是环戊烷多氢菲衍生物。类固醇激素分为肾上腺皮质激素和性激素。肾上腺皮质激素包括盐皮质激素和糖皮质激素；性激素包括孕激素、雄激素和雌激素。类固醇激素通过内分泌系统调节人体新陈代谢，对机体生长、发育、生殖及维持体内环境稳定等方面起着重要的作用。
类固醇激素检测可用于下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴代谢相关疾病的筛查、诊断、鉴别诊断和治疗监测，相关疾病包括肾上腺皮质增生症、肾上皮质功能减退、继发性高血压(原发性醛固酮增多症、库欣综合征等)、多囊卵巢综合征、性发育异常、性功能减退、肥胖、矮小症等。
固相萃取(SPE)是一种液相色谱分离方法，其利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物和干扰化合物分离，达到分离和富集目标化合物的目的。类固醇激素在人体内含量低，含量跨度范围大，从ng级到pg级均有分布，而且结构相似物多，甚至有同分异构体存在；再加之血清或血浆的基质复杂，因此，很难同时将类固醇激素从血清或血浆中高效准确地提取出来。目前很少见有利用固相萃取法从血清或血浆中提取类固醇激素的报道；而且现有报道的类固醇激素的提取方法也不能完整的包含整个类固醇激素代谢路径的主要激素。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法。采用本发明的萃取方法可以将包含整个类固醇激素代谢路径的19种类固醇激素，经过一次固相萃取处理即可同时获得。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法，包括以下步骤：
(1)向血清或血浆样本中加入内标工作液，混匀后静置，加入甲醇沉淀蛋白，再加入水调整有机相与水相的体积比，离心，获得预处理样本；
(2)对固相萃取板孔进行活化处理，向活化处理后的固相萃取板孔中加入步骤(1)预处理后的样本，然后依次用淋洗液和洗脱液进行处理，采用收集板收集洗脱液处理后的馏分，再向收集板孔内加入水，涡旋混匀，封膜，即萃取得到类固醇激素。
优选的，步骤(1)中，所述内标工作液由碳代或氘代类固醇激素与水配制而成。
优选的，步骤(1)中，所述血清或血浆样本与内标工作液加入的体积比为10：(0.5-1.5)；更优选为10:1。
优选的，步骤(1)中，所述血清或血浆样本与甲醇加入的体积比为1:(0.8-2)；更优选为1:1。
优选的，步骤(1)中，调整有机相与水相的体积比为1:2。
优选的，步骤(1)中，所述离心的条件为：4℃、12000rpm-13000rpm、5min-15min。
优选的，步骤(2)中，所述活化处理的方法为：依次采用甲醇、超纯水对固相萃取板孔进行活化处理。
优选的，步骤(2)中，所述淋洗液处理具体为：将第一淋洗液和第二淋洗液依次加入到固相萃取板孔；其中，第一淋洗液是由水和乙腈按体积比9:1配制而成；第二淋洗液为正己烷。
优选的，步骤(2)中，所述洗脱液是由乙腈和甲醇按体积比9:1配制而成；或者由乙腈和超纯水按体积比9:1配制而成；或者为纯乙腈。
优选的，步骤(2)中，所述固相萃取板为固相萃取96孔板。
优选的，步骤(2)中，所述固相萃取96孔板的吸附剂为用于酸、碱和中性化合物的亲水-亲脂平衡反相吸附剂。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用固相萃取方法，由于本发明所要萃取的类固醇激素与固相萃取孔板内的吸附剂具有高度亲和力，通过淋洗剂可以去除极性和非极性杂质，固相萃取基质对待测物的富集和杂质净化，可以大大提高检测灵敏度，实现对19种不同含量(ng-pg级)的类固醇激素的检测要求。
(2)与其他前处理方法相比，发明的方法操作简单，无需大型自动化设备或特殊装置，试剂使用量少，不仅节省成本而且减少对环境的影响；通量高，大批量样本分析时间短，96个样本在2h内即可完成前处理。
(3)本发明将内标工作液与待测物同步进行前处理，减少了前处理的误差；采用本发明处理后的样品可用于下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性轴相关疾病的检测。
附图说明
图1：本发明实施例1萃取得到的样品的类固醇激素的总离子流图(分峰)。
图2：本发明实施例1萃取得到的样品的类固醇激素的总离子流图(合峰)。
图3：本发明实施例2萃取得到的样品的类固醇激素的总离子流图。
