CN112098532A - 一种改进的高效液相色谱串联质谱人血清中15种胆汁酸的检测方法 - Google Patents

一种改进的高效液相色谱串联质谱人血清中15种胆汁酸的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括蛋白质沉淀、样品稀释、高效液相色谱串联质谱法进行分析检测。本方法具有效率高、成本低、操作简便、准确度和灵敏度高等优点，适合大量临床样本的快速检测。

Description

一种改进的高效液相色谱串联质谱人血清中15种胆汁酸的检 测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，本方法步骤包括蛋白质沉淀、样品稀释、高效液相色谱串联质谱法进行分析检测，具有效率高、成本低、操作简便、准确度和灵敏度高等优点，适合大量临床样本的快速检测。
背景技术
胆汁酸为胆汁的主要成分，是一类胆烷酸的总称。胆汁酸具有多种同分异构体，根据结构可分为游离型和结合型胆汁酸，游离型胆汁酸主要包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和石胆酸，结合型胆汁酸为上述游离型胆汁酸与甘氨酸和牛磺酸结合的产物。根据生成部位，胆汁酸又可分为初级和次级胆汁酸。胆汁酸主要在肝细胞中合成代谢转化，胆汁酸在脂肪代谢中发挥重要作用，例如，胆汁酸可以促进脂肪分解吸收，胆汁酸的分子结构同时具有亲水性和疏水性基团，与界面活性分子一样，能够降低油相和水相之间的表面张力，促进脂类的乳化。同时，胆汁酸可预防人体胆结石产生，胆固醇随胆汁排入胆囊中储存，胆囊中胆汁浓缩后，胆固醇易沉淀析出形成胆结石，胆汁酸盐和卵磷脂可以使胆固醇分散成可溶性的微团，从而抑制结石的产生。此外，胆汁酸参与体内的肠肝循环，从而提高其使用效率。肝胆功能异常患者胆汁酸合成转化能力和肠肝循环功能异常，其血清胆汁酸谱会发生显著的改变。例如，孕妇在妊娠中晚期会特发一种妊娠期肝内胆汁酸淤积症(ICP)，易导致胎儿宫内窘迫及早产，甚至引起胎死宫内等不良围产结局。ICP孕妇最显著的生化异常是血清中胆汁酸快速升高，血清胆汁酸是ICP诊断的最常用指标。目前临床实验室对胆汁酸的测定多为总胆汁酸测定，但是对于不同疾病，总胆汁酸可能相同，但胆汁酸谱不同。例如，临床ICP和妊娠期无症状高胆汁酸血症(AHP)均引起总胆酸的升高，难以根据总胆汁酸水平进行区分，但从胆汁酸分型水平分析，AHP主要特征为熊脱氧胆酸升高，而ICP表现为石胆酸和游离胆汁酸升高。总之，血清胆汁酸谱的检测对于临床评价肝胆功能和疾病诊断，特别是对于不同类型的肝胆疾病的诊断，具有重要的指导意义。
目前常用的胆汁酸检测方法主要有酶循环法和高效液相色谱法，这些检测方法主要存在以下一些问题：酶循环法只能检测总胆汁酸含量，无法准确区分胆汁酸的不同分型，无法对疾病进行更准确的分析诊断和鉴别，临床指导意义有限；高效液相色谱法需要衍生处理，特别是牛磺酸结合型胆汁酸还需要水解后再衍生化，前处理操作步骤十分复杂；此外，胆汁酸的紫外吸收较弱，色谱法采用的紫外检测器灵敏度无法满足临床检测需求，因此该方法的临床应用有很大局限性。总之，现有的传统方法检测胆汁酸不仅前处理方法繁琐、需要较长人工操作过程、后续仪器检测耗时长、胆汁酸的检测种类受限，且检测特异性较差、灵敏度低，这些都限制了胆汁酸检测方法的临床应用。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种高效液相色谱串联质谱检测法，本方法具有极好的特异性，能准确区分测定15种分型胆汁酸，对疾病的诊断和治疗具有更好的指导意义。高效液相色谱串联质谱检测法检测人血清中15种胆汁酸包括样品前处理过程，稀释过程，液相色谱分离过程，质谱检测过程。通过液质联用检测方法提高检测的准确度和灵敏度，且生物样本基质干扰小，仪器配有自动进样系统，样本检测可以24小时不间断进行，可实现检测的自动化和高通量。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的目的在于提供一种改进人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
(1)蛋白沉淀：取50～500μL人血清样本，依次加入50～500μL蛋白沉淀剂和0.1～1mL内标工作液，涡旋混匀后离心；
(2)稀释：取步骤(1)中处理后的上清液50～200μL与100～200μL稀释剂混匀；
(3)将步骤(2)得到的样本，上高效液相色谱串联质谱系统进样5～50μL分析检测。
优选地，所述步骤(1)中的蛋白沉淀剂为甲醇。
优选地，所述步骤(1)中的内标工作液为含有20ng/mL氘代甘氨胆酸(GCA-d5)、10ng/mL氘代牛磺胆酸(TCA-d5)、5ng/mL氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)和50ng/mL氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)的混合溶液。
优选地，所述步骤(1)中离心的条件为15000rpm离心10min。
优选地，所述步骤(2)中稀释剂为20％甲醇溶液。
优选地，所述步骤(3)所述的高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪。
优选地，所述步骤(3)采用的高效液相色谱串联质谱方法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以醋酸铵-甲醇为流动相体系，流动相的流速为0.4～1mL/min，柱温为35～50℃，采用多反应监测扫描模式(MRM)检测。
