CN104316609A - 花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期检测试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期检测试剂盒中的应用，属于生物技术领域。本发明通过对49份子痫前期患者血清样本中花生四烯酸代谢产物的检测，进一步验证了与子痫前期患者血样标本存在良好的相关性。基于花生四烯酸代谢产物与子痫前期患者血样标本良好的相关性，本发明人认为花生四烯酸代谢产物可以作为一种检测子痫前期的标志物，通过对它的含量的定量测定，用于检测子痫前期。因此，本发明为子痫前期的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种以花生四烯酸代谢产物为指标，在制备子痫前期检测试剂盒中的应用。
技术背景
子痫前期(pre-eclampsia，PE)是人类妊娠期特有的一种疾病，其在孕妇中的发病率约为5％-8％，是导致孕产妇及围产儿发病及死亡的首要原因(Xu X,Zhang X A,Wang D W.The roles of CYP450 epoxygenases and metabolites,epoxyeicosatrienoic acids,in cardiovascular and malignant diseases[J].Advanced drug delivery reviews,2011,63(8):597-609.)。
研究表明，早期预防性用药可有效降低子痫前期患者的病变损伤、减少患者医疗保健费用及改善产后发生心血管疾病的风险具有重要意义。因此，寻求一种有效的预测指标对子痫前期高风险人群来说显得尤为重要。
近十年，随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学等方法学的发展，一批源于胎盘或母体，反映胎盘功能状态或母体血管系统功能的标志物相继发现。这些标志物主要分为血管生成/抗血管生成因子、胎盘源性蛋白、游离胎儿血红蛋白(HbF)、游离核酸/脱氧核酸、肾功能标志物等几大类(Zhang J H,Pearson T,Matharoo-Ball B,et al.Quantitative profiling of epoxyeicosatrienoic,hydroxyeicosatetraenoic,anddihydroxyeicosatetraenoic acids in human intrauterine tissues using liquidchromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Analyticalbiochemistry,2007,365(1):40-51.)。但上述标志物对子痫前期特异性较低、缺乏大规模临床统计数据等弊端，还不足以用于预测及诊断子痫前期。因此，研究有效预测子痫前期的标志物已成为该领域的当务之急。而花生四烯酸代谢物在血管生长、功能调节等方面作用的发现，可能为子痫前期发病机制及其预测提供新线索。
游离花生四烯酸由磷脂酶A2水解膜磷脂生成。花生四烯酸经三种途径代谢(Dhanasekaran A,Al-Saghir R,Lopez B,et al.Protective effects of epoxyeicosatrienoicacids on human endothelial cells from the pulmonary and coronary vasculature[J].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2006,291(2):H517-H31.)，包括环氧酶(cyclooxygenases，COXs)途径的前列腺素类分子(PGE2/PGI2/TXA2)，脂氧合酶(lipoxygenases，LOs)途径的白三烯类(leukotrienes，LTs)(LTB4/LTC4/LTD4/LTE4)、脂氧素类以及羟基二十碳四烯酸类(hydroxyeicosatetraenoic acids，HETEs)(8-HETE/12-HETE/15-HETE),细胞色素P450单氧合酶途径(cytochrome P450monooxygenases，CYPs)的环氧二十碳三烯酸类(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)(5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET)以及w-末端羟基二十碳四烯酸类(16-，17-,18-，19-，20-HETE)。
花生四烯酸代谢产物是一类经典的脂类炎症因子，负责增强血管通透性，诱导炎症细胞聚集，活化血小板等，参与血管炎症的调控。近年，国外学者发现子痫前期患者胎盘中5-，12-，15-HETE的含量明显升高，子痫前期患者在2/3孕程及产后的血浆中5,6-、14,15-EET比正常孕妇明显增多，细胞色素P450在子痫前期患者胎盘及蜕膜中表达明显上调(Larsen B T,Miura H,Hatoum O A,et al.Epoxyeicosatrienoic anddihydroxyeicosatrienoic acids dilate human coronary arterioles via BKCa channels:implications for soluble epoxide hydrolase inhibition[J].American Journal ofPhysiology-Heart and Circulatory Physiology,2006,290(2):H491-H9.)。研究还发现子痫前期患者脐动脉环内15-HETE含量显著高于正常孕妇，通过增加脐动脉平滑肌细胞内钙离子浓度，引起脐动脉收缩增强(Wang H,Lin L,Jiang J,et al.Up-regulation ofendothelial nitric-oxide synthase by endothelium-derived hyperpolarizing factor involvesmitogen-activated protein kinase and protein kinase C signaling pathways[J].Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,2003,307(2):753-64.)。本课题的前期研究也发现发现20-HETE可抑制绒毛外滋养母细胞的迁移能力，抑制子宫平滑肌细胞的凋亡，强烈抑制绒毛外滋养母细胞诱导的平滑肌细胞凋亡(Cheng J,Garcia V,DingY,et al.Induction of Angiotensin-Converting Enzyme and Activation of theRenin–Angiotensin System Contribute to 20-Hydroxyeicosatetraenoic Acid–MediatedEndothelial Dysfunction[J].Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology,2012,32(8):1917-24.)。故发明人认为花生四烯酸代谢产物可能参与子痫前期的发生发展。
申请号为2010080063774.9，公开号为CN102893156A的中国专利申请子痫前期风险的检测公开了一种测定5-羟色氨酸、单糖、癸酰基肉碱、甲基戊二酸和/或已二酸、油酸、二十二碳六烯酸和/或二十二碳三炔酸、γ-丁内酯和/或二氢-3(2H)-呋喃酮、2-氧代戊酸和/或氧代甲基丁酸、乙酰乙酸、六癸烯酰基-二十碳四烯基-sn-甘油、1-磷酸-鞘氨醇、1-磷酸-二氢鞘氨醇、和维他命D3衍生物中的一种或多种物质用于早期预测子痫前期的方法。该方法没有公开孕中期到子痫前期发病前这段时间上述标志物的变化情况，并没有比较子痫前期轻度与重度间以及子痫前期发病前后上述标志物(OR标志物)的变化。该申请涉及的具体实施步骤中，对照组部分仅设了正常妊娠的，而没有未孕妇女组。
申请号为200880018924.7，公开号为CN101680884A的中国专利申请检测先兆子痫的方法公开了12种源自胎盘的蛋白与子痫前期相关，其中9种在孕28周以前与子痫前期相关，而另外三种在28周之后与子痫前期相关。该申请没有公开血清学标志物与子痫前期的相关性，也没有公开子痫前期的严重程度及子痫前期发病前后与上述12种生物标志物的关系。该申请没有解决这些胎盘源性的生物标志物是否在血液中也存在差别，其次该申请只检测了收缩压在160mmHg以上或舒张压在110mmHg以上的子痫前期患者与上述12种生物标志物的关系。
发明内容
本发明的目的在于提供花生四烯酸代谢产物的新用途。
本发明利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱，建立了花生四烯酸代谢产物快速检测方法，寻找到与子痫前期患者血样标本存在良好的相关性的具体的花生四烯酸代谢产物。
本发明通过对49份子痫前期患者血清样本中花生四烯酸代谢产物的检测，进一步验证了与子痫前期患者血样标本存在良好的相关性。
基于花生四烯酸代谢产物与子痫前期患者血样标本良好的相关性，本发明人认为花生四烯酸代谢产物可以作为一种检测子痫前期的标志物，通过对它的含量的定量测定，用于检测子痫前期。
本发明的第一方面，提供了花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途。
本发明第二方面，还提供了花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用。
上述花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，是以常规的方法检测血清样本中的花生四烯酸代谢产物，建立检测花生四烯酸代谢产物定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。
上述花生四烯酸代谢产物是指11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE和LTB4中的一种或两种；11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE和LTB4分别为11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-epoxyeicosatrienoic acid)、5-羟基二十碳四烯酸(5-hydroxyeicosatetraenoic acid)、8-羟基二十碳四烯酸(8-hydroxyeicosatetraenoic acid)、12-羟基二十碳四烯酸(12-hydroxyeicosatetraenoicacid)、15-羟基二十碳四烯酸(15-hydroxyeicosatetraenoic acid)、白三烯B4(LeukotrieneB4)。
上述花生四烯酸代谢产物特指11,12-EET和12-HETE的组合，或15-HETE和LTB4的组合；
上述花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途或在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用中，花生四烯酸代谢产物常规检测方法为超高液相色谱串联质谱法或液相色谱串联质谱法。
上述花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途或在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用中，花生四烯酸代谢产物检测方法为超高液相色谱串联质谱法，花生四烯酸代谢产物均在ESI-模式下检测。ACQUITY UPLC色谱条件如下：流动相为0.1％甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)，梯度洗脱程序为0-2min A相从70％→30％，2-5min A相从70％→0％，5-6min A相维持在0％，6-8min A相从0→80％；色谱分析柱采用CORTERS UPLC(C181.6μm，2.1*100mm)，可在4分钟内完成19种代谢物的检测。本次实验中超高压液相色谱仪所用的色谱柱CORTERS UPLC(C181.6μm，2.1*100mm)，是waters最新开发的色谱柱，填充物为三键键合的实心核颗粒，其粒径更小，具有更高的柱效，更加适合小分子物质的分析，并且该色谱柱能够耐受更高的压力，能够有效缩短保留时间。Xevo TQ-S质谱仪工作条件如下：离子化模式(ion mode)为电喷雾负离子模式(ESI-)，毛细管电压(Capillary)为2.5KV，源温度(Source Temperature)为150℃，雾化气温度(Desolvation Temperature)为550℃，雾化气流速(Desolvation Gas Flow)为800L/h，锥孔气流速(Cone Gas Flow)为150L/h。
