CN109738539A - 液相色谱串联质谱测定样品极长链脂肪酸的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供液相色谱串联质谱测定样品极长链脂肪酸的方法及试剂盒。该方法包括：配制不同浓度的极长链脂肪酸标准品溶液；向标准品溶液中加入稳定同位素内标混匀，加入乙腈和浓盐酸进行样品前处理；然后用正己烷提取，上清液用氮气吹干，复溶后进行液相色谱串联质谱检测；根据标准品溶液的浓度以及检测到的信号强度绘制标准曲线；用待测样本替代步骤B中的标准品溶液进行检测；根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中极长链脂肪酸的浓度，从而实现对样品中极长链脂肪酸的定量检测。本发明成功建立了液相色谱串联质谱测定样品中极长链脂肪酸的方法，该方法用样量少、可快速、特异地检测样品(特别是血清样品)中极长链脂肪酸的含量。

Description

液相色谱串联质谱测定样品极长链脂肪酸的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及液相色谱串联质谱检测技术，具体地说，涉及液相色谱串联质谱测定样品中极长链脂肪酸的方法及试剂盒。

背景技术

过氧化物酶体病是遗传代谢紊乱，由过氧化物酶体生物合成发生缺陷或单个过氧化物酶体缺乏引起。过氧化物酶体病有多种疾病组成，其中最常见的是肾上腺脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy,X-ALD)。该病表现出细胞中过氧化物酶体对VLCFA的氧化发生障碍，以致VLCFA在血、脑白质、肾上腺皮质等器官和组织内大量聚积，引起中枢神经系统脱髓鞘和肾上腺皮质畏缩或发育不良，主要累及肾上腺和脑白质。血清极长链脂肪酸(very long chain fatty acid,VLCFA)主要由22及更多的碳原子组成，包括C22:0、C24:0、C26:0等，通过β氧化作用在过氧化物酶体中分解代谢。检测血极长链脂肪酸(VLCFA)尤其是C26:0/C22:0，C24:0/C22:0比值，将为早期诊断肾上腺脑白质营养不良、过氧化物酶体功能评估提供重要的实验室数据，为该病的早期预防、病情缓解提供辅助支持。因此，VLCFA可用于肾上腺脑白质营养不良诊断、鉴别诊断，过氧化物酶体功能评估。

既往对VLCFA的检测均是基于气相色谱方法，该方法需要对血液样本进行衍生化处理，方法复杂，且气相色谱基本均应用于高校及科研院所，极少有临床医院具有该仪器。此外，目前为止，尚未有气相色谱仪获得体外医疗器械注册证，根据卫计委相关规定在无医疗器械注册证仪器或设备上进行的检测不适用于向患者出具临床报告。液相色谱串联质谱技术是一门新兴的技术，其具有色谱的分离能力，以及质谱的特异性鉴定能力，在小分子物质测定中具有极大的优势，被认为是小分子检测的参考方法(如目前的维生素D，血糖，肌酐等小分子检测的参考方法)，既往由于试剂、技术的发展限制，多用于参考实验室、研究性实验中，但是在近年来逐渐应用于临床检测，然而液相色谱串联质谱技术在国内外尚无适用于临床检测的简单易行的方法及检测试剂。而目前液相色谱串联质谱仪已有医疗器械注册证，适合于进行临床应用，并且国内较大城市的三甲医院很多已配备液相色谱串联质谱仪，液相色谱串联质谱方法具有特异性高、灵敏度好等优点，是许多小分子代谢物的参考方法，且其适用于同时检测多种脂肪酸。

目前尚未发现利用液相色谱串联质谱检测VLCFA的方法，也无配套的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供液相色谱串联质谱测定样品(特别是血清样品)中极长链脂肪酸的方法及试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供液相色谱串联质谱测定样品中极长链脂肪酸的方法，包括以下步骤：

A、配制不同浓度的极长链脂肪酸标准品溶液；

B、向标准品溶液中加入稳定同位素内标混匀，加入乙腈和浓盐酸进行样品前处理；然后用正己烷提取，上清液用氮气吹干，加入复溶液，进行液相色谱串联质谱检测；

C、根据标准品溶液的浓度以及检测到的信号强度绘制标准曲线；

D、用待测样本替代步骤B中的标准品溶液，采用相同方法进行检测；

E、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中极长链脂肪酸的浓度(样本检测信号强度与样本中C22:0、C24:0和C26:0的浓度呈正比)，从而实现对样品中极长链脂肪酸的定量检测。

