CN111323507A - 基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法 - Google Patents

基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，该检测方法的准确度好、灵敏度高，可以为相关疾病的判断治疗以及健康评估提供条件，同时，同时检测11种类固醇也可提高相关疾病诊断的准确性，比如血清睾酮和脱氢表雄酮硫酸酯的同时检测可提高多卵巢综合征的诊断率，但该方法不用于诊断目的。

Description

基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法
技术领域
本发明涉及类固醇检测领域，特别涉及一种基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法。
背景技术
类固醇激素是一类脂溶性的小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化代谢产生的，其能通过内分泌系统调节人体新陈代谢，同时对生长、发育、生殖及维持人体内环境稳定等方面都起着重要的调节作用。另外，类固醇激素在人体内各种酶的催化下会相互代谢，不断产生或消耗，从而维持在一个动态的平衡状态，如若人体内出现酶缺失或者酶失衡，就会直接反应在类固醇激素在人体内的含量。例如，在先天性肾上腺皮质增生症中21-羟化酶缺陷是最常见的一种情况，该酶的缺陷会导致17α-羟孕酮、孕酮、雄烯二酮和脱氢异雄酮的浓度升高，而醛固酮、皮质酮和皮质醇的浓度降低，所以临床上可以通过准确检测每种类固醇激素的浓度并了解其相互之间的代谢通路，以期帮助医生对相关疾病(先天性肾上腺增生、多卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等)进行判断和治疗监测。
目前，类固醇激素的检测方法主要有化学免疫法、液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术。化学免疫法存在以下缺陷：一是灵敏度低，当样本浓度很低时，需要较大的样本量富集、纯化；二是适用性差，待测物的抗体易与结构相似的内源性物质或代谢产物产生交叉反应，造成假阳性结果；三是分析效率低，通常一次只能测定一种物质，无法同时进行多种激素的定性和定量分析。气相色谱-质谱联用技术虽然灵敏度高，但往往需要繁琐的衍生化步骤和较长的分析时间，并且一种衍生化试剂较难适用于所有类固醇激素。相较而言，LC-MS/MS技术则避免了气相色谱法烦琐的衍生化步骤，且专属性强，能够很好地排除基质中类似结构物质的干扰，是目前最可靠的检测方法。
就样本类型而言，类固醇激素检测的样本常选择血液、唾液和尿液。然而不同的检测样本之间也存在着差异，具体表现如下：如若需要检测尿液中的类固醇激素，则需要收集24小时尿样，且过程复杂且样本不易保存，因而较少被使用。如果选择唾液作为类固醇激素检测的样本，但是由于唾液中类固醇激素含量较低，多数处于pg级别，主要的类固醇技术包括皮质醇、脱氢表雄酮、睾酮、雌二醇和黄体酮，其能检测到类固醇激素种类有限，并且对于带电荷的类固醇，如脱氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)，其进入唾液的方式是通过腺泡细胞间的紧密连接扩散，其浓度与唾液流失率成反比，唾液的pH值也会随着唾液流失率的改变而改变，从而影响带电类固醇的分配，即利用唾液检测带电荷的类固醇是不准确的。区别于其他检测样本，由于类固醇激素是经高度分化的内分泌细胞合成并直接分泌进入血液的，随血液循环到达一定的组织细胞以发挥作用，因此类固醇激素在血液中的种类丰富，含量明显高于其他基质，因此常作为内分泌类疾病诊断指标，其中血清作为血液的重要组成部分，常在临床上被作为类固醇激素检测的基底，进行健康评价和相关疾病的诊断。
针对血清中类固醇激素的提取方法主要集中在蛋白沉淀、液液萃取和固相萃取。蛋白质沉淀简单易操作，成本低，但该方法会降低检测灵敏度，且基质效应较严重。固相萃取法利用待测物在液相和固相的分配差异来实现萃取过程，类似于色谱柱分离过程，既能有效减少基质效应，又能实现纯化富集。
