CN107843671A - 一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法 - Google Patents

一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，所述方法包括：S1样品制备、S2样品前处理、S3液相色谱分离以及S4串联质谱检测等步骤；此外，本发明还公开了一种高通量液相色谱串联质谱法检测15种胆汁酸的方法，该方法提供了一种适用于人血清中胆汁酸检测，并且样品前处理简单、可以同时检测15种胆汁酸、检测特异性好、整个检测流程时间短、通量高的高通量液相色谱串联质谱的检测方法。

Description

一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的 检测方法
技术领域
本发明涉及胆汁酸检测的技术领域，特别涉及一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法。
背景技术
胆汁酸(bile acid)，为胆汁的主要有机成分，是一类24碳胆烷酸羟基衍生物的总称。胆汁酸按结构可分为：游离型胆汁酸(free bile acid)和结合型胆汁酸(conjugatedbile acid)。按其生成部位及结构不同分为初级和次级胆汁酸。初级胆汁酸由肝内胆固醇转变而来，通过一系列反应，最终生成胆酸(cholic acid，CA)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic aic，CDCA)，以及与甘氨酸和牛磺酸形成的结合型胆汁酸，包括甘氨胆酸(glycocholic acid，GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)、牛磺胆酸(taurocholic acid，TCA)及牛磺鹅脱氧胆酸(taurochenodeoxycholic，TCDCA)。初级胆汁酸在肝细胞合成后，在肝细胞毛细胆管膜一系列转运蛋白以胆盐形式进入毛细胆管，存储于胆囊，进食后胆囊收缩，胆囊排空，胆汁酸进入肠道。在肠道中受细菌作用，初级胆汁酸经过水解、氧化和核羟基的差向异构生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)、石胆酸(lithocholic acid，LCA)和熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)。胆汁酸在分泌人肠道之前，在肝脏中可以与氨基酸以酰胺键连接，形成甘氨酸或牛磺酸结合型胆汁酸，包括牛磺石胆酸(taurolithocholic acid，TLCA)、甘氨石胆酸(glycolithocholic acid，GLCA)、牛磺脱氧胆酸(taurodesoxycholicacid，TDCA)、甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid，GDCA)、牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)、甘氨熊去氧胆酸(glycoursodeoxycholicacid，GUDCA)。
胆汁酸为胆固醇的系列衍生物，是人体脂肪代谢的必须物质。胆汁酸在人体具有重要的生理功能，包括乳化脂肪、产生胆汁、防止胆结石等。正常情况下，大部分的胆汁酸都参与肠肝循环，只有极少数的胆汁酸脱离该循环。肝胆疾病引起胆汁酸的肝肠循环障碍，是血清胆汁酸异常的主要因素，血清胆汁酸谱的变化亦会影响肝脏对胆汁酸的合成和分泌。故血清胆汁酸是衡量肝胆功能正常与否的重要标志物。
胆汁酸在人体中除了作为乳糜微粒的主要成分外，它还是体内胆固醇消除的一个重要途径，肝脏中新陈代谢的产物可随胆汁排出。胆汁酸参与脂肪循环，胆汁酸和磷脂形成微粒，并形成乳化液帮助脂肪酸和脂溶性维生素的肠道吸收。尽管胆汁酸在于肝肠循环，体循环和尿液中含量很低，然而当出现肝胆疾病而致使胆汁酸排泄障碍时，肝内、血液以及尿液中胆汁酸水平显著升高。尿液以及血液中胆汁酸水平常被作为胆汁阻塞性疾病的生物标志物。胆汁酸在作为内分泌和旁分泌功能的分子信号，不仅调控其自身的体内水平，还参与能量消耗、葡萄糖和脂质代谢、甲状腺激素的信号传递以及细胞免疫。因此检测检测每一种胆汁酸的体内水平而非简单地定量总胆汁酸含量，对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要价值。
分离和定量胆汁酸及其结合物是一项挑战，因为这类化合物的生化特征各异，有的还存在同分异构体，且它们在人体中的含量较低。目前常规高通量液相色谱串联质谱的检测方法是循环酶法测定生理溶液中的胆汁酸，虽然操作较为简单，然而该方法只能检测总胆汁酸含量，无法做到测定不同胆汁酸的差异；气相色谱和气质联用在检测胆汁酸时需要复杂的样品制备，衍生化，需将结合型胆汁酸水解成非结合型才能进行分析；高效液相色谱串联紫外检测器在检测复杂生物基质中的胆汁酸会导致灵敏度和特异性不足；荧光检测法则需要复杂的衍生化技术而不能推广。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及一种高通量液相色谱串联质谱法检测15种胆汁酸的方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的方案是：
一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，所述方法包括以下步骤：
S1样品制备：往待测样品中加入一定量的含有已知浓度内标(内标是同位素标记的待测物质)的乙腈溶液，高速离心后吸取上清液；
S2样品前处理：上清液使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后，离心使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min；
S3液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对样品进行分离；
优选地，液相色谱条件包括：色谱柱：WatersACQUITYUPLCC18Column:poresizeparticle size 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液(体积比)，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇(3：1，体积比)溶液(体积比)；
优选地，洗脱梯度如下：
S4串联质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式检测，根据色谱洗脱时间，设置检测窗口以及参数；