进一步地，所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成；其中流动相A相为5mM醋酸铵溶液，流动相B相为甲醇，流动相A和流动相B的体积比为35～2％：65～98％。
进一步地，所述反相色谱法建立待测物的分离条件包括色谱柱的类型为C8柱、C18柱或者苯基柱，填料粒径为1.7～5μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～150mm。
更进一步地，所述步骤(3)高效液相色谱串联质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM检测模式，用于检测的分析物和内标的母离子/子离子检测离子对如下所示，胆酸(CA)，m/z 407.2>m/z 407.2和m/z 407.2>m/z 343.1；脱氧胆酸(DCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z 345.4；鹅脱氧胆酸(CDCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z373.2；熊脱氧胆酸(UDCA)，m/z 391.4>m/z 391.4和m/z 391.3>m/z 373.1；石胆酸(LCA)，m/z 375.3>m/z 375.3和m/z 375.3>m/z 357.3；甘氨胆酸(GCA)，m/z 464.4>m/z 74.1和m/z 464.4>m/z 402.3；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z 404.4；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，m/z 448.3>m/z 74.1和m/z 448.4>m/z 386.4；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z 386.3；甘氨石胆酸(GLCA)，m/z 432.3>m/z 74.0和m/z 432.3>m/z 388.3；牛磺胆酸(TCA)，m/z 514.2>m/z 80.1和m/z 514.2>m/z107.0；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，m/z 498.2>m/z 80.0和m/z 498.2>m/z 107.0；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，m/z 498.3>m/z 80.0和m/z 498.3>m/z 107.0；牛磺熊脱氧胆酸(TCDCA)，m/z498.3>m/z 80.1和m/z 498.3>m/z 107.1；牛磺石胆酸(TLCA)，m/z 482.3>m/z 80.0和m/z482.3>m/z 107.0；氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，m/z 469.1>m/z 74.0和m/z 469.1>m/z 407.4；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，m/z 519.3>m/z 80.0和m/z 519.3>m/z 107.0；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，m/z 502.2>m/z 80.0和m/z 502.2>m/z 107.0；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，m/z 503.3>m/z 79.9和m/z 503.3>m/z 107.1。
基于上述的实验条件，经过多次试验验证，本发明的精密度RSD％<15％。
优选的，本发明还提供了如下技术方案：
一种改进人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：
(1)前处理过程：对样本进行蛋白沉淀处理，取待测人血清样本加入离心管中，然后依次加入蛋白沉淀剂和内标工作液，血清中蛋白与沉淀剂作用，析出沉淀，随后涡旋混匀，使沉淀过程完全，然后离心使沉淀与上清液相分离；一般地，沉淀剂的体积需要为血清样本体积的2到4倍；
(2)稀释过程：步骤(1)中前处理的上清液，进一步加入稀释剂，涡旋混匀，一般地，稀释剂和上清液的体积比为1：1或者1：2；
(3)液相色谱分离：取(2)稀释后的样本溶液进高效液相色谱串联质谱中检测；
优选地，液相色谱采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18(4.6×150mm,5μm)，流速为0.85mL/min，柱温为50℃；其中流动相A相为5mM醋酸铵溶液，流动相B相为甲醇，流动相A和流动相B的体积比为35～2％：65～98％。
梯度程序如下表1所示；
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0002626834210000041
流动相梯度变化为：0-0.8min，流动相B的体积分数为65％；0.8-2.8min，流动相B的体积分数由65％变化至82％；2.8-3.2min，流动相B的体积分数由82％变化至83％；3.2-5.3min，流动相B的体积分数由83％变化至85％；5.3-5.4min，流动相B的体积分数由85％变化至98％；5.4-7.5min，流动相B的体积分数为98％；7.5-7.51min，流动相B的体积分数由98％变化至65％；7.51-8.5min，流动相B的体积分数为65％；
(4)质谱检测：15种胆汁酸进入三重四极杆质谱进行检测，根据不同的化合物设置相应的质谱检测参数；
质谱条件如下所示：
