CN112105931A - 用代谢生物标记物和蛋白质生物标记物预测子痫前期早产的方法 - Google Patents

用代谢生物标记物和蛋白质生物标记物预测子痫前期早产的方法 Download PDF

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Abstract

一种早期预测孕妇的妊娠结果的风险的计算机实施方法，包括以下步骤：将选自表1的一组多种子痫前期特异性生物标记物的值输入到计算模型，所述特异性生物标记物包括至少一种代谢物和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子，其中所述值从妊娠早期的孕妇获得；基于选自早产子痫前期、足月子痫前期和所有的子痫前期的所选妊娠结果，选择输入值的子集，所述输入值包括至少一种代谢物的值和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子的值；基于输入值的子集，计算所选的妊娠结果的预测风险；和输出孕妇的妊娠结果的预测风险。

Description

用代谢生物标记物和蛋白质生物标记物预测子痫前期早产的 方法
技术领域
本发明涉及预测孕妇子痫前期的方法。进一步设想了在妊娠早期预测孕妇早产子痫前期和足月子痫前期的方法。
背景技术
子痫前期(PE)是特定于妊娠的紊乱，发生率占所有妊娠的2-8％[1]。PE起源于胎盘，妊娠20周后表现为新发高血压和蛋白尿[2]。PE一直是导致孕期和围产期发病率和死亡率的主要原因。每年，有70,000的母亲和500,000的婴儿死于PE的直接影响[3]。PE的孕期并发症包括脑血管意外、肝破裂、肺水肿或急性肾功能衰竭。对于胎儿来说，胎盘功能不全会导致胎儿生长受限，这与新生儿发病率和死亡率的增加有关。迄今为止，PE的唯一治疗方法是胎盘分娩，从而分娩婴儿。因此，医源性早产增加了新生儿发病率和死亡率的负担。PE对患者健康的影响不仅限于围产期。受影响的母亲终生患心血管疾病、中风和2型糖尿病的风险升高。PE导致的早产儿可能存在神经认知发育问题，从轻度学习困难到严重残疾。从长远来看，妊娠带有PE的幼儿，表现出血压和BMI升高，发生糖尿病、肥胖、高血压和心脏病的发病率增加[4-6]。
尽管目前尚无现成的治疗方法能治愈子痫前期，但仍有一些药物治疗，即阿司匹林和二甲双胍(及其他药物)，有可能预防某些子痫前期病例的发展[7,8]。但是，在人群层面上，要使这些带有治疗药物的预防性干预措施影响子痫前期的发病率卫生保健提供者需要具有风险分层工具或测试，该工具结合了以下两个属性：识别妊娠早期患疾病风险升高的那些孕妇，然后将这些孕妇分流到适当的治疗方法中。这些要求遵循预防原则，即不得伤害孕妇及其未出生的孩子。为了防止某些孕妇的子痫前期，对所有孕妇进行全面给药可能会给那些最初没有风险的人带来不必要的健康风险(例如，由于治疗副作用)。
关于子痫前期病因的当代假说表明，PE本质上是综合症，子痫前期可能是一种以上的疾病[9]。在此假设框架中，能够准确评估妊娠早期(任何临床症状出现前的几个月)，哪些孕妇发展为子痫前期的风险增加(或高)，哪些孕妇发展为子痫前期风险降低(或低)，将取决于子痫前期是一种多种病的假设。然而，目前尚无方法明确描述子痫前期的不同子类型或/和描述有子痫前期风险的特定子人群(或其任何亚型)。
有趣的是，最近的研究表明，预防子痫前期的预防性治疗，可能与特定形式的子痫前期或特定的妊娠子人群有关，从而证实了子痫前期存在不同亚型的概念。在这种情况下，最近已证实阿司匹林可以预防子痫前期，这种子痫前期以胎盘受损为特征，并与子痫前期的早期表现，即早产子痫前期有关[10]。
在确定早产子痫前期风险升高的妊娠的情况下，已提出了一种多变量预后模型，该模型可在第一三个月末期/第二三个月初期，将多达10％的妊娠人群分为高风险组，然后使用阿司匹林治疗该高风险人群，以预防某些早期发作和早产子痫前期的情况[11]。在这种情况下，风险算法将孕期史(参见，子痫前期历史)和特征(参见，种族、体重指数(BMI))、生物物理发现(参见，血压读数和指示胎盘灌注受损的超声测量值)、生化因子(妊娠相关血浆蛋白A(基因：PAPPA)和胎盘生长因子(基因：PIGF))结合起来。尽管该参考测试具有一定的实用性，但由于其性能高度依赖于超声测量，因此其在临床实践中的全球采用中受到阻碍，这需要熟练且经过专门认证的超声检查师才能使用先进的超声技术进行专业的超声测量[也参见EP2245180B1]。此外，这种参考的预后模型的很大一部分性能来自于病史和先前的妊娠信息的可用性；后者损害了其准确预测首次妊娠妇女风险的有效性，与经产妇女相比，首次妊娠妇女是风险更高的子人群。