上述花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途或在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用中，血清样本的前处理方法选择用Oasis HLB μElution96孔板的固相萃取法。
上述Oasis HLB μElution96孔固相萃取法用于待测花生四烯酸代谢产物生物样本的前处理，该方法的详细步骤如下：1.活化：分别用200μl甲醇活化2次(OasisHLB μElution96孔板用甲醇活化，每孔分别加入200μl，待孔中的甲醇滴尽，再分别向每孔加入200μl甲醇，共加两次)；2.平衡：分别用200μl超纯水平衡3次(OasisHLB μElution96孔板用超纯水平衡，每孔分别加入200μl超纯水，待孔中的水滴尽，再分别向每孔加入200μl超纯水，共加三次)3.上样：700μl酸化样品上样；4.第一次清洗：200μl体积浓度5％的氨水溶液清洗；5.第二次清洗：200μl体积比甲醇/水＝70/30的溶液清洗；6.洗脱：将含体积浓度2％甲酸的乙腈溶液：异丙醇溶液的体积比为65/35的混合溶液50μl分两次洗脱。洗脱后再用50μl水稀释后上机(参见Oasis HLB μElution96孔板说明书，Oasis HLB μElution96孔板购自美国waters公司，具体型号如下：Oasis HLB96-well μElution Plate,2mg Sorbent per Well,30μmParticleSize,1/pk)。
其中在活化前样品需要酸化，步骤如下：400μl血清样品+400μl4％磷酸水溶液+10μl内标溶液，涡旋混匀。
上述花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途或在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用中，所述建立检测花生四烯酸代谢产物定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒，具体是指首先体外检测血清样本中花生四烯酸代谢产物的含量，其次是子痫前期组与正常对照组血清中花生四烯酸代谢产物的含量比较，判断子痫前期组血清样本中花生四烯酸代谢产物含量是否与正常样本中花生四烯酸代谢产物的含量存在差异。
本发明第三方面，还提供了花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期重度临床诊断试剂盒中的应用。
子痫前期重度的定义为：子痫前期患者出现下述任一不良情况可诊断为子痫前期重度:①血压持续升高:收缩压≥160mmHg和(或)舒张压≥110mmHg；②蛋白尿≥2.0g/24小时或随机蛋白尿≥(++)；③血小板<100×10∧9/L；④微血管病性溶血(LDH升高)；⑤血清转氨酶水平升高—ALT或AS；⑥持续头痛或其他大脑或视觉障碍；⑦持续上腹部疼痛。
上述花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期重度临床诊断试剂盒中的应用中，其中花生四烯酸代谢产物是指5-HETE、15-HETE和LTB4。
上述花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期重度临床诊断试剂盒中的应用中，其中花生四烯酸代谢产物5-HETE、15-HETE和LTB4的检测方法为超高液相色谱串联质谱方法，样品前处理方法同上。
本发明第四方面，还提供了花生四烯酸代谢产物在筛选治疗子痫前期药物中的应用。
所述的花生四烯酸代谢产物在筛选治疗子痫前期药物中的应用，具体是指将待选药物用于子痫前期患者，检测花生四烯酸代谢产物的含量是否下降。
因此，本发明的这一发现将为子痫前期的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
附图说明
图1花生四烯酸19种代谢产物及5种内标色谱图
图2花生四烯酸各代谢途径的代谢产物与子痫前期的关系。A:DHETs,B:EETs,C:HETEs,D:LTs,E:TXB2,F:20-HETE。注：子痫前期组血清EETs、HETEs、LTs和TXB2均显著高于正常孕妇组及正常未孕组；子痫前期组及正常孕妇组血清DHETs显著高于正常未孕组，子痫前期组血清20-HETE显著高于未孕组，而子痫前期组与正常孕妇组及正常孕妇组未孕组无显著差异。
图3血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期的关系。A:8,9-EET，B:11,12-EET，C:5-HETE，D:8-HETE，F:12-HETE，G:LTB4。注：子痫前期组8,9-HETE、11,12-HETE、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4显著高于正常孕妇组及正常未孕组。
图4血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期严重程度的关系。A:5-HETE,B:15-HETE,C:LTB4。注：子痫前期重度组血清5-HETE、15-HETE以及LTB4均显著高于子痫前期轻度组、正常孕妇组以及正常未孕组。
图5血清花生四烯酸与子痫前期发病前的关系。A:EETs，B:HETEs，C:LTs，D:11,12-EET，E:5-HETE，F:8-HETE，G:12-HETE，H:15-HETE，I:LTB4。注：子痫前期发病前血清EETs、HETEs、LTs、11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4均显著高于正常孕妇组与正常未孕组。
