CN117192001B - 血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，包括步骤：S1、利用全自动固相萃取法对血清样本进行萃取，具体包括：取设定量的血清样本，加入固相萃取柱进行过滤；然后向固相萃取柱中加入洗涤液进行除杂；然后向固相萃取柱中加入洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；利用复溶液对收集的洗脱液进行复溶，得到萃取产物；S2、将设定量的萃取产物进样到色谱‑质谱联用系统进行分析，得到亚油酸代谢物的定量分析结果；检测方法能够对三十七种亚油酸全通路代谢物进行定量检测和分析，该方法具有良好的准确度和精确度，提取回收率和基质效应符合生物样品的分析要求，能够用于血清样本中亚油酸全通路代谢产物的半定量检测分析。
Description
技术领域
本发明属于生物材料检测分析技术领域，具体涉及血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法。
背景技术
亚油酸是一种不饱和脂肪酸，具有清除自由基、提高人体抗氧化能力和免疫功能，同时还能促进人体生长，调节血液胆固醇和甘油三酸脂，同时还能预防动脉硬化，促进脂肪氧化分解，有效促进人体蛋白质的合成，对人体进行全面的良性调节。
但是，长期大量使用共轭亚油酸会引起许多不良反应，如头晕眼花、恶心想吐、身体瘙痒、四肢肿胀、消化不良、胃烧心腹泻等，这些都是共轭亚油酸对人体造成的伤害。
亚油酸在体内的代谢过程包括氧化、装配、转运和清除，目前已知亚油酸在体内的全通路代谢产物达三十七种，但是还没有有效的方法能够对三十七种代谢产物进行检测分析。
发明内容
有鉴于此，一些实施例公开的技术方案是血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，包括步骤：
S1、利用全自动固相萃取法对血清样本进行萃取；具体包括：
取设定量的血清样本，加入固相萃取柱进行过滤；
然后向固相萃取柱中加入洗涤液进行除杂；
然后向固相萃取柱中加入洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；
利用复溶液对收集的洗脱液进行复溶，得到萃取产物；
S2、将设定量的萃取产物进样到色谱-质谱联用系统进行分析，得到亚油酸代谢物的定量分析结果；其中，
色谱条件包括：
Waters ACQUITY UPLC系统；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱；
流动相：A：乙腈：水=45:55，含0.02%甲酸；B：乙腈：异丙醇=50:50；
梯度洗脱：0-12 min, 0-60% B；12.0-14.0 min，60-100% B；14.0-14.1 min，0%B；14.1-16.0 min，0% B；流速：0.4mL/min；
柱温：40℃，样本室温：4℃，进样量：5μL；
质谱条件包括：
XEVO TQS检测器；
离子源：ESI离子源；
模式：负离子模式；
毛细管电压：2KV；锥孔电压：40V；
离子源温度：150℃，去溶剂温度：400℃；
锥孔气流速：150L/Hr，去溶剂气流速：800L/Hr；
MRM多反应监测模式。
进一步，一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，步骤S1中，对血清样本的萃取在固相萃取装置上进行，固相萃取装置采用Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，萃取过程具体包括：
采用甲醇活化Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，然后用超纯水进行平衡处理；
将血清样本加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱进行过滤；
然后向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入纯水溶液进行除杂，并抽真空处理10min；
然后向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入0.02%（V/V）甲醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液；用氮气吹干；
然后将50%乙腈水溶液加入吹干的洗脱液中进行复溶，随后进行涡旋2min，4℃、12000rpm条件下离心5min，得到萃取产物。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，步骤S1中，血清样本的量设定为50μL。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，步骤S1中，血清样本中，包含三十七种标准品和氘代内标，每种标准品的浓度为25ng/mL，氘代内标的浓度为100ng/mL；步骤S2中，定量分析得到三十七种亚油酸代谢物。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，步骤S1中，血清样本为大鼠血清样本、人体血清样本。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，洗涤液为水溶液，洗脱液为0.02%（V/V）甲酸甲醇溶液，复溶液为甲醇溶液。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，洗涤液为纯水，洗脱液为0.02%（V/V）甲酸甲醇溶液，复溶液为50%（V/V）乙腈水溶液。