读者很容易理解，(早产)子痫前期风险的预后模型不依赖于子宫动脉搏动指数(PI)或妊娠史信息，而仅使用易于获取的生物统计学变量(例如血压、bmi、年龄等)，再加上从孕妇获得的生物样本中存在的，可以在全球临床实验室中确定的一组生化指标，将有助于在世界范围内促进此类预后测试。此外，申请人意识到，如本申请中所公开的，对于(早产/足月)子痫前期的预后变量组合的健康影响，如将这些预后测试与适当的预防性治疗方案相结合，将对孕妇及其子女的(未来)健康产生影响，就像上述阿司匹林对早产子痫前期的干预一样。
提供一种在妊娠人群中确定(早产/足月)子痫前期风险人群的检测方法，也将有助于测试其他预防子痫前期的干预措施的有效性。除了阿司匹林外，也可以考虑以下项的治疗效果：二甲双胍、低分子量肝素[12]、降低血糖指数的益生菌[13]、瓜氨酸[14]或抗氧化剂，包括但不限于，抗氧化剂维生素(例如抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素)[15]、无机抗氧化剂(例如硒)和植物衍生的多酚，和/或针对线粒体的抗氧化剂[25]，包括但不限于，Mito VitE和麦角硫氨酸[16,17]；他汀类药物，包括但不限于普伐他汀(Pravastin)[18]；抗高血压疗法(使用β受体阻滞剂；血管扩张剂，包括但不限于H2S[19]或NO供体，如西地那非(Sildenafil)或其他[20]；DOPA脱羧酶抑制剂)或抗炎疗法，包括但不限于地高辛抗体(Digibind)[21]；或抗氧化应激损伤的因子，包括但不限于(a1-微球蛋白)[22]。另外，人们可以容易地想到优选的治疗组合，例如但不限于阿司匹林和/或线粒体抗氧化剂。
本发明的目的是克服上述问题中的至少一个。
发明内容
本发明解决了对子痫前期(PE)的预测性测试的需求，在孕妇妊娠早期，PE的临床症状出现之前对孕妇采用该预测性测试，以根据妊娠的结果(PE、早产PE或足月PE)，可选地，根据风险类别(升高的风险或降低的风险)对孕妇进行分层。这些方法采用了患者特异性变量，其通常选自PE-特异性代谢物和可选的是蛋白质和临床风险因子(例如血压、体重、吸烟状况、妊娠次数等)，单独或组合采用变量对所选妊娠结果的风险(和可选地是风险类别)进行分类(表1)。在相关方面，发明人还识别了纳入(rule-in)生物标记物，其可以用来产生纳入预后信号(表明子痫前期风险升高的信号)和/或排除(rule-out)生物标记物，其用来产生排除信号(表明子痫前期风险降低的信号)。通过至少一个以上的纳入信号或至少一个以上的排除信号、可选地两者、可选地按顺序、可选地一系列纳入或排除预后信号的使用，可以将患者分层为增加的风险类别或降低风险类别，其比已知方法具有更高的准确性。
预后信号(纳入或排除)可以是单变量(即由单种变量，例如一种蛋白质或一种代谢物组成)、或者多变量(即由一种或多种蛋白质和/或一种或多种代谢物组成)。当预后信号是单变量时，检测受试者(在临床风险因子变量的情况下)或生物样品(在蛋白质或代谢物变量的情况下)中预后信号的存在通常涉及将该变量水平与该变量所定义的阈值水平进行比较，确定测试水平是高于或者低于阈值水平。所定义的阈值水平是预先确定的(例如，基于研究人群和预定义的纳入(或排除)测试要求)，可能因此根据子痫前期的类型和与预测性测试的期望严谨性，所定义的阈值水平在每次的测试中会有所不同。当预后信号是包括两种或多种变量(例如一种代谢物和一种蛋白质，或两种代谢物，或一种临床风险因素和一种代谢物)的多变量信号时，确定受试者中预后信号的存在通常涉及将这些变量的水平输入到统计模型中以分数的形式提供输出，将该分数与多变量预后信号所定义的阈值分数(或参考分数范围)进行比较，确定该测试分数是否高于或低于阈值分数。所定义的阈值分数可能是基于研究人群和预定义的纳入(或排除)测试要求预先确定的，可能因此根据子痫前期的类型和与预测性测试的期望严谨性，所定义的阈值水平在每次的测试中会有所不同。
