CN107607636A - 一种定量测定生物样品中前列腺素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量测定生物样品中前列腺素的方法，采用超高效液相色谱‑离子淌度‑串联质谱检测系统测定生物样品中的前列腺素；在高效液相色谱和质谱之间加装离子淌度池。本发明在质谱的离子源和第一个四级杆之间安装离子淌度池，通过离子淌度的分离模式进一步去除血浆中利马前列腺素的干扰，从而降低了液相色谱的分离难度，变二维色谱为一维色谱，极大地缩短样品分析时间，提高了样品分析的通量。

Description

一种定量测定生物样品中前列腺素的方法

技术领域

本发明属于药物分析研究技术领域，涉及测定生物样品中前列腺素的生物质谱定量分析方法，尤其适合于测定利马前列腺素。

背景技术

利马前列腺素是人工合成的一种前列腺素E1类似物，由日本小野药品工业公司与大日本制药公司合作研发，1988年分别以商品名OPALMON及PRORENAL上市，其化学结构为(E)-7-[(1R,2R,3R)-3-羟基-2-[(3S,5S)-(E)-3-羟基-5-甲基-1-壬烯基-5-氧代环戊基]-2-庚酸(见图1)，分子式C22H36O5，分子量为380.5Da

由于消化酶的破坏，传统的前列腺素类药物易被分解代谢，一般口服无效，而利马前列腺素口服后可以发挥药理作用，提高了其临床的适应性，是最早用于循环系统的口服前列腺素类药物。临床应用的利马前列腺素剂型为利马前列腺素阿尔法环糊精片，用于血栓闭塞性脉管炎引发的各种缺血性症状，例如溃疡、疼痛以及后天性腰椎管狭窄症伴有的下肢疼痛和麻木等主观症状的治疗。

利马前列腺素临床使用剂量极低，用于后天性腰椎管狭窄症的给药剂量为5μg，达峰浓度(Cmax)仅为2.56pg/mL，这要求定量分析利马前列腺素的定量下限(LLOQ)至少达到0.1-0.2pg/mL。同时，体内存在的数倍于利马前列腺素Cmax的系列前列腺素干扰，是该药物体内分析面临的瓶颈问题。

已报道的生物样品中前列腺素类分析方法包括放射标记法、酶联免疫法、气相色谱-质谱法。其中，放射标记法不能用于人体的药代动力学研究，酶联免疫法选择性较差，难以区分利马前列腺素与血浆中大量的前列腺素类干扰，气相色谱-质谱法则需要复杂的衍生化过程。基于多反应监测(MRM)的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)是体内药物分析的首选，但该方法测定血浆中利马前列腺素的最低定量浓度(LLOQ)仅为0.5pg/mL。目前，能满足利马前列腺素药代动力学LLOQ的分析方法是二维液相色谱-串联质谱法(2D-LC-MS/MS)，该方法的问题在于：(1)为了提高分析方法在生物样品中的选择性，MRM监测了特异性较强而信号较弱的反应离子对(m/z 379→m/z 233)，导致采用常规的进样量(10－20μL)灵敏度无法达到LLOQ，该方法不得不采用100μL的超大进样量。如果进行大样本量的分析，色谱柱的耐受性将会受到极大的挑战；(2)即便MRM监测了上述特异性较强的反应离子对，但血浆中内源性的干扰仍极强。为此，该方法的色谱分离采用的是二维色谱分离，每个样品的分析时间长达50分钟，无法满足本品生物等效性(BE)试验数以千计样本量的分析需求。因此，亟需开发高选择性、高信噪比、高通量的新技术，突破利马前列腺素定量分析的瓶颈。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，建立一种选择性好、灵敏度高的人血浆中利马前列腺素的生物质谱定量方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种定量测定生物样品中前列腺素的方法，采用超高效液相色谱-离子淌度-串联质谱检测系统测定生物样品中的前列腺素；在高效液相色谱和质谱之间加装离子淌度池，离子淌度池安装在质谱的离子源和第一个四级杆之间。