按以上液相条件分离后，采用电喷雾离子源(ESI)和MRM模式进行质谱检测，用于检测15种胆汁酸的母离子/子离子检测离子对如下所示：胆酸(CA)，m/z 407.2>m/z 407.2和m/z 407.2>m/z 343.1；脱氧胆酸(DCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z 345.4；鹅脱氧胆酸(CDCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z 373.2；熊脱氧胆酸(UDCA)，m/z 391.4>m/z 391.4和m/z 391.3>m/z 373.1；石胆酸(LCA)，m/z 375.3>m/z 375.3和m/z375.3>m/z 357.3；甘氨胆酸(GCA)，m/z 464.4>m/z 74.1和m/z 464.4>m/z 402.3；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z 404.4；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，m/z 448.3>m/z 74.1和m/z 448.4>m/z 386.4；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，m/z 448.3>m/z74.2和m/z 448.3>m/z 386.3；甘氨石胆酸(GLCA)，m/z 432.3>m/z 74.0和m/z 432.3>m/z388.3；牛磺胆酸(TCA)，m/z 514.2>m/z 80.1和m/z 514.2>m/z 107.0；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，m/z 498.2>m/z 80.0和m/z 498.2>m/z 107.0；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，m/z498.3>m/z 80.0和m/z 498.3>m/z 107.0；牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，m/z 498.3>m/z 80.1和m/z 498.3>m/z 107.1；牛磺石胆酸(TLCA)，m/z 482.3>m/z 80.0和m/z 482.3>m/z107.0；氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，m/z 469.1>m/z 74.0和m/z 469.1>m/z 407.4；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，m/z 519.3>m/z 80.0和m/z 519.3>m/z 107.0；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，m/z 502.2>m/z 80.0和m/z 502.2>m/z 107.0；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，m/z503.3>m/z 79.9和m/z 503.3>m/z 107.1。
以上检测离子对的MRM质谱参数如表2所示；
表2检测离子对质谱MRM参数
Figure BDA0002626834210000061
检测质谱条件如表3所示；
表3质谱条件
Figure BDA0002626834210000062
离子源参数如下：气帘气CUR，雾化气GS1，辅助加热气压力分级分别设置为30psi、55psi和55psi，离子源加热温度为550℃，碰撞气CAD压力8psi，喷雾电压-4500V。
本发明的有益效果在于：本发明使用常规的血清样本，采用简单的蛋白沉淀和稀释方法处理样本，采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用系统进行检测。与现有的胆汁酸检测技术相比，本发明方法的优势在于：(1)前处理操作简单，避免了冻干和氮吹复溶等操作，对操作人员的要求较低，同时节约人力和工作时间；(2)前处理设备均为实验室常规配制，试剂成本低廉且容易购买，项目易于在临床开展；(3)一次检测就可同时给出15种胆汁酸分型的定量结果；(4)改进分析方法，单个样本的仪器分析时间从12min缩短到8.5min，大大提高了检测的效率和检测通量。
优选的，本发明还提供了如下技术方案：
(1)溶液的配制；
A.一级储备液的配制：精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到一级储备液；
B.二级混合储备液的配制：依次将适量的一级储备液加入到同一离心管中，涡旋混匀，得到二级混合储备液(MIX01)；
C.标准工作液配制：精密量取200μL二级混合储备液(MIX01)，加入800μL 20％甲醇溶液，混合均匀，得到三级混合储备液(MIX02)；用甲醇分别稀释三级储备溶液10倍、20倍、40倍，100倍、400倍、1000倍、2000倍配成标准曲线工作液；
D.内标工作液配制：精密称取4种内标标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到1mg/mL的氘代甘氨胆酸(GCA-d5)、氘代牛磺胆酸(TCA-d5)、氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)和氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)的一级储备液；取20μL GCA-d5一级储备液、10μL TCA-d5一级储备液、5μL TDCA-d4一级储备液和50μL TUDCA-d5一级储备液，合并，用940μL体积比20％甲醇溶液稀释，涡旋混匀，得到内标二级混合储备液；取10μL内标二级混合储备液加入到990μL体积比20％甲醇溶液中得到内标工作液；