在第一方面，本发明提供了一种早期预测孕妇(即在妊娠的8-22周)的妊娠结果的风险的系统和计算机实施方法。该方法通常包括以下步骤：
输入计算模型，
通常选自表1的一组子痫前期特异性生物标记物的值，其包括至少一种代谢物和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子，其中该值从妊娠早期的孕妇身上获得，
其中计算模型被配置为：
基于一般选自早产子痫前期、足月子痫前期和所有的子痫前期的妊娠结果，选择输入值的子集，所述输入值包括至少一种代谢物的值和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子的值；
基于输入值的子集，计算所选的妊娠结果的预测风险；和
输出孕妇的妊娠结果的预测风险。
表1
Figure BDA0002716241410000041
Figure BDA0002716241410000051
在一个实施方案中，妊娠结果选自早产子痫前期和足月子痫前期。
在一个实施方案中，计算模型被配置为：
基于选自早产子痫前期、足月子痫前期和所有的子痫前期的第二妊娠结果，选择输入值的第二子集，其包括至少一种代谢物的值和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子的值；
基于输入值的第二子集，计算第二妊娠结果的预测风险；和
输出孕妇的第二妊娠结果的预测风险。
在一个实施方案中，该方法包括将所选的妊娠结果输入到计算模型中的步骤，在这种情况下，计算模型被配置为基于输入的妊娠结果，选择输入值的子集。在一些实施方案中，其中计算模型被配置为选择对应于不同妊娠结果的输入值的两个子集，该方法可以包括将两个不同的所选结果(即，足月子痫前期和早产子痫前期)输入到计算模型中的步骤。在一个实施方案中，如果基于输入值的第一子集计算的预测风险是不确定的(例如，并非早产子痫前期风险的升高或降低)，则计算模型可以被配置为基于输入值的第二子集，选择根据第二妊娠的结果，计算第二妊娠结果的预测风险(例如，检测足月子痫前期风险的升高或降低)。
对于代谢物和蛋白质值，该值是从生物样品处获得的丰度值，例如在妊娠早期，从孕妇体内获得的血液。
在一个实施方案中，子痫前期特异性生物标记物的组包括表1中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或基本上所有生物标记物。
在一个实施方案中，子痫前期特异性生物标记物的组包括PIGF和DLG。在一个实施方案中，子痫前期特异性生物标记物的组包括PIGF和DLG以及一种或多种代谢物生物标记物(例如1、2、3、4、5或6)，代谢物生物标记物选自1-HD、L-ISO、NGM、2HBA、DC和CL。在一个实施方案中，子痫前期特异性生物标记物的组包括PIGF、DLG和1-HD和可选的一种或多种代谢物生物标记物(例如1、2、3、4、5或6)，代谢物生物标记物选自1-HD、L-ISO、NGM、2HBA、DC和CL。在一个实施方案中，子痫前期特异性生物标记物的组基本上包括所有的PIGF、DLG、1-HD、L-ISO、NGM、2HBA、DC和CL。
在一个实施方案中，所述或每个所选值的子集由单个代谢物生物标记物的值组成，其中计算步骤包括将单个代谢物生物标记物的丰度值与相同代谢物生物标记物的参考丰度值进行比较。
在一个实施方案中，单个代谢物生物标记物选自DLG、1-HD、L-ISO、NGM、2HBA、DC和CL。
在一个实施方案中，所选妊娠结果是早产PE，单个生物标记物选自DLG、NGM、2HBA和CL。
在一个实施方案中，所选妊娠结果是足月PE，单个生物标记物选自1-HD、L-ISO和DC。
在一个实施方案中，所选妊娠结果是所有的PE，单个生物标记物选自DLG和1-HD。
在一个实施方案中，所述或每个所选值的子集包括选自表1的多种生物标记物的值。一般地，计算步骤包括以下步骤：
将所述或每个所选值的子集输入到特定于所选的妊娠结果的风险分数计算中，以计算妊娠结果的风险分数；和