优选地，质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，质谱多重反应监控参数(每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等)如下：
优选地，为了进一步缩短色谱洗脱过程，只需要把B相浓度高的时间提前，进一步缩短色谱柱平衡时间，如此可以使整个检测时间可以少于12.3min；步骤S4液相色谱分离的洗脱梯度如下:
该方案的高通量液相色谱串联质谱的检测方法采用高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。
高通量液相色谱串联质谱法检测15种胆汁酸的方法，所述方法包括以下步骤：
S11标准品制备：将15种胆汁酸(胆酸，石胆酸，脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸，牛磺胆酸，甘氨胆酸，牛磺石胆酸，甘氨石胆酸，牛磺脱氧胆酸，牛磺熊脱氧胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨熊脱氧胆酸)标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标(氘代胆酸，氘代脱氧胆酸，氘代熊脱氧胆酸)的乙腈溶液；一般来说胆汁酸乙腈溶液的浓度均控制在400pmol/L～6μmol/L之间，内标氘代胆酸的浓度为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸的浓度为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸的浓度为126nmol/L，高速离心后吸取上清液，进行冻干；
S12样品前处理：上清液使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，浓缩冷冻系统冻干2h后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后，再使用低温离心机在18000g离心力4℃下对混合溶液进行离心分离，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；
S13液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对15种胆汁酸进行分离；
优选地，液相色谱条件包括：色谱柱：WatersACQUITYUPLCC18Column:poresizeparticle size 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液(体积比)，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇(3：1，体积比)溶液(体积比)；洗脱梯度如下：
S14串联质谱检测：色谱上分离后的15种胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；
其中，胆酸保留时间为3.89min，氘代胆酸保留时间为3.87min，石胆酸保留时间为8.06min，脱氧胆酸保留时间为5.77min，氘代脱氧胆酸保留时间为5.76min，熊脱氧胆酸保留时间为3.61min，氘代熊脱氧胆酸保留时间为3.58min，鹅脱氧胆酸保留时间为5.57min，牛磺胆酸保留时间为1.63min，甘氨胆酸保留时间为2.47min，牛磺石胆酸保留时间为4.79min，甘氨石胆酸保留时间为5.86min，牛磺脱氧胆酸保留时间为3.08min，牛磺熊脱氧胆酸保留时间为1.38min，牛磺鹅脱氧胆酸保留时间为2.72min，甘氨脱氧胆酸保留时间为4.51min，甘氨鹅脱氧胆酸保留时间为4.13min，甘氨熊脱氧胆酸保留时间为2.15min。
优选地，质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，质谱多重反应监控参数(每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等)如下：
S15校正方程：液相色谱上分离出的15种胆汁酸进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；
S21待测样品处理：取血清样本，加入含内标(氘代胆酸，氘代脱氧胆酸，氘代熊脱氧胆酸)的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；
S22液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对15种胆汁酸进行分离；优选地，液相色谱条件包括：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLCC18 Column:pore sizeparticle size1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液(体积比)，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇(3：1，体积比)溶液(体积比)；
洗脱梯度如下：
S23串联质谱检测：色谱上分离后的15种胆汁酸入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；
质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，质谱多重反应监控参数(每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等)如下：
S24胆汁酸的含量计算：质谱检测得到胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中胆汁酸的含量。
优选地，所述步骤S13和/或S22中的液相色谱分离的洗脱梯度如下：
本发明的高通量液相色谱串联质谱法检测15种胆汁酸的方法具有以下优点：
1)可以同时定性并精准定量人血清中的15种胆汁酸；
2)采用乙腈进行蛋白沉淀，提取后便可使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，前处理步骤简单，并且可以有效去除血清基质干扰，特异性好；
3)采用高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。
附图说明
图1、本发明的高通量液相色谱串联质谱的检测方法的流程示意图；
图2、各胆汁酸的色谱洗脱出峰的绝对保留时间；
图3、胆酸标准曲线；
图4、石胆酸标准曲线；
图5、脱氧胆酸标准曲线；
图6、熊脱氧胆酸标准曲线；
图7、鹅脱氧胆酸标准曲线；
图8、牛磺胆酸标准曲线；
图9、甘氨胆酸标准曲线；
图10、牛磺石胆酸标准曲线；
图11、甘氨石胆酸标准曲线；
图12、牛磺脱氧胆酸标准曲线；