目前现有技术CN104807921A阐述了一种高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，其运用液液萃取和衍生化结合的方式对血清中的类固醇激素进行提取，所需时间超过1小时，且仪器分析时间达10min，较长的前处理时间会限制临床上的应用。现有技术CN110389185A阐述了一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法以及对该类固醇激素的检测方法，同样运用固相萃取对唾液中类固醇激素进行富集，灵敏度有所提高，但可检测的激素种类仍然有限，这会影响相关疾病的诊断的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，该检测方法的准确度好、灵敏度高，可以为相关疾病的判断治疗以及健康评估提供条件，同时，同时检测11种类固醇也可提高相关疾病诊断的准确性，比如血清睾酮和脱氢表雄酮硫酸酯的同时检测可提高多卵巢综合征的诊断率，但该方法不用于诊断目的。
值得一提的是，本方案先使得血清中蛋白变性，释放出与蛋白结合的类固醇，离心去除蛋白，进而为固相萃取做准备。本方案的灵敏度高体现在：各目标物定量下限达pg级别，且保证CV％<20％；满足不同年龄组人群的样本检测；准确度好体现在：通过加标回收实验验证和测试有证参考物质予以验证，11种类固醇回收率在87.65％～108.87％；满足80％～120％的要求。
本技术方案提供一种基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，用于同时检测11种类固醇，11种类固醇激素分别为：皮质素(可的松)、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕烯醇酮、17a-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯，与CN110389185A相比，本方案检测可检测皮质素(可的松)、11-脱氧皮质醇、皮质酮、雄烯二酮、17-羟孕烯醇酮、17a-羟孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯；上述类固醇激素对人体生产发育、性成熟及新陈代谢至关重要。，采用同位素内标法的方法实现11种类固醇的定量测定，以目标化合物与其同位素内标的浓度为X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述11种类固醇激素的含量。
具体测定方法如下：
对血清样本进行蛋白沉淀以及固相萃取预处理，得到检测样本：
准确称取血清样本，往血清样本中添加含有11种同位素内标的蛋白沉淀剂，加纯化水稀释并涡旋混匀，置于设定条件下离心得到离心液；将处理过的样本过固相萃取板，用15％的乙醇水淋洗固相萃取板，于低真空度条件下抽干固相萃取板，之后，使用乙腈分两次洗脱固相萃取板，最后再用5％甲醇水调整有机相的比例，得到检测样本，这里的检测样本指的是用5％甲醇水调整过的洗脱液。
值得一提的是，以上步骤比对CN 110389185A相比：①省去了活化和平衡的步骤；②一步富集浓缩，不需要经过氮吹浓缩复溶。
其中11种同位素内标分别为：皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、2500ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6。
具体的，准确移取200μL血清样本，加入含有11种同位素内标的蛋白沉淀剂200μL，再加入500μL纯化水予以稀释，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；将上述处理过的样本过板，用200μL15％乙醇水淋洗，并在低真空度条件下抽干固相萃取板；之后，再用60μL乙腈分两次洗脱，最后用60μL5％甲醇水调整有机相的比例，保证色谱峰的对称性。
对检测样本进行高效液相色谱串联质谱分析：
色谱条件如下：流动相A：甲酸+乙酸铵+纯水；流动相B：甲酸+乙酸铵+甲醇；色谱柱型号：Waters UPLC HSS T3(2.1mm*50mm,1.8μm)+在线过滤器；柱温：50℃±5℃；进样量：5-15μL；进样盘温度：8℃±5℃；流速为0.4mL/min；
采用梯度洗脱方式，见表一：
表一梯度洗脱条件
Figure BDA0002421590200000051
具体的，在本技术方案中选择流动相为：0.1％甲酸+2mmol/L乙酸铵+纯水；流动相B相选择为：0.1％甲酸+2mmol/L乙酸铵+甲醇；进样量：10μL。
质谱条件：电喷雾正负离子切换；采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压：2.8-3.4kV；去溶剂气温度：600-7000℃；去溶剂气流速：750-820L/Hr；可以是：毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：650℃；去溶剂气流速：800L/Hr，下表二为11种类固醇激素的激素质谱参数：