将计算出的风险分数与至少一个参考风险分数进行比较，以为孕妇提供妊娠结果的预测风险。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是早产PE，其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自DLG、1-HD、L-ISO、L-LEU、NGM、SC、L-ERG、2-HBA、ECG、20-CL、CR、PIGF和s-ENG。在一个实施方案中，所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自DLG、1-HD、NGM、SC、2-HBA、ECG、20-CL、PIGF和s-ENG。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是足月PE，其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、CR、HL-ARG和TR。在一个实施方案中，所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU和H-L-ARG。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是所有的PE，其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、WRV、fh_pet、DLG、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、EPA、L-MET、ADMA、PIGF和s-ENG。在一个实施方案中，所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、WRV、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、CR、EPA、PIGF和s-ENG。
在一个实施方案中，该方法包括向计算模型中输入一组子痫前期特异性生物标记物的值的步骤，所述子痫前期特异性生物标记物包括一种或多种如本发明所述的纳入和/或排除的生物标记物，其一般选自表1。
在一个实施方案中，由计算模型所选的所述或每个输入值的子集包括至少一种纳入生物标记物(即表1中的一种或多种纳入生物标记物)，其中计算模型被配置为基于输入值的子集，来检测所选的妊娠结果的升高的风险。
在一个实施方案中，由计算模型所选的所述或输入值的子集包括至少一种排除生物标记物(即表1中的一种或多种排除生物标记物)，其中计算模型被配置为基于输入值的子集，来检测所选的妊娠结果的降低的风险。
在一个实施方案中，该方法包括向计算模型中输入风险类别的附加步骤，风险类别选自升高的风险和降低的风险，其中基于所选的妊娠结果和所选的风险类别，由计算模型所选的所述或每个输入值的子集包括(a)输入值的纳入子集，其包括一种或多种纳入生物标记物的值，和/或(b)输入值的排除子集，其包括一种或多种排除生物标记物的值。
在一个实施方案中，输入到计算模型中的风险类别是升高的风险，其中计算模型被配置为：
基于所选的妊娠结果，选择输入值的排除子集，其包括一种或多种排除生物标记物的值；
基于输入值的排除子集，确定所选的妊娠结果是否是降低的风险；
如果未确定所选的妊娠结果是降低的风险，则基于所选的妊娠结果，选择输入值的纳入子集，其包括一种或多种纳入生物标记物的值；
基于输入值的纳入子集，确定所选的妊娠结果是否是升高的风险；
输出孕妇的妊娠结果的预测风险。
在一个实施方案中，输入到计算模型中的风险类别是降低的风险，并且其中计算模型被配置为：
基于所选的妊娠结果，选择输入值的纳入子集，其包括一种或多种纳入生物标记物的值；
基于输入值的纳入子集，通过确定所选的妊娠结果是否是升高的风险，来计算预测风险；
如果未确定所选的妊娠结果是升高的风险，则基于所选的妊娠结果，选择输入值的排除子集，其包括一种或多种排除生物标记物的值；
基于输入值的排除子集，通过确定所选的妊娠结果是否是降低的风险，来计算预测风险；以及
输出孕妇的妊娠结果的预测风险。