本发明实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，能够对三十七种亚油酸全通路代谢物进行定量检测和分析，该方法具有良好的准确度和精确度，提取回收率和基质效应符合生物样品的分析要求，能够用于血清样本中亚油酸全通路代谢产物的半定量检测分析。
附图说明
图1、实施例1 亚油酸全通路代谢物出峰强度比较图一；
图2、实施例1亚油酸全通路代谢物出峰强度比较图二；
图3、实施例1亚油酸全通路代谢物出峰强度比较图三；
图4、实施例2亚油酸全通路代谢物出峰强度比较图一；
图5、实施例2亚油酸全通路代谢物出峰强度比较图二；
图6、实施例2亚油酸全通路代谢物出峰强度比较图三；
图7、实施例3 亚油酸全通路代谢物的直方图；
图8、实施例3 亚油酸全通路代谢物回收率比较图；
图9、实施例3 亚油酸全通路代谢物基质效应比较图；
图10、实施例4亚油酸全通路代谢物的直方图；
图11、实施例4 提取回收率对比示意图；
图12、实施例4提取基质效应对比示意图；
图13、实施例5 亚油酸全通路代谢物的质谱图一；
图14、实施例5 亚油酸全通路代谢物的质谱图二；
图15、实施例5 亚油酸全通路代谢物的质谱图三。
具体实施方式
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本发明实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本发明实施例中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明实施例公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明实施例所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明实施例中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5%，如小于或等于±2%，如小于或等于±1%，如小于或等于±0.5%，如小于或等于±0.2%，如小于或等于±0.1%，如小于或等于±0.05%。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5%”的数值范围应被解释为不仅包括1%至5%的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2%、3.5%和4%，和子范围，如1%～3%、2%～4%和3%～5%等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。
在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。
为了更好的说明本发明内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
在不冲突的前提下，本发明实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本发明实施例公开的内容。
在一些实施方式中，血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法包括步骤：
S1、利用全自动固相萃取法对血清样本进行萃取；具体包括：
取设定量的血清样本，加入固相萃取柱进行过滤；通常利用固相萃取柱对血清样本进行自然吸附，将血清样本中的亚油酸全通路代谢物吸附在固相萃取柱上；
然后向固相萃取柱中加入洗涤液进行除杂；通常固定萃取柱中加入洗涤液，以除去固相萃取柱上吸附的其他杂质，防止杂质在后续步骤中影响对代谢物的检测分析；
然后向固相萃取柱中加入洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；通常利用洗脱液将吸附在固相萃取柱上的代谢物洗脱，收集洗脱液；收集的洗脱液中包含有待检测分析的亚油酸全通路代谢物；
利用复溶液对收集的洗脱液进行复溶，得到萃取产物；通常利用复溶液对收集的洗脱液进行复溶，以得到适合于进行后续分析的萃取产物样本；
S2、将设定量的萃取产物进样到色谱-质谱联用系统进行分析，得到亚油酸代谢物的定量分析结果；通常根据色谱-质谱联用系统的检测需要，从萃取产物中取一定量的萃取产物样本，进样到色谱-质谱联用系统中进行检测分析；通常在检测分析之前，需要对色谱质谱系统的检测条件进行优化、选择。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，步骤S1中，对血清样本的萃取在固相萃取装置上进行，固相萃取装置采用Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，萃取过程具体包括：
采用甲醇活化Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，然后用超纯水进行平衡处理；