表二：11种类固醇激素的激素质谱参数
Figure BDA0002421590200000052
Figure BDA0002421590200000061
Figure BDA0002421590200000071
计算11种类固醇激素的含量：
将上述色谱串联质谱法得到的11种类固醇与其同位素内标的峰面积代入标准曲线中得到11种类固醇的含量。
标准曲线的制备方法如下：
配置不同浓度的混合有11种类固醇的类固醇混合测试液，在上述相同的条件下进行样本预处理以及色谱串联质谱检测，以类固醇与其对应同位素内标的浓度比为X轴，类固醇与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线。
具体的，类固醇混合测试液的制备如下：
取对应的类固醇标准品利用甲醇溶解得到对应的类固醇标准品母液，对类固醇标准品母液利用甲醇定容得到对应的类固醇标准品中间液，取11种类固醇标准品中间液进行混合定容得到类固醇混合母液，对类固醇混合母液进行稀释得到不同浓度的类固醇混合中间液，将类固醇混合中间液利用5％甲醇水稀释得到类固醇混合测试液。
在本技术方案中，类固醇混合测试液中：皮质素的参考浓度范围选择为：0.125-500ng/mL，具体可选择为500/125/50/12.5/5/2.5/1.25/0.5/0.25/0.125ng/mL；另外在类固醇混合测试液中皮质素/皮质醇/11-脱氧皮质醇/皮质酮/脱氢表雄酮/雄烯二酮/睾酮/17-羟孕烯醇酮/17-羟孕酮/孕酮/脱氢表雄酮硫酸酯的浓度为：50：100:10：5:10:2：5:20：10:5:2000；可以皮质素的浓度为基准获取其他类固醇的浓度，本申请人在反复试验验证之后发现在此浓度范围内选择的类固醇浓度检测效果最佳。
蛋白质沉淀剂中皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、2500ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6的浓度比为：10：10：5：2.5：50:1：5：5：10：10：250。皮质素-d7的浓度范围为：20ng/mL。
相较现有技术，本技术方案具有以下的特点和有益效果：由于类固醇及其代谢物是一类庞大而复杂的家庭，不同激素之间的化学性质和极性千差万别，本方案首创地将几类样品前处理技术联用，将蛋白沉淀法与固相萃取法相结合，既能提高待测物的纯化和富集效果，同时也能提高检测的灵敏度和重现性，非常适合临床复杂样本的分析。具体的，本方案运用蛋白沉淀对血清样本进行预处理，再借助固相萃取技术对预处理后的样本进行净化和富集，达到提高灵敏度和重现性的效果，可同时对96个血清样本进行处理，处理时长不超过1小时，11种类固醇激素在超高效液相色谱串联质谱上的分离检测可在8.5min内完成，本方案之所以能够在8.5min内完成是因为在流动相中加入甲酸有利于增强正离子监测模式下，分析物的离子化效率，增强信号强度，提高检测灵敏度；加入乙酸铵增加了流动相的缓冲能力，改善了峰形，使各目标物分离良好。由于类固醇激素与C18色谱柱作用力较强，以55％水相-45％有机相作为初始流动相，增强流动相的洗脱能力，使目标峰提前出峰；再以较低的速率(3.3％/min)增加有机相比例，使目标物逐一出峰，保证了良好的分离度；最后，99％的有机相冲洗色谱柱1min，将非极性杂质冲出系统，同时通过质谱端阀位切换，在冲洗色谱柱阶段，将杂质切换至废液，减少基质效应。且各目标化合物分离度良好，灵敏度满足临床样本的检测。
综上，基于固相萃取结合超高效液相色谱串联质谱法测定血清中11种类固醇激素的方法分析时间短，可同时处理96份样本，且灵敏度高、重现性好，可有限解决临床样本的数量多、基底复杂、目标化合物浓度低等问题。
附图说明
图1是11种类固醇标准品的总离子流图。
图2到图12是11种类固醇激素标准品的标准曲线，该标准曲线以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴。
图13和图14是11种类固醇的检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下提供具体的实验内容：
实验样本：
方法学研究的样本来自于州佰辰医学检验所有限公司于2019年8月体检的血清样本。
实验仪器：Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD(美国，Waters)；ST16R台式高速冷冻离心机(美国，ThermoFisher Scientific)；G560E涡旋混合器(美国，ScientificIndustries公司)；BT125D电子天平(德国，赛多利斯股份公司)；M10-XT通道固相萃取仪(美国，Tecan)；量筒、离心管。