进一步的，包括A、待测生物样品处理；B、前列腺素标准曲线制备；C、生物样品中前列腺素含量上机测定；

其中A、待测生物样品处理，包括以下步骤：

1)使用环氧合酶抑制剂处理待测定的生物样品；

2)处理过后的生物样品加入抗吸附溶液、内标溶液、水/乙酸混合溶液，涡流混合，离心；

3)离心所得上清液加到已活化的Bond Elut C18固相萃取柱中，依次加纯水、水/甲醇混合溶液淋洗；

4)将Bond Elut C18固相萃取柱吸附物用乙酸乙酯洗脱到已活化的Bond ElutDEA固相萃取柱上，加水/乙酸混合溶液淋洗；

5)将Bond Elut DEA固相萃取柱吸附物用水/甲醇/乙酸混合溶液洗脱到已活化的OASIS HLB固相萃取柱上，加乙酸溶液淋洗，用乙酸乙酯洗脱；

6)收集洗脱液，40℃氮气流下吹干，残留物加入乙酸铵/乙酸/乙腈混合溶液复溶，涡流混合后可进入超高效液相色谱-离子淌度-串联质谱检测系统测定。

进一步的，A、待测生物样品处理步骤1)中环氧合酶抑制剂中含有0.1mg/mL的阿司匹林和0.1mg/mL吲哚美辛。

进一步的，A待测生物样品处理步骤2)中处理过后的生物样品置于玻璃抗吸附试管或EP管中，再加入抗吸附溶液、内标溶液、水/乙酸混合溶液；所述抗吸附溶液为PGF2α与PGE1的混合溶液，其中PGF2α含量为100～200ng/mL，PGE1的含量为100～200ng/mL。

进一步的，步骤C测定的色谱条件为：Acquity超高效液相色谱系统；色谱柱：CAPCELL PAK C18柱，100mm×2.0mm I.D.，5μm粒径；流动相：水和乙腈，pH值为5±2；梯度洗脱；柱温40±10℃；流速0.3±0.1mL/min；进样量20μL。

进一步的，所述的色谱条件中梯度洗脱程序起始有机相比例为10±5％，最高有机相比例为90±10％，且有机相比例从10±5％升高至90±10％的速率为9±2.5％/min。

进一步的，步骤C测定的质谱条件为：QTrap 6500型串联质谱仪，配有ESI离子化源、SelexION离子淌度系统；负离子方式检测；离子喷射电压-4000±500V；温度500±100℃；源内气体1：氮气压力50±15psi；气体2：氮气压力50±15psi；气帘气体：氮气压力30±10psi；解簇电压：-50±10V；DMS温度：Medium；改性剂：异丙醇；改性剂流速：low；分离电压：3800±400V；补偿电压：-8±2V；DMS分辨率增强：open；扫描方式为MRM；离子反应为m/z 379±0.5→m/z 299±0.5；碰撞能量为-25±10eV。

进一步的，所述的生物样品为血浆、组织液、尿液。

进一步的，所述的前列腺素为利马前列腺素；离子反应为m/z 379.3→m/z299.3。

离子淌度(DMS)技术与传统的液相色谱分离技术不同，它是一种根据待测物离子在电场和气流的共同作用下的迁移率不同，而对样品的不同组分实现分离的先进技术。该技术可以解决传统LC-MS/MS方法所无法解决的技术难题：如超强噪音干扰、共流出组分分析、同分异构体分离、复杂基质中痕量目标化合物的定量分析。本发明首次将DMS技术与传统LC-MS/MS进行有效结合来测定人血浆中利马前列腺素。采取的技术方案是：首先通过超高效液相色谱将利马前列腺素与人血浆中的干扰进行分离，然后利用安装在质谱的离子源和第一个四级杆之间安装离子淌度池进行进一步的分离，通过优化离子淌度池中的分离电压(SV)，温度，改性剂种类及流速，补偿电压(CoV)，分辨率(DR)等参数以达到最强的分离能力，最后利用串联质谱MRM的扫描方式检测专属性强、响应更高的利马前列腺素特征离子对，从而实现对利马前列腺素的定量分析，具体流程如图1所示。本发明创造性地将DMS技术与传统LC-MS/MS结合起来，充分利用了DMS技术降噪的优势，监测了灵敏度更高的特异性离子反应，从而首次建立了定量人血浆中利马前列腺素超高效液相色谱-离子淌度-串联质谱(UPLC-DMS-MS/MS)多模式分离分析方法。该分析方法选择性好、灵敏度高，分析时间短，完全适用于大批量利马前列腺素生物样品的分析。

本发明的优势在于：

在质谱的离子源和第一个四级杆之间安装离子淌度池，通过离子淌度的分离模式进一步去除血浆中利马前列腺素的干扰，从而降低了液相色谱的分离难度，变二维色谱为一维色谱，极大地缩短样品分析时间，提高了样品分析的通量。同时，选取了灵敏度高的反应离子进行MRM定量，使得采用常规的进样量即可达到LLOQ的要求。