(2)取50μL人血清样本，加入1.5mL离心管中，一次加入50μL甲醇和100μL内标工作液，1500rpm涡旋10分钟，14000g离心10分钟；
(3)取步骤(2)处理得到的上清液，加入100μL 20％甲醇溶液作为稀释剂，涡旋混匀后，上SCIEX 4500MD三重四级杆高效液相色谱串联质谱联用系统进样20μL分析。
优选的，所述人血清中15种胆汁酸包括胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)和牛磺石胆酸(TLCA)。
优选的，所述步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件为：色谱柱为C8柱、C18柱或者苯基柱，填料粒径为1.7～5μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～150mm，柱温为35～50℃；流动相A为5mM醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，流动相A和流动相B的体积比为35～2％：65～98％；A相与B相按梯度程序洗脱，流动相流速为0.4～1mL/min。
优选的，步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，分析物和内标的保留时间分别为：胆酸(CA)，4.56min；脱氧胆酸(DCA)，5.52min；鹅脱氧胆酸(CDCA)，5.32min；熊脱氧胆酸(UDCA)，4.07min；石胆酸(LCA)，6.62min；甘氨胆酸(GCA)，3.88min；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，4.62min；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，4.45min；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，3.32min；甘氨石胆酸(GLCA)，5.12min；牛磺胆酸(TCA)，3.81min；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，4.53min；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，4.37min；牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，3.25min；牛磺石胆酸(TLCA)，5.00min；内标氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，3.87min；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，3.80min；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，4.53min；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，3.25min。
优选的，所述步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM检测模式，用于检测的分析物和内标的母离子/子离子检测离子对如下所示，胆酸(CA)，m/z 407.2>m/z 407.2和m/z 407.2>m/z 343.1；脱氧胆酸(DCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z 345.4；鹅脱氧胆酸(CDCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z373.2；熊脱氧胆酸(UDCA)，m/z 391.4>m/z 391.4和m/z 391.3>m/z 373.1；石胆酸(LCA)，m/z 375.3>m/z 375.3和m/z 375.3>m/z 357.3；甘氨胆酸(GCA)，m/z 464.4>m/z 74.1和m/z 464.4>m/z 402.3；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z 404.4；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，m/z 448.3>m/z 74.1和m/z 448.4>m/z 386.4；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z 386.3；甘氨石胆酸(GLCA)，m/z 432.3>m/z 74.0和m/z 432.3>m/z 388.3；牛磺胆酸(TCA)，m/z 514.2>m/z 80.1和m/z 514.2>m/z107.0；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，m/z 498.2>m/z 80.0和m/z 498.2>m/z 107.0；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，m/z 498.3>m/z 80.0和m/z 498.3>m/z 107.0；牛磺熊脱氧胆酸(TCDCA)，m/z498.3>m/z 80.1和m/z 498.3>m/z 107.1；牛磺石胆酸(TLCA)，m/z 