本发明中，所述样品包括但不限于血清、血浆、羊水。所述极长链脂肪酸包括C22:0、C24:0和C26:0。

前述的方法，C22:0的稳定同位素内标为C22:0-d4，使用浓度为1-20ng/ml，优选10.2ng/ml。

C24:0的稳定同位素内标为C24:0-d4，使用浓度为1-25ng/ml，优选23.2ng/ml。

C26:0的稳定同位素内标为C26:0-d4，使用浓度为1-30ng/ml，优选28.5ng/ml。

步骤B具体为：向50μl标准品溶液中加入10μl稳定同位素内标，混合震荡后加入100-500μl乙腈(优选200μl)，再加入50μl 12mM浓盐酸，70-100℃孵育1-2h(优选70℃孵育1h)，冷却至室温；然后加入1-2ml正己烷(优选1ml)，混合震荡，取上清液，氮气吹干，加入200μl复溶液，准备上机检测。

本发明中，所述复溶液优选甲醇。

步骤B中所用液相色谱柱为Waters C8柱；进行色谱检测所用流动相如下：

流动相A：含0.1-10mM甲酸铵的乙腈水溶液(优选含5mM甲酸铵的乙腈水溶液)；其中，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为1:9-9:1，优选6:4。

流动相B：乙腈异丙醇溶液，其中乙腈和异丙醇体积比为1:9-9:1，优选8:2。

液相色谱检测条件如下：柱温为30-40℃(优选40℃)，进样量1-10μl(优选5μl)。

按以下程序进行梯度洗脱：

质谱检测：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；离子源温度为300-400℃(优选300℃)；雾化气、加热气和气帘气分别为55psi、55psi和30psi，碰撞气为5-20psi(优选8psi)；喷雾电压：-3000—-5000V(优选-4500V)，去溶剂温度为400-600℃(优选550℃)。

本发明中，极长链脂肪酸C22:0、C24:0和C26:0在质谱中所产生的检测信号的母离子分别具有339、367、395.2的质荷比。

C22:0的子离子包含质荷比为339、385.4的子离子。

C24:0的子离子包含质荷比为367、413.7的子离子。

C26:0的子离子包含质荷比为395.2、441.1的子离子。

进一步地，极长链脂肪酸C22:0、C24:0和C26:0的定量离子通道选择质荷比(massto charge,m/z)分别为339→339、367→367和395.2→395.2；定性离子通道m/z分别为385.4→339.4、413.3→367.3和441.1→395.2，内标C22:0-d4、C24:0-d4和C26:0-d4离子通道m/z分别为343.4→343.4、371.5→371.5和399.6→399.6。

利用本发明提供的液相色谱串联质谱检测方法，极长链脂肪酸C22:0的线性检测范围为0.46-235.1μM，最低检出限为0.2μM；极长链脂肪酸C24:0的线性检测范围为0.42-237.9μM，最低检出限为0.2μM；极长链脂肪酸C26:0的线性检测范围为0.04-20.18μM，最低检出限为0.02μM。

第二方面，本发明提供一种用于液相色谱串联质谱测定样品中极长链脂肪酸的试剂盒，所述试剂盒包括极长链脂肪酸标准品溶液、稳定同位素内标、乙腈、浓盐酸、正己烷、甲醇、含0.1-10mM甲酸铵的乙腈水溶液以及乙腈异丙醇溶液中的至少一种。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明首次成功建立适用于临床的液相色谱串联质谱检测VLCFA方法，并提供适用于不同厂家液相色谱串联质谱仪的VLCFA试剂盒，填补了国内该领域检测技术的空白。