图6血清花生四烯酸与子痫前期发病后的关系。A:EETs，B:HETEs，C:LTs，D:8,9-EET，E:11,12-EET，F:5-HETE，G:8-HETE，H:12-HETE，I:15-HETE，J:LTB4。注：子痫前期发病前血清EETs、HETEs、LTs、8,9-EET、11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4均显著高于正常孕妇组与正常未孕组。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1、花生四烯酸代谢产物检测方法的建立
1.仪器：超高压液相色谱串联质谱ACQUITY UPLC Xevo TQ MS(美国，waters公司)，CORTERS UPLC(C181.6μm，2.1*100mm)色谱分析柱(美国，waters公司)，ACQUITY UPLC BEH(C181.7μm,2.1*50mm)色谱分析柱(美国，waters公司)，超纯水制备机(美国，Millipore公司)，负离子模式电喷雾电离源(ESI-)，MassLynx及Intellistart自动MRM法优化，MassLynx4.1工作站(美国，waters公司)，氮气发生器(英国，PEAK公司)，涡旋仪(美国，Scientific Industries公司)，单通道微量移液器(德国，Eppendorf公司)。
2.试剂与材料：19种花生四烯酸代谢产物标准品(美国，cayman公司)：5,6-DHET(≥98％),8,9-DHET(≥98％),11,12-DHET(≥98％),14,15-DHET(≥98％),5,6-EET,8,9-EET(≥98％),11,12-EET(≥95％),14,15-EET(≥98％),5-HETE(≥98％),8-HETE(≥98％),12-HETE(≥98％),15-HETE(≥98％),20-HETE(≥98％),6-KETO-PGF1α(≥98％),TXB2(≥99％),LTB4(≥97％),LTC4(≥97％),LTD4(≥97％),LTE4(≥97％)。
5种内标(美国，cayman公司)：D11-11,12-EET,D11-14,15-DHET,D8-15-HETE,D4-LTB4,D4-PGE2。D4-PGE作为TXB2、6-KETO-PGF1α的内标，D4-LTB4作为LTB4、LTC4、LTD4、LTE4的内标，D11-11,12-EET作为5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET的内标，D11-14,15-DHET作为5,6-DHET、8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET的内标，D8-15-HETE作为5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、20-HETE的内标。
HPLC级甲醇(美国，sigma)，HPLC级乙腈(美国，sigma)，HPLC级甲酸(美国，sigma)，超纯水。2ml EP管(德国，Eppendorf公司)，移液器枪头(德国，Eppendorf公司)。
3.配制标准品及内标的stock溶液：将19种100μg/ml的花生四烯酸代谢产物标准品原液：5,6-DHET、8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET、5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、20-HETE、6-KETO-PGF1α、TXB2、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4，5种100μg/ml的内标原液：D4-PGE、D4-LTB4、D8-15-HETE、D11-11,12-EET、D11-14,15-DHET分别配成1μg/ml的储存液(stock液)保存于-80℃冰箱备用。
4.标准品及内标的质谱条件：将19种配置好的1μg/ml花生代谢产物标准品stock液及5种1μg/ml的内标stock液通过自动进样器吸入质谱，单次进样体积为5μl。经过优化，本次实验Xevo TQ-S质谱仪工作条件如下：离子化模式(ion mode)为电喷雾负离子模式(ESI-)，毛细管电压(Capillary)为2.5KV，源温度(Source Temperature)为150℃，雾化气温度(Desolvation Temperature)为550℃，雾化气流速(DesolvationGas Flow)为800L/h，锥孔气流速(Cone Gas Flow)为150L/h，19种花生四烯酸代谢产物及5种内标的质谱参数见表1。
表1 花生四烯酸19种代谢产物和5种内标的色谱及质谱参数
5.液相色谱条件：流动相为0.1％甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)，梯度洗脱程序为0-2min A相从70％→30％，2-5min A相从70％→0％，5-6min A相维持在0％，6-8minA相从0→80％。色谱分析柱采用CORTERS UPLC(C181.6μm，2.1*100mm)，可在4分钟内完成19种代谢物的检测。在此条件下，19种花生四烯酸代谢产物及5种内标的色谱图见图1。
6.标准曲线及最低定量限：在质谱及液相色谱优化的条件下，将1μg/ml的19种花生四烯酸代谢产物及5种内标stock液用甲醇配成20、50、100、500、1000、2000pg/ml的混标工作液，内标溶液的浓度：D4-PGE、D4-LTB4、D11-11,12-EET、D11-14,15-DHET均为100ng/ml，D8-15-HETE为2μg/ml。根据检测结果，以标准品的峰面积为横坐标(X轴)，标准品的浓度为纵坐标(Y轴)，取有效的点进行线性拟合，以此确定目标化合物的线性范围。方法的最低定量限是通过声噪比来计算的，S/N＝10。花生四烯酸19种代谢产物的线性范围、相关系数以及最低定量限见表2。