将血清样本加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱进行过滤；
然后向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入洗涤液进行除杂，并抽真空处理10min；其中，洗涤液为纯水；
然后向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；用氮气吹干；其中，洗脱液为0.02%（V/V）甲醇水溶液；
然后将复溶液加入吹干的洗脱液中进行复溶，随后进行涡旋2min，4℃、12000rpm条件下离心5min，得到萃取产物。其中，复溶液为50%（V/V）乙腈水溶液。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，步骤S1中，血清样本的量设定为50μL。通常地，血清样本的上样量对色谱-质谱系统检测分析过程中的出峰数量、峰值等产生影响，选择合适的上样品可以确保检测分析结果可靠、准确，尽可能分析所有的亚油酸代谢物。作为较为优选实施例，血清样本的量设定为50μL。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，步骤S1中，血清样本中，包含三十七种标准品和氘代内标，每种标准品的浓度为25ng/mL，氘代内标的浓度为100ng/mL；步骤S2中，定量分析得到三十七种亚油酸代谢物。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，能够用于大鼠血清样本对其中亚油酸全通路代谢物进行半定量检测。
一些实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，能够用于人体血清样本对其中亚油酸全通路代谢物进行半定量检测。
以下结合实施例对技术细节做进一步示例性说明。
本申请实施例中，采用的材料与仪器包括：
三十七种亚油酸代谢产物标准品化合物，均购自于美国Cayman公司，标准品信息详见表1；
甲醇、乙腈和异丙醇（质谱级，美国fisher公司）；甲酸（质谱级，美国fisher公司）；超纯水（自制，美国Millipore公司）；
Oasis HLB cartridge 固相萃取柱（美国Waters公司）；MIKRO 220R低温冷冻离心机（德国Hettich公司）；Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪（睿科仪器有限公司）；VIBRAX VXR basic涡旋混合器（德国IKA公司）；NA-5L氮空一体机（北京中兴汇利科技发展有限公司）；SBH130D/3样品浓缩仪（英国 STUART 公司）；超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国Waters公司）；
血清样品来自SD空白雄性大鼠，按照实验要求，依据规范、合理的操作流程采集提供。
表1 三十七种亚油酸代谢产物标准品化合物信息列表
本文实施例中，色谱条件包括：
Waters ACQUITY UPLC系统；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱；
流动相：A：乙腈：水=45:55，含0.02%甲酸；B：乙腈：异丙醇=50:50；
梯度洗脱：0-12 min, 0-60% B；12.0-14.0 min，60-100% B；14.0-14.1 min，0%B；14.1-16.0 min，0% B；流速：0.4mL/min；
柱温：40℃，样本室温：4℃，进样量：5μL；
质谱条件包括：
XEVO TQS检测器；
离子源：ESI离子源；
模式：负离子模式；
毛细管电压：2KV；锥孔电压：40V；
离子源温度：150℃，去溶剂温度：400℃；
锥孔气流速：150L/Hr，去溶剂气流速：800L/Hr；
MRM多反应监测模式下进行，采用Masslynx软件中的IntelliStart进行母子离子对、锥孔电压和碰撞能量的优化，结果见表2。
表2 亚油酸全通路代谢物质谱检测条件列表
一些实施例中，将三十七种亚油酸全通路代谢物的标准品分别用甲醇溶剂溶解，得到浓度为500 ng/mL的标准品工作液；通常标准品溶液储存在-20℃冰箱中密封避光保存，待用。
实施例1
血清样本前处理方式的优化
通常，对血清样本进行分析前，可以对其进行前处理，提高检测分析的准确度和可靠度。本实施例1中，采用两种方式比较样本前处理的效果；
其一是采用上样前处理方式，即先进行蛋白沉淀，然后进行上样分析；具体包括：
取血清样本100μL，加入4倍量冷甲醇，涡旋1min，放于-20℃冰箱内孵育15min，于4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液待用；
安装固相萃取装置，将Oasis HLB Cartridge固相萃取柱依次用2mL甲醇活化、2mL超纯水溶液进行平衡预处理；
将上清液加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，自然吸附过滤；