下面结合附图和实施例对发明作一详细描述。

附图说明

图1是UPLC-DMS-MS/MS流程图；

图2是利马前列腺素样品处理流程图；

图3是利马前列腺素典型色谱图；

图4健康受试者口服利马前列腺素后血浆药物浓度-时间曲线；

图5定量血浆中利马前列腺素典型标准曲线。

具体实施方式

一种定量测定生物样品中前列腺素的方法，尤其适合于测定利马前列腺素联合三维超高效液相色谱-离子淌度-串联质谱(UPLC-DMS-MS/MS)分离检测技术，实现了对生物样品中的前列腺素高通量定量测定；通过在高效液相色谱和质谱之间加装离子淌度池，利用正交于高效液相色谱分离技术的离子淌度分离技术，增强了去除生物样品中的内源干扰物质的能力；利用串联质谱选择性地检测前列腺素的专属性强、高响应灵敏度的特征离子对，实现了对前列腺素的定量分析。本发明在在质谱的离子源和第一个四级杆之间安装离子淌度池，通过离子淌度的分离模式进一步去除血浆中利马前列腺素的干扰，从而降低了液相色谱的分离难度，变二维色谱为一维色谱，极大地缩短样品分析时间，提高了样品分析的通量

包括以下测定步骤：A、待测生物样品处理；B、前列腺素标准曲线制备；C、生物样品中前列腺素含量上机测定。

A、待测生物样品处理：

1)取用0.1mg/mL的阿司匹林和吲哚美辛处理过的生物样品3mL；

2)将生物样品置于10mL抗吸附玻璃管中，加入抗吸附溶液(含100ng/mL PGF2α与PGE1)100μL，内标溶液150μL、水/乙酸混合溶液(99:1，v/v)6mL，涡流混合1min，离心5min(3500rpm)；

3)上清液加到已活化的Bond Elut C18固相萃取柱中，加纯水4mL、水/甲醇混合溶液(3:2，v/v)4mL溶液淋洗；

4)再用乙酸乙酯4mL洗脱到已活化的Bond Elut DEA固相萃取柱上，加水/乙酸混合溶液(99:1，v/v)2mL溶液淋洗；

5)再用水/甲醇(3:2，v/v)-1％乙酸4mL洗脱到已活化的OASIS HLB固相萃取柱上，加1％乙酸1mL溶液淋洗，用乙酸乙酯3mL洗脱；

6)收集洗脱液，40℃氮气流下吹干，残留物加入5mmol/L乙酸铵-0.1％乙酸/乙腈混合溶液(65:35，v/v)115μL复溶，涡流混合，取20μL进行LC-MS/MS分析。流程如图2所示：

B、前列腺素标准曲线制备：

1)利用空白生物样品将利马前列腺素储备液分别稀释至0.1、0.25、0.6、1.5、3.0、6.0、15pg/mL；

2)取经过步骤A处理的标准曲线样品20μL进行UPLC-DMS-MS/MS分析，记录色谱图，以前列腺素浓度为横坐标，前列腺素峰面积为纵坐标，用加权W＝1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；

C、处理后生物样品上机测定：

取经由A步骤处理后的液体20μL进行UPLC-DMS-MS/MS分析，记录色谱图，将前列腺素面积代入标准曲线，求得前列腺素浓度。

B步骤标准曲线制备及C步骤生物样品中前列腺素含量测定，

色谱条件为：Acquity超高效液相色谱系统；色谱柱：CAPCELL PAK C18柱，100mm×2.0mm I.D.，5μm粒径；流动相：水和乙腈，pH值为5±2；梯度洗脱；柱温40℃；流速0.3mL/min；进样量20μL；

质谱条件为：QTrap 6500型串联质谱仪，配有ESI离子化源、SelexION离子淌度系统和Analyst数据处理软件；离子源：ESI离子化源；负离子方式检测；离子喷射电压-4500V；温度550℃；源内气体1：氮气压力55psi；气体2：氮气压力55psi；气帘气体：氮气压力30psi；解簇电压(DP电压)：-50V；DMS温度：Medium(中)；改性剂：异丙醇；改性剂流速：low(低)；分离电压(SV)：3800V；补偿电压(CoV)：-8V；DMS分辨率增强(DR)：open(开)；扫描方式为MRM；离子反应为m/z 379.3→m/z 299.3；碰撞能量为-25eV。