482.3>m/z 80.0和m/z482.3>m/z 107.0；氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，m/z 469.1>m/z 74.0和m/z 469.1>m/z 407.4；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，m/z 519.3>m/z 80.0和m/z 519.3>m/z 107.0；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，m/z 502.2>m/z 80.0和m/z 502.2>m/z 107.0；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，m/z 503.3>m/z 79.9和m/z 503.3>m/z 107.1。
总之，本方法可快速检测人血清中15种胆汁酸的含量，可满足ICP及其他肝胆疾病诊断的临床需求，同时监测患者的治疗效果。此外，与已有胆汁酸检测方法相比较，本发明具有低成本，操作简便，准确度高、灵敏度高和检测通量高等优势。因此，该方法适于临床进行推广，具有广泛的临床应用价值。
附图说明
图1a-图1o分别是检测10ng/mL CA、10ng/mL DCA、10ng/mL CDCA、10ng/mL UDCA、2.5ng/mL LCA、30ng/mL GCA、15ng/mL GDCA、20ng/mL GCDCA、20ng/mLGUDCA、2.5ng/mLGLCA、20ng/mL TCA、5ng/mL TDCA、5ng/mL TCDCA、2.5ng/mL TUDCA和2.5ng/mL TLCA的定量下限的色谱图；
图2a-图2o分别是CA、DCA、CDCA、UDCA、LCA、GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、GLCA、TCA、TDCA、TCDCA、TUDCA和TLCA的标准曲线；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，阐述本发明用于15种胆汁酸检测的具体实现过程，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法
一、溶液配制
一级储备液的配制：精密称取CA、DCA、CDCA、LCA、GCA、GCDCA、GUDCA、GLCA、TCA、TDCA、TCDCA、TUDCA和TLCA标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到浓度为2mg/mL的一级储备液；精密称取UDCA和GDCA标准品20mg，分别加入20％甲醇溶液溶解稀释得到浓度为4mg/mL的一级储备液；
二级混合储备液的配制(MIX01)：依次将适量的15种一级储备液加入到同一离心管中，涡旋混匀，得到二级混合储备液(MIX01)，其具体浓度如下表4所示。
表4 15个分析物的二级混合储备液的配制：
Figure BDA0002626834210000101
标准工作液配制：精密量取200μL二级混合储备液(MIX01)，加入800μL 20％甲醇溶液，混合均匀，得到三级混合储备液(MIX02)；取适量MIX02储备液，按照表5配制系列标准工作液。
表5标准工作液的配制
Figure BDA0002626834210000102
Figure BDA0002626834210000111
内标工作液配制：(1)精密称取4种内标标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到1mg/mL的氘代甘氨胆酸(GCA-d5)、氘代牛磺胆酸(TCA-d5)、氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)和氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)的一级储备液；(2)取20μL GCA-d5一级储备液、10μL TCA-d5一级储备液、5μL TDCA-d4一级储备液和50μL TUDCA-d5一级储备液，合并，用940μL体积比20％甲醇溶液稀释，涡旋混匀，得到内标二级混合储备液；(3)取10μL内标二级混合储备液加入到990μL体积比20％甲醇溶液中得到内标工作液。
二、具体操作步骤：
(1)取50μL人血清样本，加入1.5mL离心管中，依次加入50μL甲醇和100μL内标工作液，1500rpm涡旋10分钟，14000g离心10分钟；
(2)取50μL步骤(1)处理得到的上清液，加入100μL稀释剂，涡旋混匀；
(3)步骤(2)处理得到的样本，上高效液相色谱串联质谱联用系统进样20μL分析。
步骤(2)中的稀释剂为20％甲醇溶液。
步骤(3)所述的质谱为三重四级杆质谱仪。
步骤(3)采用的高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18(4.6×150mm,5μm)，流速为0.85mL/min，柱温为50℃。
流动相A为5mM醋酸铵溶液，流动相B为甲醇；A相与B相按表6梯度程序洗脱，流动相流速为0.85mL/min。
表6梯度洗脱程序
Figure BDA0002626834210000112
Figure BDA0002626834210000121