图4：本发明对比例1萃取得到的样品的类固醇激素的总离子流图。
图5：本发明对比例2萃取得到的样品的类固醇激素的总离子流图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，由于类固醇激素在人体内含量低，含量跨度范围大，从ng级到pg级均有分布，而且结构相似物多，甚至有同分异构体存在；再加之血清或血浆的基质复杂，因此，很难同时将多种不同含量级的类固醇激素从血清或血浆中高效准确地提取出来。
基于此，本发明的目的是提供一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法，采用本发明的方法，可以将19种不同含量级别的类固醇激素经过一次固相萃取处理后即可同时获得。所述19种类固醇激素包括：孕激素(孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮)、盐皮质激素(11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮)、糖皮质激素(11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质醇、可的松)、雄激素(脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、双清睾酮)、雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇)。
在本发明的一种实施方案中，给出的血清或血浆样本中类固醇激素的固相萃取方法，包括以下步骤：
步骤01：取血清或血浆样本放于EP管内，加入内标工作液；加入纯甲醇混匀沉淀蛋白；再加入一定体积的水混匀，调整有机相与整体水相体积比为1:2，以提高待测物在固相萃取过程中的回收率；离心后蛋白与上清液分离，上清液即为获得的预处理样本；
步骤02：选取至少2个固相萃取板孔，对其进行活化处理；
步骤03：分别往经过步骤02活化后的固相萃取板孔内加入经过步骤01处理后的预处理样本；
步骤04：分别往经过步骤03处理后的固相萃取板孔内加入淋洗液，使其滴落干净；
步骤05：分别往经过步骤04处理后的固相萃取板内加入洗脱液，使其滴落于96孔收集板内，滴落干净；
步骤06：分别往经过步骤05处理后的96孔收集板内加入水，涡旋混匀，封膜待测。
在本发明的实施方案中，所述内标工作液为碳代或氘代类固醇激素与水涡旋混匀而成；其中，碳代或氘代类固醇激素通过市售渠道购买得到。
在本发明的实施方案中，所采用的固相萃取板为固相萃取96孔板(购买自厂家沃特世HLB型号固相萃取板)，该固相萃取板的吸附剂为用于酸、碱和中性化合物的亲水-亲脂平衡反相吸附剂，其对19种不同含量级别的类固醇激素均具有高度的亲和力。
在一些实施例中，所述步骤01中采用100μL-200μL纯甲醇对100μL样本进行蛋白沉淀。
在一些实施例中，所述步骤01中采用100μL-400μL超纯水对样本进行水相和有机相的比例调整。
在一些实施例中，所述步骤01中样本离心条件为4℃，12000rmp-13000rmp，5min-15min。
在一些实施例中，所述步骤02中依次采用200μL甲醇、200μL超纯水对固相萃取96孔板孔进行活化处理。
在一些实施例中，所述步骤03中加入250μL-600μL预处理样本。
在一些实施例中，所述步骤04中淋洗液分为淋洗液1和淋洗液2依次加入固相萃取96孔板，其中淋洗液1通过90mL水中加入10mL乙腈，超声5min-10min制备而成；淋洗液2为纯正己烷。
在一些实施例中，所述步骤05中洗脱液通过90mL乙腈中加入10mL甲醇或10mL超纯水，超声5min-10min制备而成；或者由纯乙腈配制而成。
对于固相萃取而言，除了固相萃取板的选择外，淋洗液和洗脱液的选择也尤为关键，淋洗液的目的是为了将杂质去除，洗脱液的目的是为了将目标成分洗脱下来。若淋洗液选择不合适，会导致杂质去除不完全或者将目标成分洗脱到废液中；若洗脱液选择不合适，会导致无法将目标成分有效的洗脱下来。
本发明所要固相萃取的目标对象为19种不同含量的类固醇激素，由于目标对象的种类多，含量差别大，因此，对淋洗液和洗脱液的选择尤为困难。本发明尝试了多种不同的淋洗液-洗脱液组合，例如：以不同浓度的甲醇水溶液、乙醇、乙酸乙酯等作为淋洗液，以纯甲醇、不同浓度的甲醇-甲酸溶液、乙腈、正己烷等作为洗脱液。结果发现：以10％的乙腈水溶液为第一淋洗液，以正己烷为第二淋洗液；以90％的乙腈水溶液或甲醇溶液，或以纯乙腈作为洗脱液，其对19种不同含量的类固醇激素萃取富集效果较优。