实验试剂耗材：
色谱纯甲醇(美国，默克)；色谱纯乙腈(美国，默克)；色谱纯甲酸(美国，阿拉丁)；色谱纯乙酸铵(美国，阿拉丁)；纯化水(中国，屈臣氏)；PrimeμElution96孔固相萃取板(美国，Waters)；HSS T3(2.1mm*50mm,1.8μm)配在线过滤器(美国，Waters)。
标准品：
脱氢表雄酮硫酸酯、睾酮-13C3、脱氢表雄酮、购自Sigma-Aldrich，雄烯二酮、脱氢表雄酮-d5、皮质醇、孕酮、皮质素(可的松)购自麦克林，脱氢表雄酮硫酸酯-d6、17-羟孕烯醇酮-13C22H2购自CIL，皮质醇-d4、皮质酮、孕酮-d9、17a-羟孕酮购自TRC，睾酮购自DR，11-脱氧皮质醇-d5、17-羟孕酮-d8购自cerilliant，皮质酮-d4、皮质素-d7购自Isoscience，11-脱氧皮质醇购自TCI，17-羟孕烯醇酮、雄烯二酮-13C3购自TRC，纯度≥98％。
质控品：
含有皮质素(可的松)、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕烯醇酮、17a-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯的空白血清，分高、中、低三个浓度分别为QCL、QCM、QCH，具体的11种类固醇激素质控品对应的浓度见表三：
表三：11种类固醇激素质控品对应的浓度(单位：ng/mL)
Figure BDA0002421590200000111
实验方法：
(1)色谱条件：
高效液相色谱条件：流动相A：0.1％甲酸+2mmol/L乙酸铵+纯水；流动相B：0.1％甲酸+2mmol/L乙酸铵+甲醇；色谱柱型号：Waters UPLC HSS T3(2.1mm*50mm,1.8μm)+在线过滤器；柱温：50℃±5℃；进样量：10μL；进样盘温度：8℃±5℃；流速为0.4mL/min；采用梯度洗脱方式，见表1。
(2)质谱条件：
在电喷雾(ES，Electrospray ionization)正负离子切换模式下；采用多反应监测(MRM，multiple reaction monitoring)的质谱扫描模式，毛细管电压(Capillary)：3.0kV；去溶剂气温度(Desolvation Temp)：650℃；去溶剂气流速(Desolvation)：800L/Hr；同时监测目标物以及同位素内标，再分别对各目标物的锥孔电压和碰撞电压进行了优化，以便达到更高的稳定性和灵敏度。
(3)标准品配制：
分别准确称取10.0mg皮质素、10.0mg皮质醇、10.0mg 11-脱氧皮质醇、10.0mg皮质酮、10.0mg脱氢表雄酮、10.0mg雄烯二酮、10.0mg睾酮、10.0mg 17-羟孕烯醇酮、10.0mg17-羟孕酮、10.0mg孕酮、10.0mg脱氢表雄酮硫酸酯，分别加入5mL、5mL、10mL、10mL、5mL、10mL、10mL、5mL、5mL、5mL、10mL甲醇，配制成浓度分别为2.0mg/mL皮质素标准品母液、2.0mg/mL皮质醇标准品母液、1.0mg/mL 11-脱氧皮质醇标准品母液、1.0mg/mL皮质酮标准品母液、2.0mg/mL脱氢表雄酮标准品母液、1.0mg/mL雄烯二酮标准品母液、1.0mg/mL睾酮标准品母液、2.0mg/mL 17-羟孕烯醇酮标准品母液、2.0mg/mL 17-羟孕酮标准品母液、1.0mg/mL孕酮标准品母液、10.0mg/mL脱氢表雄酮硫酸酯标准品母液。
分别移取100μL2.0mg/mL皮质素标准品母液，用甲醇定容至1mL得到200.0μg/mL皮质素标准品中间液；移取100μL2.0mg/mL皮质醇标准品母液，用甲醇定容至1mL得到200.0μg/mL皮质醇标准品中间液；移取20μL1.0mg/mL11-脱氧皮质醇标准品母液，用甲醇定容至1mL得到20.0μg/mL11-脱氧皮质醇标准品中间液；移取20μL1.0mg/mL皮质酮标准品母液，用甲醇定容至1mL得到20.0μg/mL皮质酮标准品中间液；移取10μL2.0mg/mL脱氢表雄酮标准品母液，用甲醇定容至1mL得到20.0μg/mL脱氢表雄酮标准品中间液；移取10μL1.0mg/mL雄烯二酮标准品母液，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL雄烯二酮标准品中间液；移取20μL1.0mg/mL睾酮标准品母液，用甲醇定容至1mL得到20.0μg/mL睾酮标准品中间液；移取50μL2.0mg/mL 17-羟孕烯醇酮标准品母液，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL17-羟孕烯醇酮标准品中间液；移取10μL2.0mg/mL 17-羟孕酮标准品母液，用甲醇定容至1mL得到20.0μg/mL17-羟孕酮标准品中间液；移取100μL1.0mg/mL孕酮标准品母液得到200μg/mL孕酮标准品中间液。