表2 花生四烯酸代谢产物19种代谢产物的线性范围、相关系数及最低定量限
实施例2、建立血清花生四烯酸代谢产物的萃取方法
以下实验用到的空白血清是自己制作的，制作方法如下：收集健康妇女的血清，按0.1g/ml比例用活性炭处理血清，磁力搅拌过夜，然后将处理过的血清36000rpm超速离心1h，如此重复2次，最后获得的血清用超纯水稀释至原来体积，-20℃储存备用。以下实验中4％磷酸水溶液(美国，sigma)，内标溶液溶液分五种类型：D11-11,12-EET,D11-14,15-DHET,D8-15-HETE,D4-LTB4,D4-PGE2，都是购自美国，cayman公司，Oasis HLB μElution 96孔板是购自美国waters公司。)
血清样本的前处理方法如下：
1.标准曲线及质控：本部分实验，5-HETE、12-HETE、TXB2标准曲线的线性范围是：0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、150ng/ml，其质控的线性范围是：2.5ng/ml、25ng/ml、120ng/ml。其余16种花生四烯酸代谢产物的标准曲线及质控相应缩小十倍，分别为0.05ng/ml、0.125ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、15ng/ml和0.25ng/ml、2.5ng/ml、12ng/ml。
2.配制20×甲醇基质标准曲线的stock液：用甲醇将100μg/ml的19种花生四烯酸代谢产物原液配制成标准曲线及质控线性范围的20倍stock液。
3.血清样品准备：380μl空白血清+20μl 20×甲醇基质标准曲线stock液+400μl 4％磷酸水溶液+10μl内标溶液。内标溶液的浓度如下：D4-PGE、D4-LTB4、D11-11,12-EET、D11-14,15-DHET均为100ng/ml，D8-15-HETE为2μg/ml。
4.固相萃取洗脱条件：参考Oasis HLB μElution96孔板的说明书，结合花生四烯酸代谢产物的特性，建立了花生四烯酸代谢产物的固相萃取洗脱条件，过程如下。1.活化：分别用200μl甲醇活化2次(Oasis HLB μElution96孔板用甲醇活化，每孔分别加入200μl，待孔中的甲醇滴尽，再分别向每孔加入200μl甲醇，共加两次)；2.平衡：分别用200μl超纯水平衡3次(Oasis HLB μElution96孔板用超纯水平衡，每孔分别加入200μl超纯水，待孔中的水滴尽，再分别向每孔加入200μl超纯水，共加三次)；3.上样：700μl酸化样品上样；4.第一次清洗：200μl体积浓度为5％氨水溶液清洗；5.第二次清洗：200μl甲醇/水＝70/30溶液清洗；6.洗脱：50μl含体积浓度为2％甲酸的乙腈/异丙醇＝65/35的混合溶液分两次洗脱。洗脱后再用50μl水稀释后上机。
利用Oasis HLB μElution96孔固相萃取板对血清中花生四烯酸19种代谢产物的精密度及加标回收率请见表1.(为了考察Oasis HLB μElution96孔板固相萃取方法的可靠性，利用空白血清配制的高、中、低三个花生四烯酸19种代谢物的质控，5-HETE、12-HETE、TXB2的浓度为2.5、25、120ng/ml，其余16种代谢物的浓度为0.25、2.5、12ng/ml。在超高液相色谱串联质谱仪最佳条件下测定各代谢产物，每个样品平行测定8次，计算精密度及加标回收率。如表3可看出，平均加标回收率为65.4％-128％，相对标准偏差为0.81％-17.2％，均在可接受范围，表明利用Oasis HLB μElution96孔板作固相萃取时具有一定的稳定性。)
表3 花生四烯酸19种代谢产物的精密度及加标回收率
表3主要是用来反映Oasis HLB μElution96孔板对花生四烯酸代谢产物的提取效率。Rec.％表示加标回收率，是指将花生四烯酸代谢产物的标准品加入到不含花生四烯酸代谢产物的空白血清中，然后计算标准品测量值与加样浓度的比值。RSD％表示相对标准偏差，本次测试，RSD％是8次测定结果的标准差与算数平均值的比值，用于表示Oasis HLB μElution96孔板对血清花生四烯酸代谢产物萃取的稳定性。通过计算回收率与精密度，可以看到，利用Oasis HLB μElution96孔板萃取空白血清中的花生四烯酸代谢产物，其平均加标回收率为65.4％-128％，相对标准偏差为0.81％-17.2％，能够满足本实验的需要。
实施例3、血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期的关系研究
1.仪器：超高压液相色谱串联质谱ACQUITY UPLC Xevo TQ MS(美国，waters公司)，CORTERS UPLC(C181.6μm，2.1*100mm)色谱分析柱(美国，waters公司)，ACQUITY UPLC BEH(C181.7μm,2.1*50mm)色谱分析柱(美国，waters公司)，超纯水制备机(美国，Millipore公司)，负离子模式电喷雾电离源(ESI-)，MassLynx及Intellistart自动MRM法优化，MassLynx4.1工作站(美国，waters公司)，氮气发生器(英国，PEAK公司)，涡旋仪(美国，Scientific Industries公司)，单通道微量移液器(德国，Eppendorf公司)。
2.试剂与材料：19种花生四烯酸代谢产物标准品(美国，cayman公司)：5,6-DHET(≥98％),8,9-DHET(≥98％),11,12-DHET(≥98％),14,15-DHET(≥98％),5,6-EET,8,9-EET(≥98％),11,12-EET(≥95％),14,15-EET(≥98％),5-HETE(≥98％),8-HETE(≥98％),12-HETE(≥98％),15-HETE(≥98％),20-HETE(≥98％),6-KETO-PGF1α(≥98％),TXB2(≥99％),LTB4(≥97％),LTC4(≥97％),LTD4(≥97％),LTE4(≥97％)。5种内标(美国，cayman公司)：D11-11,12-EET,D11-14,15-DHET,D8-15-HETE,D4-LTB4,D4-PGE2。HPLC级甲醇(美国，sigma)，HPLC级乙腈(美国，sigma)，HPLC级甲酸(美国，sigma)，超纯水。2ml EP管(德国，Eppendorf公司)，移液器枪头(德国，Eppendorf公司)，15ml离心管(丹麦，NUNC公司)，Oasis HLB μElution96孔板(美国，waters公司)。