分析物和内标的保留时间分别为：胆酸(CA)，4.56min；脱氧胆酸(DCA)，5.52min；鹅脱氧胆酸(CDCA)，5.32min；熊脱氧胆酸(UDCA)，4.07min；石胆酸(LCA)，6.62min；甘氨胆酸(GCA)，3.88min；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，4.62min；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，4.45min；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，3.32min；甘氨石胆酸(GLCA)，5.12min；牛磺胆酸(TCA)，3.81min；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，4.53min；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，4.37min；牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，3.25min；牛磺石胆酸(TLCA)，5.00min；内标氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，3.87min；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，3.80min；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，4.53min；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，3.25min。
质谱条件如表7所示；
表7质谱条件
Figure BDA0002626834210000122
按以上液相条件分离后，采用电喷雾离子源(ESI)和MRM模式进行质谱检测，用于检测15种胆汁酸的母离子/子离子检测离子对如下所示：胆酸(CA)，m/z 407.2>m/z 407.2和m/z 407.2>m/z 343.1；脱氧胆酸(DCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z 345.4；鹅脱氧胆酸(CDCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z 391.3>m/z 373.2；熊脱氧胆酸(UDCA)，m/z 391.4>m/z 391.4和m/z 391.3>m/z 373.1；石胆酸(LCA)，m/z 375.3>m/z 375.3和m/z375.3>m/z 357.3；甘氨胆酸(GCA)，m/z 464.4>m/z 74.1和m/z 464.4>m/z 402.3；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z 404.4；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，m/z 448.3>m/z 74.1和m/z 448.4>m/z 386.4；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，m/z 448.3>m/z74.2和m/z 448.3>m/z 386.3；甘氨石胆酸(GLCA)，m/z 432.3>m/z 74.0和m/z 432.3>m/z388.3；牛磺胆酸(TCA)，m/z 514.2>m/z 80.1和m/z 514.2>m/z 107.0；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，m/z 498.2>m/z 80.0和m/z 498.2>m/z 107.0；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，m/z498.3>m/z 80.0和m/z 498.3>m/z 107.0；牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，m/z 498.3>m/z 80.1和m/z 498.3>m/z 107.1；牛磺石胆酸(TLCA)，m/z 482.3>m/z 80.0和m/z 482.3>m/z107.0；氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，m/z 469.1>m/z 74.0和m/z 469.1>m/z 407.4；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，m/z 519.3>m/z 80.0和m/z 519.3>m/z 107.0；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，m/z 502.2>m/z 80.0和m/z 502.2>m/z 107.0；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，m/z503.3>m/z 79.9和m/z 503.3>m/z 107.1。以上检测离子对的MRM质谱参数如表8所示；
表8检测离子对质谱MRM参数
Figure BDA0002626834210000131
图1a-图1o分别给出了10ng/mL CA、10ng/mL DCA、10ng/mL CDCA、10ng/mL UDCA、2.5ng/mL LCA、30ng/mL GCA、15ng/mL GDCA、20ng/mL GCDCA、20ng/mL GUDCA、2.5ng/mLGLCA、20ng/mL TCA、5ng/mL TDCA、5ng/mL TCDCA、2.5ng/mL TUDCA和2.5ng/mL TLCA的定量下限的色谱图。
采用内标法建立标准曲线。如图2a-图2o和表9可知，15种分析物在对应的线性范围内，线性相关性良好。
表9标准曲线结果