分别从上述皮质素标准品中间液、皮质醇标准品中间液、11-脱氧皮质醇标准品中间液、皮质酮标准品中间液、脱氢表雄酮标准品中间液、雄烯二酮标准品中间液、睾酮标准品中间液、17-羟孕烯醇酮标准品中间液、17-羟孕酮标准品中间液、孕酮标准品中间液、脱氢表雄酮硫酸酯标准品母液25μL、50μL、50μL、25μL、50μL、20μL、25μL、20μL、50μL、25μL、200μL，用甲醇定容至1mL，得到类固醇混合母液；类固醇混合母液用甲醇稀释得到类固醇混合测试液。
(4)蛋白沉淀剂配置：
分别移取20μL 200μg/mL皮质素-d7、20μL 200μg/mL皮质醇-d4、20μL 100μg/mL11-脱氧皮质醇-d5、20μL 50μg/mL皮质酮-d4、100μL200μg/mL脱氢表雄酮-d5、20μL 20μg/mL雄烯二酮-13C3、20μL 100μg/mL睾酮-13C3、20μL 100μg/mL 17-羟孕烯醇酮-13C22H2、40μL 100μg/mL 17-羟孕酮-d8、20μL 200μg/mL孕酮-d9、500μL 1000μg/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6，加甲醇定容至1mL，配制成混合内标液，再准确移取250μL混合内标液，用A液定容至50mL，配制成内标浓度分别为20.0ng/mL皮质素-d7、20.0ng/mL皮质醇-d4、10.0ng/mL 11-脱氧皮质醇-d5、5.0ng/mL皮质酮-d4、100ng/mL脱氢表雄酮-d6、2.0ng/mL雄烯二酮-13C3、10.0ng/mL睾酮-13C3、10.0ng/mL17-羟孕烯醇酮-13C22H2、20.0ng/mL 17-羟孕酮-d8、20.0ng/mL孕酮-d9、2500ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6蛋白沉淀剂。
(5)样本处理：
5.1校准曲线的处理：准确移取200μL类固醇混合测试液的各浓度点，加入含有11种同位素内标的蛋白沉淀剂200μL，再加入500μL纯化水予以稀释，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min。
将处理过的样本过固相萃取板，再200μL用15％乙醇水淋洗，并在低真空度条件下抽干固相萃取板；之后，再用70μL乙腈分两次洗脱，最后用50μL5％甲醇水体调整有机相的比例，保证色谱峰的对称性。
5.2血清样本的前处理：
取检测血清200μL于1.5mL离心管中，然后跟标准曲线前处理方法一致，此处不再赘述。
5.3质控品的前处理：
分别取质控品QCL、QCM、QCH各200μL于1.5mL离心管中，然后跟标准曲线前处理方法一致，此处不再赘述。
(6)数据处理：
5.1得到的标准曲线如图2到图11所示，11种类固醇激素在对应浓度范围内线性拟合方程线性良好，相关系数均在0.995以上，具体的，11种类固醇激素的标准曲线方程如表四所示。
表四：11种类固醇激素的标准曲线方程
Figure BDA0002421590200000151
5.2得到的血清中11种类固醇激素的检测图如图13所示，本方案选择了10组血清样本进行检测，具体的检测数据如表五：
表五血清样本中11种类固醇的检测数据(单位：ng/mL)
Figure BDA0002421590200000152
Figure BDA0002421590200000161
(7)方法验证：
6.1精密度实验：
购买去激素血清，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以同位素内标法定量测定11种类固醇激素的浓度，日内精密度范围为2.291％～13.585％；三天内分析3批，计算日间精密度范围为2.72％～14.94％。检测数据表如表六所示。
表六低，中，高质控品的日内间精密度
Figure BDA0002421590200000162
Figure BDA0002421590200000171
6.2回收率实验：
购买有证参考物质，以相同步骤重复处理，平行6份，结果计算如表7所示，结果显示，11种类固醇激素的加标回收率在87.65％～108.87％之间，6份平行样的CV在2.57％～10.72％范围，如表七所示。
表七11种类固醇激素的加标回收率结果(单位：ng/mL)
Figure BDA0002421590200000172