3.实验分组：子痫前期重度患者31份血清标本，其中发病前血清标本18份(孕23-36周)，子痫前期发病后血清标本13份(孕30-41周)。子痫前期轻度患者18份血清标本，其中发病前血清标本8份(孕14-35周)，发病后血清标本10份(孕31-39)。同时筛选出孕周、年龄及BMI与子痫前期轻度及重度患者发病前标本相配的正常孕妇血清标本13人份，孕周及年龄与子痫前期轻度及重度患者发病后标本相配的正常孕妇血清标本13人份，年龄及BMI与子痫前期及正常孕妇组匹配的正常未孕妇女血清标本14人份。
上述实验分组中子痫前期诊断标准为：参考《妇产科学》，人民卫生出版社、2008年第一版。子痫前期轻度：妊娠20周后出现收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24小时或随机尿蛋白≥(+)；子痫前期重度：子痫前期患者出现下述任一不良情况可诊断为子痫前期重度:①血压持续升高:收缩压≥160mmHg和(或)舒张压≥110mmHg；②蛋白尿≥2.0g/24小时或随机蛋白尿≥(++)；③血小板<100×10∧9/L；④微血管病性溶血(LDH升高)；⑤血清转氨酶水平升高—ALT或AS；⑥持续头痛或其他大脑或视觉障碍；⑦持续上腹部疼痛。实验组临床资料如下：
子痫前期组的收缩压、舒张压及身体质量指数(BMI)显著高于正常孕妇组及正常未孕妇女组，而正常孕妇组与正常未孕妇女组间无显著差别。子痫前期患者、正常孕妇及年龄匹配的正常未孕妇女的临床资料如表4：
表4 实验组的临床资料
注：1.年龄及孕周的数据以中位数(最小值，最大值)表示；2.收缩压、舒张压及BMI的数据以mean±SEM表示，“*”表示差异具有统计学意义(P<0.05)。
4.标准曲线：本部分实验，5-HETE、12-HETE、TXB2三种代谢物的标准曲线线性范围设置为：0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、150ng/ml，其他16种代谢物的标曲线性范围相应缩小10倍：0.05ng/ml、0.125ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、15ng/ml。标曲的配置方法为：先配制20×甲醇基质标准曲线stock液，待分析时用空白血清相应稀释20倍。
5.统计方法：统计软件为SPSS20.0，作图软件为Graphpad prism5.0。数据以中位数(最小值，最大值)或平均数±标准误(mean±SEM)表示。对于符合正态分布且方差齐性的数据采用单因素方差分析；对于方差不齐的多个独立样本数据采用Kruskal-Wallis H检验，两独立样本采用Mann-Whitney U检验。多个样本均数间的两两比较采用SNK-q检验，多个独立样本间两两比较采用Nemenyi检验。以P<0.05表示统计具有显著性差异。
6.花生四烯酸代谢产物检测方法：参考实施例1。
7.血清样本的萃取：参考实施例2
8.标准曲线线性范围：利用超高液相色谱串联质谱检测了血清19种花生四烯酸代谢产物的标样，结果显示，除11,12-DHET、5,6-EET、8,9-EET、20-HETE及LTC4五种代谢产物的定量下限略高于标样浓度(0.125-0.25ng/ml)，其他代谢产物的定量下线均可达0.05ng/ml，能够满足分析的需要。血清19种花生四烯酸代谢产物的线性范围如表5。
表5 血清19种花生四烯酸代谢产物的线性范围
9.花生四烯酸各代谢途径的产物与子痫前期的关系
分析花生四烯酸各代谢途径的产物与子痫前期的关系有助于了解花生四烯酸各代谢途径在子痫前期中的代谢活动。本研究涉及的19种代谢产物与花生四烯酸代谢途径的关系如下：细胞色素P450(CYP)中的CYP2家族的产物是EETs，EETs经可溶性环氧化物水解酶代谢生成DHETs，CYP4家族的产物是20-HETE；脂氧合酶途径(LOX)的代谢产物包括HETEs(5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE)和白三烯类(LTs)；环氧合酶途径的产物有6-KETO-PGF1α和TXB2。具体结果见表6和图2。发现：①三个实验组血清中的花生四烯酸代谢产物都以HETEs的浓度最高，见表6所示；②子痫前期组及正常孕妇组血清DHETs显著高于正常未孕妇组，而子痫前期组与正常孕妇组间无显著区别，如图2-A所示；③子痫前期组血清EETs、HETEs、LTs、TXB2均显著高于正常孕妇组及正常未孕组，正常孕妇组与正常未组女间无显著差异，如图2-B、C、D、E所示。④子痫前期组血清20-HETE只在子痫前期组与正常未孕组间有显著差异，而子痫前期组与正常孕妇组以及正常孕妇组与正常未孕组间都无显著差异，如图2-F所示。
表6 花生四烯酸各代谢途径的代谢产物与子痫前期的关系
注：数据均以中位数(最小值，最大值)表示，P<0.05表示有统计学意义。子痫前期组血清EETs、HETEs、LTs和TXB2均显著高于正常孕妇组及正常未孕组；子痫前期组及正常孕妇组血清DHETs显著高于正常未孕组；子痫前期组血清20-HETE显著高于未孕组，而子痫前期组与正常孕妇组及正常孕妇组未孕组无显著差异。
10.血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期的关系
进一步分析花生四烯酸各代谢途径中单个花生四烯酸代谢产物与子痫前期的关系。具体结果见表7和图3。发现：①子痫前期组、正常孕妇组、正常未孕组血清中DHETs以5,6-DHETEs为主，EETs以11,12-EET为主，HETEs以5-HETE和12-HETE为主，LTs以LTB4为主，如表7所示；②子痫前期组及正常孕妇组血清5,6-DHET显著高于正常未孕组，子痫前期组与正常孕妇组血清11,12-DHET、14,15-DHET显著低于正常未孕组，而8,9-DHET只在正常孕妇组与正常未孕组间有显著差异，如表4所示；③子痫前期组血清8,9-HETE、11,12-HETE显著高于正常孕妇组及正常为孕组，正常孕妇组与未孕组间无显著差异(如图3-A、B)，14,15-EET在各实验组间无显著差异；④子痫前期组血清5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4显著高于正常孕妇组及正常未孕组，正常孕妇组及未孕组间无显著差异(如图3-C、D、E、F、G)，LTC4在各实验组间无显著差异；⑤TXB2及20-HETE的统计结果已描述。