(二)减少样本量，每次检测仅需100μl以下的血清样本。

(三)直接检测待测物的分子量(质荷比)，增加检测特异性，避免复杂血液成分中的干扰。

(四)本发明通过样本制备提取血清极长链脂肪酸(C22:0、C24:0和C26:0)，然后将提取的样本通过色谱仪进样至色谱质谱系统，通过色谱柱的初步分离，进入质谱中，再根据质谱中产生不同的质荷比检测待测物，采用稳定同位素标记的C22:0-d4、C24:0-d4和C26:0-d4作为内标，其与C22:0、C24:0和C26:0具有相似的理化性质，可抵消样本处理过程中的不准确因素，以及色谱质谱中信号的抑制或增强。

附图说明

图1为本发明实施例1中液相色谱串联质谱测定血清中极长链脂肪酸的典型谱图。

图2-图4为本发明实施例1中极长链脂肪酸C22:0、C24:0和C26:0的线性检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1液相色谱串联质谱测定血清极长链脂肪酸的方法

1、实验试剂

样本制备液包括：同位素内标溶液、乙腈、浓盐酸(12mM)、正己烷、甲醇(复溶液)。

同位素内标溶液：C22:0-d4溶液：浓度为10.2ng/ml；C24:0-d4溶液：浓度为23.2ng/ml；C26:0-d4溶液：浓度为28.5ng/ml。

仪器分析液包括：

流动相A：含有5mM甲酸铵的乙腈水(v/v，6:4)溶液。

流动相B：乙腈异丙醇(v/v，8:2)溶液。

2、样本制备

取50μl血清样本或极长链脂肪酸(C22:0、C24:0和C26:0)标准品溶液至10ml尿管，加入10μl同位素内标，混合震荡，加入200μl乙腈，加入50μl浓盐酸，70℃恒温水浴孵育1h，冷却至室温，加入1ml正己烷，混合震荡，取上清液800μl，氮气吹干，加入200μl复溶液，等待上机测试，进样体积5μl。

3、检测

液相色谱检测：所用液相色谱柱为Waters C8column(C8色谱柱)，柱温为40℃。

液相色谱流动相A和流动相B按如下梯度进行设置：

质谱检测：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，离子源温度为300℃。极长链脂肪酸C22:0、C24:0和C26:0的定量离子通道选择质荷比(mass to charge,m/z)分别为339→339、367→367和395.2→395.2；定性离子通道m/z分别为385.4→339.4、413.3→367.3和441.1→395.2，内标C22:0-d4、C24:0-d4和C26:0-d4离子通道m/z分别为343.4→343.4、371.5→371.5和399.6→399.6。雾化气、加热气和气帘气分别为55psi、55psi和30psi，碰撞气为8psi；喷雾电压：-4500V，去溶剂温度为550℃。

4、检测效果：本方法及配套试剂检测到的典型谱图如图1所示。C22:0、C24:0和C26:0的线性检测结果分别如图2-图4所示。

可替代的样品前处理方法如下：通过SPE柱进行样本处理，首先使用甲醇、水活化SPE柱，然后加入酸水浴后样本，再加入正己烷洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，再用复溶液复溶后上机检测。该替代方法需用到SPE柱，会增加检测成本。

本发明提供的极长链脂肪酸检测试剂适用于液相色谱串联质谱仪，方法处理简单，用血量少，检测速度快，可减少患者抽血量，患者可快速获得检测报告，方便临床医生根据结果对患者做出医疗诊断。测定结果为直接测定待测物的分子量得到的，特异性强，可有效避免血样中可能存在的紫外吸光度及在色谱柱中保留时间相同的未知物的干扰。本发明提供了极长链脂肪酸测定试剂量产的可能性，部分液相色谱串联质谱仪已有临床注册证，该试剂的量产通过医疗器械注册后可方便临床使用。

本发明对于检测试剂(流动相)、色谱、质谱、前处理等方面均进行了优化。

在研究过程中比较了Water苯基色谱柱、C18色谱柱以及C8色谱柱，由于脂肪酸本身属于脂溶性物质，较容易在色谱柱内残留，且利用C18柱子进行检测时，血清中存在干扰峰，不易于分离，因此本发明最终确定采用C8色谱柱进行分离。研究过程中比较了A、B流动相的有机相比例，由于极长链脂肪酸的脂溶性较强，因此在A相中加入乙腈，B相中优化乙腈和异丙醇比例，从而有效降低了残留对于检测的影响。极长链脂肪酸属于饱和碳链，不易于获得稳定的子离子，因此最终确定母离子和子离子均相同时，可稳定检测。此外，在前处理阶段，本发明比较了不同浓度盐酸、不同孵育时间、不同孵育方式(水浴和油浴)对于样本提取效率的影响，最终确定12mM HCl，70℃孵育1h提取效率较高，有效节约前处理等待时间。

