CN106841492A - 高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法 - Google Patents

高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，所述五种游离型胆汁酸为：胆酸，石胆酸，脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸；包括如下步骤：标准品的制备，高效液相色谱分离，串联质谱检测，血清中游离型胆汁酸的检测，可以同时定性并精准定量人血清中的五种游离型胆汁酸的含量，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好。

Description

高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法
技术领域
本发明涉及胆汁酸的检测领域，尤其涉及一种高效液相色谱串联质谱检测五种游离型胆汁酸的方法。
背景技术
胆汁酸(bile acid)，为胆汁的主要有机成分，是一类24碳胆烷酸羟基衍生物的总称。胆汁酸按结构可分为：游离型胆汁酸(free bile acid)和结合型胆汁酸(conjugatedbile acid)。人体中游离胆汁酸按其生成部位及结构不同分为初级和次级胆汁酸。初级胆汁酸由肝内胆固醇转变而来，通过一系列反应，最终生成胆酸(cholic acid，CA)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic aic，CDCA)。初级胆汁酸在肝细胞合成后，在肝细胞毛细胆管膜一系列转运蛋白以胆盐形式进入毛细胆管，存储于胆囊，进食后胆囊收缩，胆囊排空，胆汁酸进入肠道。在肠道中受细菌作用，初级胆汁酸经过水解、氧化和核羟基的差向异构生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)、石胆酸(lithocholic acid，LCA)和熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)。
游离型胆汁酸是胆固醇的代谢产物，体内存在多种复杂机制调节游离型胆汁酸的代谢。游离型胆汁酸在脂肪代谢中起着重要作用。游离型胆汁酸主要存在于肝肠循环系统，并通过再循环以达到对人体机体的保护作用。同时，游离型胆汁酸还是FXR、PXR、VDR和GPCR等许多受体的天然配体，调节其代谢相关的酶类和转运蛋白基因的表达，通过调节游离型胆汁酸的水平，能够激活肝脏和胃肠道细胞中相应受体和细胞信号传导通路，从而改变和编码调控葡萄糖、脂肪酸和脂蛋白质的合成、代谢、运输以及能量代谢的相关酶的基因表达。正因为具有如此还总要的生理功能，因此检测检测每一种游离型胆汁酸的体内水平，对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要价值。
分离和定量游离型胆汁酸及其结合物是一项挑战，因为这类化合物的生化特征各异，有的还存在同分异构体，且它们在人体中的含量较低。目前常规检测方法是循环酶法测定生理溶液中的胆汁酸，虽然操作较为简单，然而该方法只能检测总胆汁酸含量，无法做到测定不同游离型胆汁酸的差异；气相色谱和气质联用在检测胆汁酸时需要复杂的样品制备才能进行分析；高效液相色谱串联紫外检测器在检测复杂生物基质中的胆汁酸会导致灵敏度和特异性不足。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其能解决现有技术中游离型胆汁酸检测操作复杂，灵敏度和特异性不足的问题。
本发明的目的采用以下技术方案实现：
高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，所述五种游离型胆汁酸为：胆酸，石胆酸，脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸；
包括如下步骤：
(1)标准品的制备：将上述五种游离型胆汁酸标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液；所述游离型胆汁酸乙腈溶液的浓度均控制在400pmol/L～2μmol/L之间，所述内标为氘代胆酸、氘代脱氧胆酸、氘代熊脱氧胆酸，高速离心后吸取上清液，进行冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于高通量液相色谱串联质谱上样分析；
(2)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对五种游离型胆汁酸进行分离；
(3)串联质谱检测：色谱上分离后的五种游离型胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测五种游离型胆汁酸，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；
(4)血清中游离型胆汁酸的检测：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于高效液相色谱串联质谱上样分析；
高效液相色谱串联质谱上样分析步骤同步骤(2)、步骤(3)，液相色谱质谱检测得到游离型胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中游离型胆汁酸的含量。
进一步，所述步骤(1)中所述含已知浓度内标的乙腈溶液为，所述内标为氘代胆酸的浓度为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸的浓度为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸的浓度为126nmol/L。
进一步，所述步骤(2)中高效液相色谱分离条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLCC18Column:pore sizeparticlesize 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液，即甲酸在混合液中的体积占比为0.1％，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1，即甲酸和乙腈的混合液与甲醇的体积比为3:1,其中甲酸在甲酸和乙腈的混合液中体积占比为0.1％。