表7 血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期的关系
注：数据均以中位数(最小值，最大值)表示，P<0.05表示有统计学意义。子痫前期组及正常孕妇组5,6-DHET显著高于正常未孕组；子痫前期组和正常孕妇组11,12-DHET、14,15-DHET显著低于正常未孕组；子痫前期组8,9-HETE、11,12-HETE、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4显著高于正常孕妇组及正常未孕组。
11.血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期严重程度的关系
通过比较子痫前期重度组、轻度患者组、正常孕妇组、正常未孕妇女组间血清花生四烯酸代谢产物，分析花生四烯酸代谢产物与子痫前期严重程度的关系。具体结果见表8和图4。发现：①血清DHETs、EETs、HETEs、LTs在子痫前期重度组与子痫前期轻度组间无显著差异,如表8所示；②子痫前期重度组血清5-HETE、15-HETE以及LTB4均显著高于子痫前期轻度组、正常孕妇组以及正常未孕组，子痫前期轻度组与正常孕妇组及正常未孕组间无显著区别，如图4-A、B、C所示；③剩余的花生四烯酸代谢产物子痫前期重度组与子痫前期轻度组间无显著差别。
表8 血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期严重程度的关系
注：数据均以中位数(最小值，最大值)表示，P<0.05表示有统计学意义。“*”表示子痫前期重度组血清花生四烯酸代谢产物显著高于子痫前期轻度组。
12.血清花生四烯酸与子痫前期发病前的关系
比较子痫前期发病前组(孕14-36周)、正常孕妇组(孕24-36周)、正常未孕妇女组血清花生四烯酸代谢产物。具体结果见表9和图5。发现：①子痫前期发病前组以及正常孕妇组血清DHETs显著高于正常未孕组，而子痫前期发病前组与正常孕妇组间无显著区别，如表9所示；②子痫前期发病前组血清EETs、HETEs、LTs均显著高于正常孕妇组及正常未孕组，正常孕妇组与正常未孕组间无显著差异，如图5-A、B、C所示；③子痫前期发病前组血清11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4均显著高于正常孕妇组以及正常未孕组，而正常孕妇组及正常未孕组间这六种代谢产物均无显著差异，如图5-D、E、F、G、H、I所示；④子痫前期发病前组以及正常孕妇组血清5,6-DHET显著高于正常未孕组，而子痫前期发病前组以及正常孕妇组血清11,12-DHET、14,15-DHET则显著低于正常未孕组，如表6所示；⑤子痫前期发病前组血清20-HETE及TXB2都显著高于正常未孕组，而子痫前期发病前组与正常孕妇组以及正常孕妇组与正常未孕组都无显著差异，如表6所示。
表9 血清花生四烯酸与子痫前期发病前的关系
注：数据均以中位数(最小值，最大值)表示，P<0.05表示有统计学意义。“*”表示子痫前期发病前组血清花生四烯酸代谢产物显著高于正常孕妇组与正常未孕组。
13.血清花生四烯酸与子痫前期发病后的关系
比较子痫前期发病后组(孕30-41周)、正常孕妇组(孕26-39周)、正常未孕组血清花生四烯酸代谢产物。具体结果见表10和图6。发现：①子痫前期发病后组以及正常孕妇组血清DHETs显著高于正常未孕组，而子痫前期发病后组与正常孕妇组间无显著区别，如表10所示；②子痫前期发病后组血清EETs、HETEs、LTs均显著高于正常孕妇组及正常未孕组，正常孕妇组与正常未孕组间无显著差异，如图6-A、B、C；③子痫前期发病后组血清8,9-EET、11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4均显著高于正常孕妇组以及正常未孕组，而正常孕妇组及正常未孕组间这六种代谢产物均无显著差异，如图6-D、E、F、G、H、I、J；④子痫前期发病后组以及正常孕妇组血清5,6-DHET、8,9-DHET显著高于正常未孕组，而子痫前期发病后组以及正常孕妇组血清11,12-DHET、14,15-DHET则显著低于正常未孕组，如表7所示；⑤子痫前期发病后组血清20-HETE及TXB2都显著高于正常未孕组，而子痫前期发病前组与正常孕妇组以及正常孕妇组与正常未孕组都无显著差异，如表7所示。
表10 血清花生四烯酸与子痫前期发病后的关系
注：数据均以中位数(最小值，最大值)表示，P<0.05表示有统计学意义。“*”表示子痫前期发病后组血清花生四烯酸代谢产物显著高于正常孕妇组与正常未孕组。
本研究利用超高液相色谱串联质谱检测了子痫前期患者血清19种花生四烯酸代谢产物，并分析了血清花生四烯酸代谢产物与子痫前期严重程度以及病情进展的关系。本研究尚属首次较系统的分析了花生四烯酸三种代谢途径的产物与子痫前期的关系。结果发现：
①血清花生四烯酸代谢产物以HETEs的浓度最高，在各同系物中，DHETs以5,6-DHET为主，EETs以11,12-EET为主，HETEs以5-HETE和12-HETE为主，LTs以LTB4为主。
②血清HETEs、EETs、LTs以及TXB2在子痫前期中显著升高。
③血清8,9-EET、11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4在子痫前期患者中显著升高，其中11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4在子痫前期发病前后均显著升高，5-HETE、15-HETE、LTB4还与子痫前期严重程度相关。
首次发现8-HETE在子痫前期患者中显著升高，而5-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4连同8-HETE属首次发现在子痫前期患者血清中升高。