过虑后，向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入2mL的10%（v/v）甲醇水溶液除杂，然后进行抽真空处理10min，向固相萃取柱中加人2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，洗脱液中剩余有残留物；
在洗脱液的残留物中加入50μL甲醇复溶液进行复溶，涡旋2min，于4℃、12000rpm条件下离心5min，LC-MS上样检测，进样量5μL；
其二是，直接上样方式，即直接将血清样品进行上样分析，具体包括：
安装固相萃取装置，将Oasis HLB Cartridge固相萃取柱依次用2mL甲醇活化、2mL超纯水溶液进行平衡预处理；
取血清样本100μL加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，自然吸附过滤；
过虑后，向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入2mL的10%甲醇水溶液除杂，然后进行抽真空处理10min，向固相萃取柱中加人2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，洗脱液中剩余有残留物；
在洗脱液的残留物中加入50μL甲醇复溶液进行复溶，涡旋2min，于4℃、12000rpm条件下离心5min，LC-MS上样检测，进样量5μL。
实施例1的实验结果见图1、图2、图3所示；
从图1～3可以看出，血清样本中亚油酸代谢全通路代谢物大多数在直接上样的情况下出峰个数更多并且响应值更高，且直接上样方法更为简便，更适合于大量样本的检测。所以，直接上样方式为优选实施方式。
实施例2
血清样本上样量的优化
实施例2中，对血清样本的上样量进行优化，以最大程度地优化检测结果中化合物的出峰数量并确保结果可靠性。
实施例2中，采用直接上样方式进行分析，具体包括：
安装固相萃取装置，将Oasis HLB Cartridge固相萃取柱依次用2mL甲醇活化、2mL超纯水溶液进行平衡预处理；
分别取血清样本50μL、100μL加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，自然吸附过滤；其中，血清样本中含有2μL氘代内标，氘代内标的浓度为100ng/mL；
过虑后，向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入10%（V/V）甲醇水溶液除杂，然后进行抽真空处理10min，向固相萃取柱中加人1.5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，洗脱液中剩余有残留物；
在洗脱液的残留物中加入50μL甲醇进行复溶，涡旋2min，于4℃、12000rpm条件下离心5min，LC-MS上样检测，进样量5μL。
实施例2的检测结果见图4、图5、图6所示；
从图4～6可以看出，50μL的血清样本经固相萃取后出峰响应值强度即能够满足检测需求，因此50μL的血清样品体积即可实现对亚油酸全通路代谢物的定量检测；
本实施例2结果表明，利用较少的样本量即可实现对亚油酸及其代谢产物全通路血清样本的定量检测。
实施例3
萃取方法的优化
通常用手动固相萃取仪器可以显着提高灵敏度，但方法重复性不足，不利于对代谢组学中大规模样品的检测；本实施例3中对手动固相萃取和自动固相萃取方法进行优化选择；
其中，手动固相萃取在Visiprep™的仪器上进行，每个手动固相萃取仪最多可容纳十二个色谱柱；手动固相萃取方法包括：
启动手动固相萃取仪之前，用水冲洗色谱柱，针头和阀门；
使用Oasis HLB（亲水亲脂性平衡）固相萃取柱（1cc，30mg）萃取50μL大鼠血清样本中的亚油酸代谢物；用2mL甲醇和2mL水平衡Oasis HLB固相萃取柱；
上样后，用2 mL 10%（V/V）甲醇水溶液洗涤固相萃取柱，真空处理10分钟；
用1.5 mL 甲醇洗脱固相萃取柱，将收集的样本在氮气下干燥后，用50 μL 甲醇重新溶解，涡旋2分钟，并在4℃和12000 rpm下离心5分钟，然后进行UPLC-MS/MS分析。
自动固相萃取法中，采用由Trilution LH软件（RayKol Group Corp.，Ltd.）控制的Fotector Plus自动固相萃取（RayKol Group Corp.，Ltd.）；
使用Oasis HLB（亲水亲脂性平衡）固相萃取柱（1cc，30mg）萃取50μL大鼠血清样本中的亚油酸代谢物；用2mL甲醇和2mL水平衡Oasis HLB固相萃取柱；
上样后，用2mL 10%（v/v）甲醇水溶液洗涤固相萃取柱，在N2下干燥10分钟，并使用1.5mL甲醇洗脱提取物；
将提取物在N2流下蒸发至干燥，然后，将残余物溶解在50μL甲醇中，并在4°C下以12000 rpm离心10分钟，然后进行UPLC-MS/MS分析。
实施例3的结果如图7所示；
如图7可知，两种方法之间的峰数没有太大差异。然而，自动固相萃取中CV小于10%的亚油酸全通路代谢物数量大于手动固相萃取中的数量，说明自动固相萃取方法具有较好的重现性。这可能是由于洗脱液较少暴露于空气中，溶剂对杂质的吸附较少，洗脱更彻底。
使用自动固相萃取可以更好地检测亚油酸全通路代谢物，可以大大减少了劳动时间，更适合大规模代谢组学研究。
提取回收率和基质效应
实施例3中，进一步对血清样本中亚油酸代谢物的提取回收率进行考察，并考察血清样本中的基质效应。具体地，考察血清样本中标准品溶液和氘代内标的加入时机对亚油酸代谢物的回收率影响，以及基质效应。