本发明成功建立了液相色谱串联质谱测定样品中极长链脂肪酸的方法，该方法用样量少、可快速、特异地检测样品(特别是血清样品)中极长链脂肪酸的含量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.液相色谱串联质谱测定样品中极长链脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、配制不同浓度的极长链脂肪酸标准品溶液；

B、向标准品溶液中加入稳定同位素内标混匀，加入乙腈和浓盐酸进行样品前处理；然后用正己烷提取，上清液用氮气吹干，加入复溶液，进行液相色谱串联质谱检测；

C、根据标准品溶液的浓度以及检测到的信号强度绘制标准曲线；

D、用待测样本替代步骤B中的标准品溶液，采用相同方法进行检测；

E、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中极长链脂肪酸的浓度，从而实现对样品中极长链脂肪酸的定量检测；

其中，所述样品包括血清、血浆、羊水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述极长链脂肪酸包括C22:0、C24:0和C26:0。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，C22:0的稳定同位素内标为C22:0-d4，使用浓度为1-20ng/ml，优选10.2ng/ml；和/或

C24:0的稳定同位素内标为C24:0-d4，使用浓度为1-25ng/ml，优选23.2ng/ml；和/或

C26:0的稳定同位素内标为C26:0-d4，使用浓度为1-30ng/ml，优选28.5ng/ml。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤B具体为：向50μl标准品溶液中加入10μl稳定同位素内标，混合震荡后加入100-500μl乙腈，再加入50μl 12mM浓盐酸，70-100℃孵育1-2h，冷却至室温；然后加入1-2ml正己烷，混合震荡，取上清液，氮气吹干，加入200μl复溶液，准备上机检测；

其中，所述复溶液为甲醇。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所用液相色谱柱为Waters C8柱；进行色谱检测所用流动相如下：

流动相A：含0.1-10mM甲酸铵的乙腈水溶液；其中，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为1:9-9:1，优选6:4；

流动相B：乙腈异丙醇溶液，其中乙腈和异丙醇体积比为1:9-9:1，优选8:2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，液相色谱检测条件如下：柱温为30-40℃，进样量1-10μl；

按以下程序进行梯度洗脱：

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中进行质谱检测，采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；离子源温度为300-400℃；雾化气、加热气和气帘气分别为55psi、55psi和30psi，碰撞气为5-20psi；喷雾电压：-3000—-5000V，去溶剂温度为400-600℃。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，极长链脂肪酸C22:0、C24:0和C26:0在质谱中所产生的检测信号的母离子分别具有339、367、395.2的质荷比；

C22:0的子离子包含质荷比为339、385.4的子离子；

C24:0的子离子包含质荷比为367、413.7的子离子；

C26:0的子离子包含质荷比为395.2、441.1的子离子。

9.根据权利要求2-8任一项所述的方法，其特征在于，极长链脂肪酸C22:0的线性检测范围为0.46-235.1μM，最低检出限为0.2μM；

极长链脂肪酸C24:0的线性检测范围为0.42-237.9μM，最低检出限为0.2μM；

极长链脂肪酸C26:0的线性检测范围为0.04-20.18μM，最低检出限为0.02μM。

10.用于液相色谱串联质谱测定样品中极长链脂肪酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括极长链脂肪酸标准品溶液、稳定同位素内标、乙腈、浓盐酸、正己烷、甲醇、含0.1-10mM甲酸铵的乙腈水溶液以及乙腈异丙醇溶液中的至少一种；

其中，所述极长链脂肪酸的定义同权利要求2中所述；

所述稳定同位素内标的定义同权利要求3中所述；

所述含0.1-10mM甲酸铵的乙腈水溶液、所述乙腈异丙醇溶液的定义同权利要求5中所述。