综合本研究结果，得出如下结论：
11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE、LTB4及其对应的代谢酶可能在子痫前期的发生发展中具有重要作用，有望为子痫前期的病因学研究提供新的线索。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (16)
1.花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途。
2.根据权利要求1所述的花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途，其特征在于花生四烯酸代谢产物是指11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE和LTB4中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的花生四烯酸代谢产物作为检测子痫前期标志物的用途，其特征在于花生四烯酸代谢产物是指11,12-EET和12-HETE的组合，或15-HETE和LTB4的组合。
4.花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：上述花生四烯酸代谢产物是指11,12-EET、5-HETE、8-HETE、12-HETE、15-HETE和LTB4中的一种或两种。
6.根据权利要求4所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：以常规的方法检测血清样本中的花生四烯酸代谢产物，建立检测花生四烯酸代谢产物定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。
7.根据权利要求4所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述花生四烯酸代谢产物指11,12-EET和12-HETE的组合，或15-HETE和LTB4的组合。
8.根据权利要求6所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述花生四烯酸代谢产物常规检测方法为超高液相色谱串联质谱法或液相色谱串联质谱法。
9.根据权利要求6所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述花生四烯酸代谢产物检测方法为超高液相色谱串联质谱法，色谱分析柱采用CORTERS UPLC，C18 1.6μm，2.1*100mm，花生四烯酸代谢产物均在ESI-模式下检测；ACQUITY UPLC色谱条件如下：流动A相为0.1％甲酸水溶液和B相为乙腈，梯度洗脱程序为0-2min A相从70％→30％，2-5min A相从70％→0％，5-6min A相维持在0％，6-8min A相从0→80％；Xevo TQ-S质谱仪工作条件如下：离子化模式为电喷雾负离子模式ESI-，毛细管电压为2.5KV，源温度为150℃，雾化气温度为550℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h。
10.根据权利要求6所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的 应用，其特征在于：所述血清样本的前处理方法选择用Oasis HLBμElution 96孔板的固相萃取法。
11.根据权利要求10所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述Oasis HLBμElution 96孔固相萃取法用于待测花生四烯酸代谢产物生物样本的前处理，该方法的详细步骤如下：A.活化：分别用200μl甲醇活化2次：Oasis HLBμElution 96孔板用甲醇活化，每孔分别加入200μl，待孔中的甲醇滴尽，再分别向每孔加入200μl甲醇，共加两次；B.平衡：分别用200μl超纯水平衡3次：Oasis HLBμElution 96孔板用超纯水平衡，每孔分别加入200μl超纯水，待孔中的水滴尽，再分别向每孔加入200μl超纯水，共加三次；C.上样：700μl酸化样品上样；D.第一次清洗：200μl体积浓度5％的氨水溶液清洗；E.第二次清洗：200μl体积比甲醇/水＝70/30的溶液清洗；F.洗脱：将含体积浓度2％甲酸的乙腈溶液：异丙醇溶液的体积比为65/35的混合溶液50μl分两次洗脱；洗脱后再用50μl水稀释后上机；其中在活化前，样品需要酸化，步骤如下：400μl血清样品+400μl4％磷酸水溶液+10μl内标溶液，涡旋混匀。
12.根据权利要求6所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述建立检测花生四烯酸代谢产物定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒，具体是指首先体外检测血清样本中花生四烯酸代谢产物的含量，其次是子痫前期组与正常对照组血清中花生四烯酸代谢产物的含量比较，判断子痫前期组血清样本中花生四烯酸代谢产物含量是否与正常样本中花生四烯酸代谢产物的含量存在差异。
13.花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期重度临床诊断试剂盒中的应用。
14.根据权利要求13所述的花生四烯酸代谢产物在制备子痫前期重度临床诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述花生四烯酸代谢产物是指5-HETE、15-HETE和LTB4。
15.花生四烯酸代谢产物在筛选治疗子痫前期药物中的应用。
16.根据权利要求15所述的花生四烯酸代谢产物在筛选治疗子痫前期药物中的应用，其特征在于：具体是指将待选药物用于子痫前期患者，检测花生四烯酸代谢产物的含量是否下降。
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| CN104316609B (zh) | 2016-09-07 |
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