其一是，采用提前加标方式，即在固相萃取之间加入标准品溶液和氘代内标；具体过程包括：
安装固相萃取装置，Oasis HLB Cartridge固相萃取柱依次用2mL甲醇活化，2mL超纯水溶液进行平衡预处理；
血清样本中加入三十七种标准品溶液和氘代内标，其中，每种标准品溶液的浓度为25ng/mL，氘代内标的浓度为100ng/mL；取50μL血清样本加入固相萃取柱，自然吸附过滤；
过虑后，加入2mL 10%（V/V）甲醇水溶液除杂，然后进行抽真空处理10分钟；
向固相萃取柱中加1.5mL甲醇洗脱收集，氮气吹干；
之后加入50μL复溶液进行复溶，涡旋2min，于4℃、12000rpm条件下离心5min，LC-MS上样检测，进样量5μL；其中，复溶液为50μL甲醇溶液；
测定进行三组平行实验。
其二是，采用提取后加标方式，即在固相萃取之后，加入标准品溶液和氘代内标；具体包括：
安装固相萃取装置，Oasis HLB Cartridge固相萃取柱依次用2mL甲醇活化、2mL超纯水溶液进行平衡预处理；
取血清样本50μL加入固相萃取柱，自然吸附过滤；
过虑后，加入2mL超纯水除杂，然后进行抽真空处理10分钟；
向固相萃取柱中加1.5mL甲醇洗脱收集，氮气吹干；
之后加入50μL复溶液进行复溶，涡旋2min，于4℃、12000rpm条件下离心5min，LC-MS上样检测，进样量5μL；其中，复溶液为50μL甲醇溶液，其中含有2μL标准品和氘代内标，每种标准品溶液的浓度为25ng/mL，氘代内标的浓度为100ng/mL；
测定进行三组平行实验。
基质效应的计算方法为：
基质效应={峰面积（提取后加标）-峰面积（提取不加标）}/峰面积（标准品）×100%
本实施例3的结果如图8、9所示；
结果表明，两种方法的提取回收率并没有显着差异，但可以发现在80%-120%的范围内，自动固相萃取占比更多，表明自动固相萃取方法对亚油酸代谢全通路更具有稳定的提取效率。
结果表明，使用自动固相萃取可以更好地检测亚油酸全通路代谢物，该方法可以大大减少了劳动时间，更适合大规模代谢组学研究。
实施例4
自动固相萃取方法条件的优化
自动固相萃取洗脱液的优化
作为一种较为优选实施例，自动固相萃取方法中：
方案A：以10%甲醇水溶液作为洗涤液，甲醇为洗脱液和为复溶液。
本实施例4中，选定以下两种方案进一步对洗脱液进行优化：
方案B：纯水为洗涤液，甲醇溶液为洗脱液，甲醇溶液为复溶液；
方案C：纯水为洗涤液，0.02%（v/v）甲酸甲醇溶液为洗脱液，甲醇溶液为复溶液。
实验结果如图10所示；从图10可以看出，方案C对应的CV<5%出峰个数最多，而CV>30%没有出峰，说明方案C相对更优，更有利于洗脱，这是由于洗脱液中的甲酸与亚油酸全通路代谢物之间的极性相似，这有助于提取亚油酸全通路代谢物。有利于提高一些代谢物的提取回收率，例如二十烷类前列腺素和白三烯类。
自动固相萃取复溶溶剂的优化
本实施例4中，选定以下两种方案进一步对复溶溶剂进行优化：
方案A：纯水为洗涤液，0.02%（V/V）甲酸甲醇溶液为洗脱液，甲醇溶液为复溶液；
方案B：纯水为洗涤液，0.02%（V/V）甲酸甲醇溶液为洗脱液，50%（v/v）乙腈水溶液为复溶液。
实验结果如图11、12所示；
图11中，与方案A相比，方案B中在50%乙腈复溶条件下，所有类花生酸显示出接近100%的提取回收率，对于其他样品，也可以观察到相同的提取回收率，都接近100%，结果很理想。
图12中，方案B与方案A相比，没有表现出明显更多的基质效应。
总之，以 50%（v/v）乙腈作为复溶液可以对包括类花生酸类在内的所有亚油酸全通路代谢物类获得最佳结果。
实施例5
亚油酸全通路代谢物检测结果
本实施例5使用标准品及内标氘代亚油酸全通路代谢物对检测方法的提取回收率和基质效应进行评估。
检测过程包括：
安装固相萃取装置，将Oasis HLB Cartridge固相萃取柱依次用2mL甲醇活化、2mL超纯水溶液进行平衡预处理；
取大鼠血清，将三十七种标准品和氘代亚油酸全通路代谢物内标加入血清中，得到实验用血清样本；其中，每种标准品溶液的浓度为25ng/mL，氘代内标的浓度为100ng/mL；
取血清样本50μL加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，自然吸附过滤；
过虑后，向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入2mL的10%甲醇水溶液除杂，然后进行抽真空处理10min，向固相萃取柱中加人2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，洗脱液中剩余有残留物；
在洗脱液的残留物中加入50μL浓度为的50%（V/V）乙腈水溶液进行复溶，涡旋2min，于4℃、12000rpm条件下离心5min，LC-MS上样检测，进样量5μL；
色谱条件：
Waters ACQUITY UPLC系统；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱；流动相：A：乙腈：水=45:55，含0.02%甲酸；B：乙腈：异丙醇=50:50；梯度洗脱：0-12 min, 0-60% B；12.0-14.0 min，60-100% B；14.0-14.1 min，0% B；14.1-16.0 min，0% B；流速：0.4mL/min；柱温：40℃，样本室温：4℃，进样量：5μL；