Figure BDA0002626834210000141
实施例2：一种检测15种胆汁酸的检测试剂盒
试剂盒组成如表10所示：
表10试剂盒组成
Figure BDA0002626834210000142
不同沉淀剂和不同稀释剂配方分别为表11和表12所示：
表11不同沉淀剂配方
Figure BDA0002626834210000143
表12不同稀释剂配方
Figure BDA0002626834210000144
Figure BDA0002626834210000151
胆汁酸内标溶液包括200ng/mL的氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，100ng/mL的氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，50ng/mL的氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，500ng/mL的氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)。
15种胆汁酸的标准曲线的最大浓度从500-6000ng/mL，然后逐级稀释得到相应15种待测物的系列标准曲线溶液，胆汁酸质控样本包括低质控L和高质控H，详见下表13：
表13标准浓度样本S1～S7和质控样本中15种胆汁酸的浓度
Figure BDA0002626834210000152
使用试剂盒检测15种胆汁酸的具体包括如下步骤：
(1)取50μL人血清样本，加入1.5mL离心管中，依次加入50μL沉淀剂和100μL内标溶液，随后1500rpm涡旋10分钟，14000g离心10分钟；
(2)取50μL步骤(1)处理得到的上清液，加入100μL稀释剂，涡旋混匀；
(3)步骤(2)处理得到的样本，上高效液相色谱串联质谱联用系统进样20μL分析。
步骤(3)采用的高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18(4.6×150mm,5μm)，流速为0.85mL/min，柱温为50℃。流动相A为5mM醋酸铵溶液，流动相B为甲醇；A相与B相按表6度程序洗脱，流动相流速为0.85mL/min。质谱条件如表7所示；以上检测离子对的MRM质谱参数如表8所示。
本发明已用于临床批量样本的检验测定，结果表明该方法线性范围能够满足临床检验的需要，可通过检测血清样本中15种胆汁酸的浓度对个体循环系统内的胆汁酸水平进行非常准确的预测。

Claims (10)

1.一种改进的人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)溶液的配制；
A.一级储备液的配制：精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到一级储备液；
B.二级混合储备液的配制：依次将适量的一级储备液加入到同一离心管中，涡旋混匀，得到二级混合储备液(MIX01)；
C.标准工作液配制：量取二级混合储备液(MIX01)，加入20％甲醇溶液，混合均匀，得到三级混合储备液(MIX02)；用甲醇分别稀释三级储备溶液配成标准曲线工作液；
D.内标工作液配制：精密称取4种内标标准品，加入20％甲醇溶液溶解稀释得到1mg/mL的氘代甘氨胆酸(GCA-d5)、氘代牛磺胆酸(TCA-d5)、氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)和氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)的一级储备液；取GCA-d5一级储备液、TCA-d5一级储备液、TDCA-d4一级储备液和TUDCA-d5一级储备液，合并，用20％甲醇溶液稀释，涡旋混匀，得到内标二级混合储备液；取内标二级混合储备液加入到20％甲醇溶液中得到内标工作液；
(2)取人血清样本，加入离心管中，一次加入甲醇和内标工作液，1500rpm涡旋，14000g离心；
(3)取步骤(2)处理得到的上清液，加入20％甲醇溶液作为稀释剂，涡旋混匀后，上SCIEX 4500MD三重四级杆高效液相色谱串联质谱联用系统进样20μL分析。
2.根据权利要求1的方法，所述人血清中15种胆汁酸包括胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)和牛磺石胆酸(TLCA)。
3.根据权利要求1的方法，步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件为：色谱柱为C8柱、C18柱或者苯基柱，填料粒径为1.7～5μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～150mm，柱温为35～50℃；流动相A为5mM醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，流动相A和流动相B的体积比为35～2％：65～98％；A相与B相按梯度程序洗脱，流动相流速为0.4～1mL/min。