本发明的前列腺素生物质谱定量方法，可以在样品测定期间利用质量控制样品对方法进行验证；所述的质量控制样品，按照如下步骤制备：

1)利用空白生物样品将前列腺素储备液稀释至所需浓度；

2)前列腺素质控样品每浓度取三个样本，根据标准曲线，得出前列腺素浓度，计算质量控制样品准确度。

其中所述的生物样品优选地为血浆、组织液和/或尿液。其中所述的前列腺素优选地为利马前列腺素。

采用该方法定量测定血浆中利马前列腺素时下限可达到或低于0.1pg/mL，完全可以满足利马前列腺素药代动力学研究对定量下限0.1pg/mL的要求。

样品前处理过程中优选使用玻璃抗吸附试管，并采用浓度为100～200ng/mL的PGF2α与PGE1混合溶液作为固相萃取过程中的抗吸附试剂。

所述的色谱条件中梯度洗脱程序起始有机相比例为10±5％，最高有机相比例为90±10％，且有机相比例从10±5％升高至90±10％的速率为9±2.5％/min时才能在最短的时间内实现对利马前列腺素与血浆中的干扰物质的分离。

优选地同时达到分离电压(SV)：3800±400V；DMS温度：Medium(中)；改性剂流速：low(低)；DMS分辨率增强(DR)：open(开)的条件使DMS在去除干扰的同时保证高灵敏度，以实现高通量定量测定生物样品中生物样品中前列腺素，优选地为利马前列腺素，下限达到或小于0.1pg/mL。

在待测物为血浆中利马前列腺素时，利马前列腺素在血浆中存在系列内源性前列腺素干扰，严重干扰利马前列腺素的测定，通过在血液样品采集过程中加入了0.1mg/mL的环氧合酶抑制剂阿司匹林和吲哚美辛抑制环氧合酶的活性，可防止系列内源性前列腺素的继续产生，起到降低了血浆中前列腺素类干扰的水平的效果。

实施例1

本实施例具体测定了血浆中的利马前列腺素。

健康受试者空腹口服受试制剂利马前列腺素片5μg，在给药前0h(给药前30分钟内)和给药后10min、15min、20min、25min、30min、40min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h共13个时间点采集静脉血，每次取血14mL(共2管)，缓慢置于经肝素钠处理的抗吸附试管中，采用4℃离心机，1800g，离心5min。离心后，将血浆转移到抗吸附冻存管中。测定血浆中利马前列腺素的含量，血浆药物浓度-时间曲线见图4。

主要步骤如下：

A、待测生物样品处理：

取血浆样品3mL，置于10mL抗吸附玻璃管中，加入抗吸附溶液(含100ng/mL PGF2α与PGE1)100μL，内标溶液150μL、水/乙酸混合溶液(99:1，v/v)6mL，涡流混合1min，离心5min(3500rpm)，上清加到已活化的Bond Elut C18固相萃取柱中，加纯水4mL、水/甲醇混合溶液(3:2，v/v)4mL溶液淋洗，用乙酸乙酯4mL洗脱到已活化的Bond Elut DEA固相萃取柱上，加水/乙酸混合溶液(99:1，v/v)2mL溶液淋洗，用水/甲醇(3:2，v/v)-1％乙酸4mL洗脱到已活化的OASIS HLB固相萃取柱上，加1％乙酸1mL溶液淋洗，用乙酸乙酯3mL洗脱，收集洗脱液，40℃氮气流下吹干，残留物加入5mmol/L乙酸铵(pH 4.5)-0.1％乙酸/乙腈混合溶液(65:35，v/v)115μL复溶，涡流混合，取20μL进行LC-MS/MS分析。流程如图2所示：

B、利马前列腺素标准曲线制备：

1)利用空白血浆将利马前列腺素储备液分别稀释至0.1、0.25、0.6、1.5、3.0、6.0、15pg/mL；

2)取20μL进行UPLC-DMS-MS/MS分析，记录色谱图，以利马前列腺素浓度为横坐标，利马前列腺素峰面积为纵坐标，用加权W＝1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；如图5所示。

C、处理后生物样品上机测定：

上述步骤中涉及利马前列腺素生物质谱定量方法测定的条件如下：

色谱条件为：超高效液相色谱系统；色谱柱：CAPCELL PAK C18柱，100mm×2.0mmI.D.，5μm粒径；流动相：水和乙腈，pH值为5±2；梯度洗脱；柱温40℃；流速0.3mL/min；进样量20μL；