图13、牛磺熊脱氧胆酸标准曲线；
图14、牛磺鹅脱氧胆酸标准曲线；
图15、甘氨脱氧胆酸标准曲线；
图16、甘氨鹅脱氧胆酸标准曲线；
图17、甘氨熊脱氧胆酸标准曲线。
具体实施方式
为了使本领域技术人员可以更好地理解本发明，从而对本发明的保护范围作出明确的限定；下面结合具体实施方式对本发明作出进一步详细的说明。
甘氨石胆酸标准品采购于Toronto Research Chemicals公司，14种胆汁酸(胆酸，石胆酸，脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸，牛磺胆酸，甘氨胆酸，牛磺石胆酸，牛磺脱氧胆酸，牛磺熊脱氧胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨熊脱氧胆酸)标准品以及同位素标记的内标(氘代胆酸，氘代脱氧胆酸，氘代熊脱氧胆酸)均采购于SigmaAldrich公司。标准品和内标首先用乙腈进行溶解，然后保存在-80℃，需要进行实际样品检测时，再利用乙腈将内标氘代胆酸稀释浓度约为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸稀释浓度约为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸稀释浓度约为126nmol/L，作为工作液。
1.标准品制备：分别取0.1mL9个不同浓度的胆汁酸乙腈溶液到1.5mLEP管中，再分别加入0.3mL低温保存的含内标氘代胆酸，氘代脱氧胆酸，氘代熊脱氧胆酸乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移0.3mL含内标氘代的胆汁酸乙腈溶液到另外一个1.5mL EP管，然后用离心浓缩冷冻系统冻干；
冻干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合组分使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；
2.液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对样品上清液中胆汁酸进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出15种胆汁酸；
液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLCC18Column:pore sizeparticle size 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液(体积比)，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇(3：1，体积比)溶液(体积比)；
洗脱梯度如下所示：
3.质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的15种胆汁酸进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸的含量，并画制标准曲线图；
色谱上分离后的15种胆汁酸进入到Waters Xevo TQD质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；
胆酸保留时间为3.89min，氘代胆酸保留时间为3.87min，石胆酸保留时间为8.06min，脱氧胆酸保留时间为5.77min，氘代脱氧胆酸保留时间为5.76min，熊脱氧胆酸保留时间为3.61min，氘代熊脱氧胆酸保留时间为3.58min，鹅脱氧胆酸保留时间为5.57min，牛磺胆酸保留时间为1.63min，甘氨胆酸保留时间为2.47min，牛磺石胆酸保留时间为4.79min，甘氨石胆酸保留时间为5.86min，牛磺脱氧胆酸保留时间为3.08min，牛磺熊脱氧胆酸保留时间为1.38min，牛磺鹅脱氧胆酸保留时间为2.72min，甘氨脱氧胆酸保留时间为4.51min，甘氨鹅脱氧胆酸保留时间为4.13min，甘氨熊脱氧胆酸保留时间为2.15min。如图2所示，样品通过超高压液相色谱分离后，不同的胆汁酸在不同洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，从先到后检测到的物质分别为：牛磺熊脱氧胆酸，牛磺胆酸，甘氨熊脱氧胆酸，甘氨胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，氘代熊脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，氘代胆酸，胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺石胆酸，鹅脱氧胆酸，氘代脱氧胆酸，脱氧胆酸，甘氨石胆酸，石胆酸。
质谱为Waters Xevo TQD IVD(Waters,Milford,MA)；质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等如下表所示(不同类型仪器，碰撞能量、锥孔电压值有所不同，需要独立优化)：
多重反应监控通过两次筛选，即第一个四级杆进行特定母离子筛选，第二个四级杆进行母离子碎裂产生子离子，第三个四级杆进行特定子离子筛选，具有非常好的检测特异性。可以通过选择反应监控检测到的离子流，以及对应的保留时间，来确定胆汁酸的检测，再利用添加已知量的氘代胆酸内标，氘代脱氧胆酸内标，氘代熊脱氧胆酸内标进行定量。
表1 CA标准曲线实验数据
表2 CDCA标准曲线实验数据
表3 DCA标准曲线实验数据
表4 LCA标准曲线实验数据
表5 UDCA标准曲线实验数据
表6 GCA标准曲线实验数据
表7 GCDCA标准曲线实验数据
表8 GDCA标准曲线实验数据
表9 GLCA标准曲线实验数据
表10 GUDCA标准曲线实验数据
表11 TCA标准曲线实验数据
表12 TDCA标准曲线实验数据
表13 TLCA标准曲线实验数据
表14 TUDCA标准曲线实验数据
表15 TCDCA标准曲线实验数据
表1至表15是胆汁酸的实验数据，标准曲线图见图3至图17；检测限定义为信噪比>3，定量限定义为信噪比>10，保留时间为色谱洗脱出峰的绝对保留时间，所有检测物质的相关系数R2均>0.99，每种胆汁酸的保留时间，检出限，定量限，线性范围以及定量校正方程分别如图中所示；通过三日的精密度测试，包括低、中、高三个浓度，日内日间精密度RSD均小于15％，表明检测结果准确，可重复。
15种胆汁酸的保留时间、检测限、定量限、线性范围、线性方程、相关系数如下：
表16胆汁酸保留时间及线性范围总结
4.血清中胆汁酸的检测：取0.1mL血清样品到1.5mL EP管中，再加入0.3mL低温保存的含内标氘代胆酸内标，氘代脱氧胆酸内标，氘代熊脱氧胆酸乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移0.3mL含内标氘代胆酸内标，氘代脱氧胆酸内标，氘代熊脱氧胆酸的胆汁酸乙腈溶液到另外一个1.5mL EP管，然后用真空冷冻干燥器冻干；