Figure BDA0002421590200000181
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:对血清样本进行蛋白沉淀以及固相萃取预处理，得到检测样本：
准确称取血清样本，往血清样本中添加含有11种同位素内标的蛋白沉淀剂，加纯化水稀释并涡旋混匀，置于设定条件下离心得到离心液；将处理过的样本过固相萃取板，15％乙醇水淋洗固相萃取板，于低真空度条件下抽干固相萃取板，之后，使用乙腈分两次洗脱固相萃取板，最后再用乙腈调整有机相的比例，得到检测样本；
S2：对检测样本进行高效液相色谱串联质谱分析，
其中11种类固醇激素分别为：皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕烯醇酮、17a-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯；11种同位素内标分别为：皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、2500ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6。
2.根据权利要求1所述的基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，其特征在于，色谱条件如下：流动相A：甲酸+乙酸铵+纯水；流动相B：甲酸+乙酸铵+甲醇；色谱柱型号：Waters UPLC HSS T3+在线过滤器；柱温：50℃±5℃；进样量：5-15μL；进样盘温度：8℃±5℃；流速为0.4mL/min。
3.根据权利要求2所述的基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，其特征在于，质谱条件：电喷雾正负离子切换；采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压：2.8-3.4kV；去溶剂气温度：600-7000℃；去溶剂气流速：750-820L/Hr；可以是：毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：650℃；去溶剂气流速：800L/Hr。
4.根据权利要求1所述的基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，其特征在于，进一步包括步骤S3:计算11种类固醇激素的含量：将上述色谱串联质谱法得到的11种类固醇与其同位素内标的峰面积的比值代入标准曲线中得到11种类固醇的含量。
5.根据权利要求1所述的基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，其特征在于，配置不同浓度的混合有11种类固醇的类固醇混合测试液，在与步骤S1和步骤S2相同的条件下进行样本预处理以及色谱串联质谱检测，以类固醇的浓度为X轴，类固醇与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，其中类固醇混合测试液中皮质素/皮质醇/11-脱氧皮质醇/皮质酮/脱氢表雄酮/雄烯二酮/睾酮/17-羟孕烯醇酮/17-羟孕酮/孕酮/脱氢表雄酮硫酸酯的浓度比为：50：100:10：5:10:2：5:20：10:5:2000。
6.根据权利要求1所述的基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，其特征在于，蛋白质沉淀剂中皮质素-d7、皮质醇-d4、11-脱氧皮质醇-d5、皮质酮-d4、脱氢表雄酮-d6、雄烯二酮-13C3、睾酮-13C3、17-羟孕烯醇酮-13C22H2、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、2500ng/mL脱氢表雄酮硫酸酯-d6的浓度比为：10：10：5：2.5：50:1：5：5：10：10：250。
7.根据权利要求5所述的基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法，其特征在于，类固醇混合测试液的制备如下：取对应的类固醇标准品利用甲醇溶解得到对应的类固醇标准品母液，对类固醇标准品母液利用甲醇定容得到对应的类固醇标准品中间液，取11种类固醇标准品中间液进行混合定容得到类固醇混合母液，对类固醇混合母液进行稀释得到不同浓度的类固醇混合中间液，将类固醇混合中间液利用5％甲醇水稀释得到类固醇混合测试液。
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