所述的色谱条件中的梯度洗脱，程序见表1，

表1梯度洗脱程序

其中A是水，B是乙腈。

质谱条件为：QTrap 6500型串联质谱仪，配有ESI离子化源、SelexION离子淌度系统和Analyst数据处理软件；离子源：ESI离子化源；负离子方式检测；离子喷射电压-4500V；温度550℃；源内气体1：氮气压力55psi；气体2：氮气压力55psi；气帘气体：氮气压力30psi；解簇电压(DP电压)：-50V；DMS温度：Medium(中)；改性剂：异丙醇；改性剂流速：low(低)；分离电压(SV)：3800V；补偿电压(CoV)：-8V；DMS分辨率增强(DR)：open(开)；扫描方式为MRM；离子反应为m/z 379.3→m/z 299.3；碰撞能量为-25eV。

鉴于利马前列腺素典型标准曲线的线性(图5)以及测得的血浆中利马前列腺素药物浓度-时间曲线(图4)，本发明所述的测定血浆中利马前列腺素的生物质谱定量方法线性关系良好，其准确度与精密度等完全符合FDA和CFDA生物样品分析方法的相关指导原则，可用于血浆中利马前列腺素的定量分析。

Claims (9)

1.一种定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：采用超高效液相色谱-离子淌度-串联质谱检测系统测定生物样品中的前列腺素；在高效液相色谱和质谱之间加装离子淌度池；离子淌度池安装在质谱的离子源和第一个四级杆之间。

2.根据权利要求1所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：包括A、待测生物样品处理；B、前列腺素标准曲线制备；C、生物样品中前列腺素含量上机测定；

其中A、待测生物样品处理，包括以下步骤：

1)使用环氧合酶抑制剂处理待测定的生物样品；

2)处理过后的生物样品加入抗吸附溶液、内标溶液、水/乙酸混合溶液，涡流混合，离心；

3)离心所得上清液加到已活化的Bond Elut C18固相萃取柱中，依次加纯水、水/甲醇混合溶液淋洗；

4)将Bond Elut C18固相萃取柱吸附物用乙酸乙酯洗脱到已活化的Bond Elut DEA固相萃取柱上，加水/乙酸混合溶液淋洗；

5)将Bond Elut DEA固相萃取柱吸附物用水/甲醇/乙酸混合溶液洗脱到已活化的OASIS HLB固相萃取柱上，加乙酸溶液淋洗，用乙酸乙酯洗脱；

6)收集洗脱液，40℃氮气流下吹干，残留物加入乙酸铵/乙酸/乙腈混合溶液复溶，涡流混合后可进入超高效液相色谱-离子淌度-串联质谱检测系统测定。

3.根据权利要求2所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：A、待测生物样品处理步骤1)中环氧合酶抑制剂中含有0.1mg/mL的阿司匹林和0.1mg/mL吲哚美辛。

4.根据权利要求2所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：A待测生物样品处理步骤2)中处理过后的生物样品置于玻璃抗吸附试管或EP管中，再加入抗吸附溶液、内标溶液、水/乙酸混合溶液；所述抗吸附溶液为PGF2α与PGE1的混合溶液，其中PGF2α含量为100～200ng/mL，PGE1的含量为100～200ng/mL。

5.根据权利要求1所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：步骤C测定的色谱条件为：Acquity超高效液相色谱系统；色谱柱：CAPCELL PAK C18柱，100mm×2.0mm I.D.，5μm粒径；流动相：水和乙腈，pH值为5±2；梯度洗脱；柱温40±10℃；流速0.3±0.1mL/min；进样量20μL。

6.根据权利要求5所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：色谱条件中梯度洗脱程序起始有机相比例为10±5％，最高有机相比例为90±10％，且有机相比例从10±5％升高至90±10％的速率为9±2.5％/min。

7.根据权利要求1所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：步骤C测定的质谱条件为：QTrap 6500型串联质谱仪，配有ESI离子化源、SelexION离子淌度系统；负离子方式检测；离子喷射电压-4000±500V；温度500±100℃；源内气体1：氮气压力50±15psi；气体2：氮气压力50±15psi；气帘气体：氮气压力30±10psi；解簇电压：-50±10V；DMS温度：Medium；改性剂：异丙醇；改性剂流速：low；分离电压：3800±400V；补偿电压：-8±2V；DMS分辨率增强：open；扫描方式为MRM；离子反应为m/z 379±0.5→m/z 299±0.5；碰撞能量为-25±10eV。

8.根据权利要求1所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：所述的生物样品为血浆、组织液、尿液。

9.根据权利要求1所述的定量测定生物样品中前列腺素的方法，其特征在于：所述的前列腺素为利马前列腺素；离子反应为m/z 379.3→m/z 299.3；定量下限达到或小于0.1pg/mL。