在一些实施例中，所述步骤06向收集板孔内加入40μL-60μL水，涡旋振荡1min-2min，封膜进行检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：
步骤01：取100μL血清样本放于EP管内；往血清样本中加入10μL内标工作液；加入100μL纯甲醇混匀沉淀蛋白；再加入水混匀1min，调整有机相与整体水相体积比为1:2；4℃，12000rpm，5min离心后收集上清液，获得预处理样本；
在制备内标工作液时，分别取内标20μL，加入180μL水，涡旋混匀备用。
步骤02：将固相萃取板孔依次用200μL甲醇和200μL超纯水对其进行活化处理；
步骤03：分别往活化后的固相萃取板孔内加入250μL的预处理样本；
步骤04：分别往固相萃取板孔内依次加入200μL体积分数为10％的乙腈水溶液(第一淋洗液)和200μL正己烷(第二淋洗液)进行淋洗，使其滴落干净；
步骤05：分别往的固相萃取板内加入50μL 90％乙腈溶液作为洗脱液，使其滴落于96孔收集板内，滴落干净；所述90％乙腈溶液是通过90mL乙腈中加入10mL甲醇，超声10min制备而成。
步骤06：分别往96孔收集板内加入50μL水，涡旋混匀2min，封膜，即萃取得到类固醇激素。
实施例2：
步骤01：取100μL血浆样本放于EP管内；往血浆样本中加入5μL内标工作液；加入80μL纯甲醇混匀沉淀蛋白；再加入水混匀1min，调整有机相与整体水相体积比为1:2；4℃，13000rpm，5min离心后收集上清液，获得预处理样本；
在制备内标工作液时，分别取内标20μL，加入180μL水，涡旋混匀备用。
步骤02：将固相萃取板孔依次用200μL甲醇和200μL超纯水对其进行活化处理；
步骤03：分别往活化后的固相萃取板孔内加入250μL的预处理样本；
步骤04：分别往固相萃取板孔内依次加入200μL体积分数为10％的乙腈水溶液(第一淋洗液)和200μL正己烷(第二淋洗液)进行淋洗，使其滴落干净；
步骤05：分别往的固相萃取板内加入50μL 90％乙腈溶液作为洗脱液，使其滴落于96孔收集板内，滴落干净；所述90％乙腈溶液是通过90mL乙腈中加入10mL超纯水，超声10min制备而成。
步骤06：分别往96孔收集板内加入50μL水，涡旋混匀2min，封膜，即萃取得到类固醇激素。
实施例3：
步骤01：取100μL血清样本放于EP管内；往血清样本中加入15μL内标工作液；加入120μL纯甲醇混匀沉淀蛋白；再加入水混匀1min，调整有机相与整体水相体积比为1:2；4℃，12000rpm，5min离心后收集上清液，获得预处理样本；
在制备内标工作液时，分别取内标20μL，加入180μL水，涡旋混匀备用。
步骤02：将固相萃取板孔依次用200μL甲醇和200μL超纯水对其进行活化处理；
步骤03：分别往活化后的固相萃取板孔内加入250μL的预处理样本；
步骤04：分别往固相萃取板孔内依次加入200μL体积分数为10％的乙腈水溶液(第一淋洗液)和200μL正己烷(第二淋洗液)进行淋洗，使其滴落干净；
步骤05：分别往的固相萃取板内加入50μL纯益精作为洗脱液，使其滴落于96孔收集板内，滴落干净；
步骤06：分别往96孔收集板内加入50μL水，涡旋混匀2min，封膜，即萃取得到类固醇激素。
对比例1：
将实施例2的步骤01中，“调整有机相与整体水相体积比为1:2”调整为“调整有机相与整体水相体积比为1:1”，其余步骤同实施例1。
对比例2：
将实施例2的步骤04中的第一淋洗液和第二淋洗液替换为“20％乙腈”，步骤05中的洗脱液替换为50％乙腈。
需要说明的是，上述实施例和对比例的血清或血浆样本采集时，均为上午8:00-10:00，空腹采血1mL。
用本发明实施例1-3以及对比例1-2的方法对样本和标曲进行处理，并用液相色谱串联质谱仪进行检测。其中，液相条件包括：色谱柱为C8柱，柱温50℃，进样量20μL，流动相A为0.5mM/L氟化铵水溶液，流动相B为纯甲醇；质谱条件包括：离子源温度600℃，去溶剂气1100L/Hr，采用多反应监测模式进行检测。
采用实施例1的方法萃取得到的类固醇激素的检测结果如图1和图2所示，结果表明，19种类固醇激素峰型和分离度好，杂质干扰小，满足定量分析要求。