采用梯度洗脱方式，见表1或表2；
表1
序号 时间(min) 流速(mL/min) A％ B％ 曲线值
1 - 0.4 65 35 -
2 3.0 0.4 57 43 6
3 4.5 0.4 54 46 6
4 6.0 0.4 41 59 6
5 8.0 0.4 41 59 6
6 9.7 0.4 34 66 6
7 11.7 0.4 2 98 1
8 12.3 0.4 65 35 1
表2
进一步，所述步骤(3)中每一种游离型胆汁酸的检测参数均先用标准品进行优化，然后利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测五种游离型胆汁酸，所述质谱检测参数为：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，质谱多重反应监控参数如表3所示：
表3
进一步，所述步骤(1)中两次离心条件为：离心力位18000g，离心温度为4℃，离心时间为5min。
进一步，所述步骤(4)中血清与含内标乙腈溶液的体积比为1:3。
进一步，所述步骤(4)中血清为人或动物血清。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1)可以同时定性并精准定量人血清中的五种游离型胆汁酸；
2)采用乙腈进行蛋白沉淀，提取后便可使用高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，前处理步骤简单，并且可以有效去除血清基质干扰，特异性好；
3)采用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好。
附图说明
图1、本发明的检测方法的流程示意图；
图2、各游离型胆汁酸的色谱洗脱出峰的绝对保留时间；
图3、胆酸标准曲线；
图4、石胆酸标准曲线；
图5、脱氧胆酸标准曲线；
图6、熊脱氧胆酸标准曲线；
图7、鹅脱氧胆酸标准曲线。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
五种游离型胆汁酸：胆酸、石胆酸、脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸标准品以及同位素标记的内标：氘代胆酸、氘代脱氧胆酸、氘代熊脱氧胆酸均采购于Sigma Aldrich公司。标准品和内标首先用乙腈进行溶解，然后保存在-80℃，需要进行实际样品检测时，再利用乙腈将内标氘代胆酸稀释浓度为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸稀释浓度为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸稀释浓度为126nmol/L，作为工作液。
(1)标准品制备：分别取0.1mL 9个不同浓度的胆汁酸乙腈溶液到1.5mL EP管中，再分别加入0.3mL低温保存的含内标氘代胆酸，氘代脱氧胆酸，氘代熊脱氧胆酸乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移0.3mL含内标氘代的胆汁酸乙腈溶液到另外一个1.5mL EP管，然后用离心浓缩冷冻系统冻干；
冻干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合组分使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；
(2)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对样品上清液中游离型胆汁酸进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出5种游离型胆汁酸；
液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLCC18 Column:pore sizeparticle size 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液，即甲酸在混合液中的体积占比为0.1％，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1，即甲酸和乙腈的混合液与甲醇的体积比为3:1,其中甲酸在甲酸和乙腈的混合液中体积占比为0.1％，采用梯度洗脱方式，见表1或表2；
(3)质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的5种游离型胆汁酸进入到三重四级杆质谱进行检测，然后利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式检测5种游离型胆汁酸的含量，并画制标准曲线图。
根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数，每一种物质的检测参数均先用标准品优化，然后利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式以及优化好的特定质谱参数特异性地检测五种游离型胆汁酸。
质谱为Waters Xevo TQD IVD(Waters,Milford,MA)；质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等如表3所示(不同类型仪器，碰撞能量、锥孔电压值有所不同，需要独立优化)。
多重反应监控通过两次筛选，即第一个四级杆进行特定母离子筛选，第二个四级杆进行母离子碎裂产生子离子，第三个四级杆进行特定子离子筛选，具有非常好的检测特异性。可以通过选择反应监控检测到的离子流，以及对应的保留时间，来确定游离型胆汁酸的检测，再利用添加已知量的氘代胆酸内标，氘代脱氧胆酸内标，氘代熊脱氧胆酸内标进行定量。
样品通过超高压液相色谱分离后，不同的游离型胆汁酸在不同洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，先后检测到的物质分别为：氘代熊脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，氘代胆酸，胆酸，鹅脱氧胆酸，氘代脱氧胆酸，脱氧胆酸，石胆酸；胆酸保留时间为3.89min，氘代胆酸保留时间为3.87min，石胆酸保留时间为8.06min，脱氧胆酸保留时间为5.77min，氘代脱氧胆酸保留时间为5.76min，熊脱氧胆酸保留时间为3.61min，氘代熊脱氧胆酸保留时间为3.58min，鹅脱氧胆酸保留时间为5.57min。