4.根据权利要求1的方法，步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM检测模式，用于检测的分析物和内标的母离子/子离子检测离子对如下所示，胆酸(CA)，m/z 407.2>m/z 407.2和m/z 407.2>m/z 343.1；脱氧胆酸(DCA)，m/z391.3>m/z391.3和m/z 391.3>m/z 345.4；鹅脱氧胆酸(CDCA)，m/z 391.3>m/z 391.3和m/z391.3>m/z373.2；熊脱氧胆酸(UDCA)，m/z 391.4>m/z 391.4和m/z 391.3>m/z 373.1；石胆酸(LCA)，m/z 375.3>m/z 375.3和m/z 375.3>m/z 357.3；甘氨胆酸(GCA)，m/z 464.4>m/z74.1和m/z464.4>m/z 402.3；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z404.4；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，m/z 448.3>m/z 74.1和m/z 448.4>m/z 386.4；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，m/z 448.3>m/z 74.2和m/z 448.3>m/z 386.3；甘氨石胆酸(GLCA)，m/z 432.3>m/z 74.0和m/z 432.3>m/z 388.3；牛磺胆酸(TCA)，m/z 514.2>m/z 80.1和m/z514.2>m/z107.0；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，m/z 498.2>m/z 80.0和m/z 498.2>m/z 107.0；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，m/z 498.3>m/z 80.0和m/z 498.3>m/z 107.0；牛磺熊脱氧胆酸(TCDCA)，m/z498.3>m/z 80.1和m/z 498.3>m/z 107.1；牛磺石胆酸(TLCA)，m/z 482.3>m/z80.0和m/z482.3>m/z 107.0；氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，m/z 469.1>m/z 74.0和m/z 469.1>m/z407.4；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，m/z 519.3>m/z 80.0和m/z 519.3>m/z 107.0；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，m/z 502.2>m/z 80.0和m/z 502.2>m/z 107.0；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，m/z 503.3>m/z 79.9和m/z 503.3>m/z 107.1。
5.权利要求1～4任一项所述人血清中15种胆汁酸的高效液相色谱串联质谱检测方法在制备人血清中15种胆汁酸检测试剂盒中的应用。
6.一种检测15种胆汁酸的检测试剂盒，包括胆汁酸混合标准溶液，胆汁酸质控品，内标溶液，沉淀剂和稀释剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述胆汁酸混合标准溶液包括胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)和牛磺石胆酸(TLCA)，标准样本浓度为2.5～6000ng/mL。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述胆汁酸质控品溶液包括低质控L和高质控H，质控样本L、H和内标的浓度分别为：胆酸(CA)，101.8ng/mL，1025.6ng/mL；脱氧胆酸(DCA)，106.8ng/mL，903ng/mL；鹅脱氧胆酸(CDCA)，165.5ng/mL,999.8ng/mL；熊脱氧胆酸(UDCA)，97.9ng/mL,914.6ng/mL；石胆酸(LCA)，12ng/mL,54.9ng/mL；甘氨胆酸(GCA)，201.6ng/mL,3056.1ng/mL；甘氨脱氧胆酸(GDCA)，131.8ng/mL,1568.8ng/mL；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，599.8ng/mL,2443.7ng/mL；甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，184.7ng/mL,2037.6ng/mL；甘氨石胆酸(GLCA)，9.2ng/mL,47.8ng/mL；牛磺胆酸(TCA)，69.8ng/mL,1054.7ng/mL；牛磺脱氧胆酸(TDCA)，33.8ng/mL,314.7ng/mL；牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，135.4ng/mL,520ng/mL；牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，22.9ng/mL,128.2ng/mL；牛磺石胆酸(TLCA)，3.8ng/mL,52.3ng/mL。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述内标为氘代甘氨胆酸(GCA-d5)，200ng/mL；氘代牛磺胆酸(TCA-d5)，100ng/mL；氘代牛磺脱氧胆酸(TDCA-d4)，50ng/mL；氘代牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA-d5)，500ng/mL。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于满足以下至少一种条件：(1)所述沉淀剂为甲醇或乙腈溶液；(2)所述稀释剂为20％甲醇溶液溶液。
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