质谱条件：
XEVO TQS检测器；离子源：ESI离子源；模式：负离子模式；毛细管电压：2KV；锥孔电压：40V；离子源温度：150℃，去溶剂温度：400℃；锥孔气流速：150L/Hr，去溶剂气流速：800L/Hr；MRM多反应监测模式下进行。
回收率和基质效应的结果如表3所示；三十七种代谢物的质谱图见图13、图14和图15所示。
结果表明，亚油酸全通路代谢物的结构和化学性质与内标相似，因此它们的离子抑制效率、提取效率也很相似。大部分亚油酸全通路代谢物的回收率均大于80%，而5-iPF2a-VI和LTE4的提取回收率较低，这可能与基质效应或者固相萃取时发生非特异性结合有关。大部分类二十烷酸的基质效应均大于80%，而PGs和TXs的基质效应略低。基质效应结果表明，固相萃取可去除大部分的基质效应影响。从日内精密度和日间精密度的结果来看，RSD%均小于30%，说明检测方法具有良好的准确度和精密度。
表3 亚油酸全通路代谢物提取回收率、基质效应、日内精密度和日间精密度
本发明实施例公开的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，能够对三十七种亚油酸全通路代谢物进行定量检测和分析，该方法具有良好的准确度和精确度，提取回收率和基质效应符合生物样品的分析要求，能够用于血清样本中亚油酸全通路代谢产物的半定量检测分析。
本发明实施例公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本发明的发明构思，并不构成对本发明实施例技术方案的限定，凡是对本发明实施例公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本发明具有相同的发明构思，都在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1、利用全自动固相萃取法对血清样本进行萃取；对血清样本的萃取在固相萃取装置上进行，所述固相萃取装置采用Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，其规格为1cc、30mg，萃取过程具体包括：
采用甲醇活化Oasis HLB Cartridge固相萃取柱，然后用超纯水进行平衡处理；
将血清样本加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱进行过滤；其中，血清样本的量为50μL；
然后向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入2ml纯水进行除杂，在N2下干燥10分钟；
然后向Oasis HLB Cartridge固相萃取柱加入0.02%（V/V）甲酸甲醇溶液1.5ml进行洗脱，收集洗脱液；用氮气吹干；
然后将50%（V/V）乙腈水溶液50μl加入吹干的洗脱液中进行复溶，随后进行涡旋2min，4℃、12000rpm条件下离心5min，得到萃取产物 ；
S2、将设定量的萃取产物进样到色谱-质谱联用系统进行分析，得到三十七种亚油酸代谢物的定量分析结果；
其中，色谱条件包括：
Waters ACQUITY UPLC系统；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱；
流动相：A：乙腈：水=45:55，含0.02%甲酸；B：乙腈：异丙醇=50:50；
梯度洗脱：0-12 min, 0-60% B；12.0-14.0 min，60-100% B；流速：0.4mL/min；
柱温：40℃，样本室温：4℃，进样量：5μL；
质谱条件包括：
XEVO TQS检测器；
离子源：ESI离子源；
模式：负离子模式；
毛细管电压：2KV；锥孔电压：40V；
离子源温度：150℃，去溶剂温度：400℃；
锥孔气流速：150L/Hr，去溶剂气流速：800L/Hr；
MRM多反应监测模式；
三十七种亚油酸全通路代谢物及其母子离子对、锥孔电压和碰撞能量如下表：
2.根据权利要求1所述的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，其特征在于，对血清样本中亚油酸全通路代谢物的提取回收率进行考察，其方法为：在血清样本中，加入三十七种亚油酸全通路代谢物标准品溶液和氘代内标，每种标准品溶液的浓度为25ng/mL，氘代内标的浓度为100ng/mL，然后再取50μl血清样本，加入Oasis HLB Cartridge固相萃取柱进行萃取。
3.根据权利要求1所述的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，其特征在于，所述血清样本为大鼠血清样本、人体血清样本。
4.根据权利要求2所述的血清样本中亚油酸全通路代谢物的检测方法，其特征在于，所述标准品溶液为亚油酸全通路代谢物标准品的甲醇溶液。
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| CN117192001A (zh) | 2023-12-08 |
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