冻干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合组分使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；
液相色谱串联质谱分析同步骤2)和3)，质谱检测得到胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中胆汁酸的含量。
本发明利用液相色谱串联质谱检测血清中胆汁酸的方法创新型的应用高通量液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行胆汁酸的检测，具有以下有益效果：采用乙腈进行蛋白沉淀，提取后使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血清基质干扰，特异性好；高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血清中包括牛磺熊脱氧胆酸，牛磺胆酸，甘氨熊脱氧胆酸，甘氨胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺石胆酸，鹅脱氧胆酸，脱氧胆酸，甘氨石胆酸，石胆酸等15种胆汁酸，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。
在本发明的某些优选实施例中，色谱洗脱条件可以进一步缩短，只需要把B相浓度高的时间提前，进一步缩短色谱柱平衡时间，从而使整体检测时间可以少于12.3min，洗脱条件如下：
以上对本发明实施例所提供的高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测15种胆汁酸的方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明实施例的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种高通量液相色谱串联质谱的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，所述方法包括以下步骤：
S1样品制备：往待测样品中加入一定量的含有已知浓度内标的乙腈溶液，进行蛋白质沉淀，离心后取上清液；
S2样品前处理：上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于液相色谱串联质谱上样分析；
S3液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对样品进行分离；
S4串联质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式检测，根据色谱洗脱时间，设置检测窗口以及参数。
2.如权利要求1所述的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，其特征在于，所述内标为氘代胆酸和/或氘代熊脱氧胆酸和/或氘代脱氧胆酸。
3.高通量液相色谱串联质谱法检测15种胆汁酸的方法，所述方法包括以下步骤：
S11标准品制备：将胆汁酸标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液，高速离心后取上清液；
S12样品前处理：上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；
S13液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对15种胆汁酸进行分离；
S14串联质谱检测：色谱上分离后的15种胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；
S15校正方程：液相色谱上分离出的15种胆汁酸进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；
S21待测样品处理：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；
S22液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对15种胆汁酸进行分离；
S23串联质谱检测：色谱上分离后的15种胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测15种胆汁酸，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；
S24胆汁酸的含量计算：质谱检测得到胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中胆汁酸的含量。
4.根据权利要求3所述的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，其特征在于，所述液相色谱分离的洗脱梯度如下：
5.根据权利要求3所述的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，其特征在于，所述质谱检测的多重反应监控参数如下：
6.根据权利要求4-5任一项所述的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，其特征在于，所述液相色谱分离的洗脱梯度如下：
7.根据权利要求4-5任一项所述的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，其特征在于，所述内标为氘代胆酸和/或氘代熊脱氧胆酸和/或氘代脱氧胆酸。
8.根据权利要求4-5任一项所述的高通量液相色谱串联质谱的检测方法，其特征在于，所述胆酸保留时间为3.89min，氘代胆酸保留时间为3.87min，石胆酸保留时间为8.06min，脱氧胆酸保留时间为5.77min，氘代脱氧胆酸保留时间为5.76min，熊脱氧胆酸保留时间为3.61min，氘代熊脱氧胆酸保留时间为3.58min，鹅脱氧胆酸保留时间为5.57min，牛磺胆酸保留时间为1.63min，甘氨胆酸保留时间为2.47min，牛磺石胆酸保留时间为4.79min，甘氨石胆酸保留时间为5.86min，牛磺脱氧胆酸保留时间为3.08min，牛磺熊脱氧胆酸保留时间为1.38min，牛磺鹅脱氧胆酸保留时间为2.72min，甘氨脱氧胆酸保留时间为4.51min，甘氨鹅脱氧胆酸保留时间为4.13min，甘氨熊脱氧胆酸保留时间为2.15min。
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