采用实施例2的方法萃取得到的类固醇激素的检测结果如图3所示，采用对比例1和对比例2的方法萃取得到的类固醇激素的检测结果分别如图4、图5所示，结果表明，调整有机相与整体水相体积比为1:1时，保留时间在前的皮质醇、可的松、醛固酮等化合物，因有机相含量高高，导致待测物无法在固相萃取柱中保留，仪器未检测到(图4)；调整淋洗液为20％乙腈，洗脱液为50％乙腈时，整体待测物回收效果不佳，导致待测物响应低(图5)；而与之相比，采用本申请实施例2的处理方式，待测物回收效果好，响应较之大大提升(图3)。
与其他前处理方法相比，本法操作简单，无需大型自动化设备或特殊装置，试剂使用量少，不仅节省成本而且减少对环境的影响；通量高，大批量样本分析时间短，96个样本在2h内即可完成前处理。
本发明使用同位素内标法定量类固醇激素，内标与待测物同步进行前处理，减少了前处理误差，并通过全面的方法学验证，线性、准确度、精密度均满足要求，可用于下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性轴相关疾病的检测。但需要说明的是，本发明涉及的是样品前处理的过程，其目的并非是直接用于疾病的诊断。
用本发明所述固相萃取方法进行方法学验证。采用内标法进行线性回归分析，相关系数r2＞0.995，线性良好。低浓度精密度＜±20％，高浓度精密度＜±15％。
综上所述，本发明采用固相萃取方法，由于本发明所要萃取的19种类固醇激素与固相萃取基质具有高度亲和力，通过淋洗剂可以去除极性和非极性杂质，固相萃取基质对待测物的富集和杂质净化，可以大大提高检测灵敏度，实现不同含量(ng-pg级)的类固醇激素的检测要求。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向血清或血浆样本中加入内标工作液，混匀后静置，加入甲醇沉淀蛋白，再加入水调整有机相与水相的体积比，离心，获得预处理样本；
（2）对HLB型号固相萃取板孔进行活化处理，向活化处理后的固相萃取板孔中加入步骤（1）预处理后的样本，然后依次用淋洗液和洗脱液进行处理，采用收集板收集洗脱液处理后的馏分，再向收集板孔内加入水，涡旋混匀，封膜，即萃取得到类固醇激素；
所述类固醇激素包括：孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质醇、可的松、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、雌酮、雌二醇和雌三醇；
步骤（1）中，调整有机相与水相的体积比为1:2；
步骤（2）中，所述淋洗液处理具体为：将第一淋洗液和第二淋洗液依次加入到固相萃取板孔；其中，第一淋洗液是由水和乙腈按体积比9:1配制而成；第二淋洗液为正己烷；
步骤（2）中，所述洗脱液是由乙腈和甲醇按体积比9:1配制而成，或者由乙腈和超纯水按体积比9:1配制而成，或纯乙腈配制而成。
2.根据权利要求1所述的固相萃取方法，其特征在于，步骤（1）中，所述内标工作液是由碳代或氘代类固醇激素与水配制而成。
3.根据权利要求2所述的固相萃取方法，其特征在于，所述血清或血浆样本与内标工作液加入的体积比为10:0.5-10:1.5。
4.根据权利要求3所述的固相萃取方法，其特征在于，所述血清或血浆样本与内标工作液加入的体积比为10:1。
5.根据权利要求1所述的固相萃取方法，其特征在于，步骤（1）中，所述血清或血浆样本与甲醇加入的体积比为1:0.8-1:2。
6.根据权利要求5所述的固相萃取方法，其特征在于，所述血清或血浆样本与甲醇加入的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的固相萃取方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心的条件为：4℃、12000rpm-13000rpm、5min-15min。
8.根据权利要求1所述的固相萃取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述活化处理的方法为：依次采用甲醇、超纯水对HLB 型号 固相萃取板孔进行活化处理。
9.根据权利要求1-8任一项所述的固相萃取方法，其特征在于，步骤（2）中，HLB型号固相萃取板为固相萃取96孔板。
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