标准曲线图见图3至图7；检测限定义为信噪比>3，定量限定义为信噪比>10，保留时间为色谱洗脱出峰的绝对保留时间，所有检测物质的相关系数R2均>0.99，每种游离型胆汁酸的保留时间，检出限，定量限，线性范围以及定量校正方程分别如图4中所示。
通过三日的精密度测试，包括低、中、高三个浓度，日内日间精密度RSD均小于15％，如图5所示，表明检测结果准确，可重复。
五种游离型胆汁酸的保留时间、检测限、定量限、线性范围、线性方程、相关系数如下：
表4
五种游离型胆汁酸的日内和日间精密度数据如下：
表5
(4)血清中游离型胆汁酸的检测：取0.1mL血清样品到1.5mLEP管中，再加入0.3mL低温保存的含内标氘代胆酸内标，氘代脱氧胆酸内标，氘代熊脱氧胆酸乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移0.3mL含内标氘代胆酸内标，氘代脱氧胆酸内标，氘代熊脱氧胆酸的胆汁酸乙腈溶液到另外一个1.5mL EP管，然后用真空冷冻干燥器冻干；
冻干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合组分使用低温离心机在18000g离心力4℃下离心5min，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；
液相色谱串联质谱分析同步骤(2)和(3)，质谱检测得到游离型胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中游离型胆汁酸的含量。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述五种游离型胆汁酸为：胆酸，石胆酸，脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸；
包括如下步骤：
(1)标准品的制备：将上述五种游离型胆汁酸标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液；所述游离型胆汁酸乙腈溶液的浓度均控制在400pmol/L～2μmol/L之间，所述内标为氘代胆酸、氘代脱氧胆酸、氘代熊脱氧胆酸，离心后吸取上清液，进行冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于高效液相色谱串联质谱上样分析；
(2)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对五种游离型胆汁酸进行分离；
(3)串联质谱检测：色谱上分离后的五种游离型胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测五种游离型胆汁酸，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；
(4)血清中游离型胆汁酸的检测：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于高效液相色谱串联质谱上样分析；
高效液相色谱串联质谱上样分析步骤同步骤(2)、步骤(3)，液相色谱质谱检测得到游离型胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中游离型胆汁酸的含量。
2.根据权利要求1中所述高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述含已知浓度内标的乙腈溶液为，所述内标氘代胆酸的浓度为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸的浓度为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸的浓度为126nmol/L。
3.根据权利要求1中所述高通量液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中高通量液相色谱分离条件为：色谱柱：Waters ACQUITYUPLCC18Column:pore sizeparticle size 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1的溶液；采用梯度洗脱方式，见表1或表2；
表1
表2
序号 时间(min) 流速(mL/min) A％ B％ 曲线值 1 - 0.4 65 35 - 2 2.0 0.4 57 43 6 3 3.5 0.4 54 46 6 4 5.0 0.4 41 59 6 5 7.0 0.4 41 59 6 6 8.7 0.4 34 66 6 7 10.7 0.4 2 98 1 8 11.3 0.4 65 35 1 。
4.根据权利要求1中所述高通量液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中质谱检测条件中，每一种游离型胆汁酸的质谱检测参数均先用标准品进行优化，然后利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测五种游离型胆汁酸，所述质谱检测参数为：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，质谱多重反应监控参数如表3所示：
表3
5.根据权利要求1中所述高效液相色谱串联质谱检测五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中两次离心条件为：离心力为18000g，离心温度为4℃，离心时间为5min。
6.根据权利要求1中所述高效液相色谱串联质谱检测五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述步骤(4)中血清与含内标乙腈溶液的体积比为1:3。
7.根据权利要求1中所述高效液相色谱串联质谱检测五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述步骤(4)中血清为人或动物血清。
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