在一个实施方案中，一种或多种纳入生物标记物包括DLG，其中一种或多种排除生物标记物包括PIGF。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是早产子痫前期，其中一种或多种纳入生物标记物选自DLG、SC、L-ERG、ECG、20-CL、PIGF和s-ENG。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是足月子痫前期，其中一种或多种纳入生物标记物选自bp、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、CR和TR。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是所有的子痫前期，并且其中一种或多种纳入生物标记物选自bp、fh_pet、DLG、HVD3、CR、L-MET、ADMA和PIGF。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是早产子痫前期，其中一种或多种排除生物标记物选自DLG、1-HD、NGM、SC、L-ERG、CR和s-ENG。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是足月子痫前期，并且其中一种或多种排除生物标记物选自bp、1-HD和HVD3。
在一个实施方案中，所选的妊娠结果是所有的子痫前期，并且其中一种或多种排除生物标记物选自bp、1-HD、HVD3和s-ENG。
在一个实施方案中，如果基于输入值的纳入子集无法确定所选的妊娠结果是升高的风险，则计算模型被配置为基于所选的妊娠结果，选择第二输入值的纳入或排除子集。
在一个实施方案中，如果基于输入值的排除子集无法确定所选的妊娠结果是降低的风险，则计算模型被配置为基于所选的妊娠结果，选择第二输入值的纳入或排除子集。
在另一方面，本发明提供了一种预测孕妇早产子痫前期风险的方法，包括以下步骤：
(a)确定代谢物和蛋白质的变量组的水平，其包括DLG和选自PIGF和s-ENG的蛋白质，其中代谢物和蛋白质水平是从妊娠早期孕妇的生物样品中测得的；
(b)基于包括PIGF蛋白的变量组的第一子集的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第一纳入预后信号的存在；或者
(c)基于包括DLG或s-ENG的变量组的第二子集的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第一排除预后信号的存在；和
(d)基于纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算早产子痫前期的预测风险。
在一个实施方案中，该方法包括步骤(b)和步骤(c)。
在一个实施方案中，当检测到第一纳入预后信号，且未检测到第一排除预后信号时，则确定孕妇发生早产子痫前期的风险升高，或者
当检测到第一排除预后信号，未检测到第一纳入预后信号时，则确定孕妇发生早产子痫前期的风险降低。
在一个实施方案中，变量组包括DLG、PIGF、s-ENG、L-ERG和1-HD。
在一个实施方案中，变量组还包括L-LEU、L-ISO、2-HBA、ECG、SC、DC、CL和NGM中的至少五种。
在一个实施方案中，变量的第一子集包括PIGF，变量的第二子集包括DLG。
在一个实施方案中，变量的第一子集包括PIGF，变量的第二子集包括DLG，以及来自s-ENG、L-ERG、L-LEU、L-ISO或(L-ISO+L-LEU)中的任何两个。
在一个实施方案中，变量的第一子集和/或变量的第二子集各自包括多种变量，其包括至少一种代谢物和至少一种蛋白质。
在一个实施方案中，变量的第一子集包括DLG和PIGF，或DLG和s-ENG。
在一个实施方案中，变量的第一子集包括：
PIGF、s-ENG、DLG和2-HBA；
PIGF和DLG；
DLG和s-ENG；或
PIGF、s-ENG、DLG，以及ECG、L-ERG、SC、20-CL中的任何一种或两种。
在一个实施方案中，变量的第二子集包括DLG和s-ENG，或s-ENG和1-HD。
在一个实施方案中，变量的第二子集包括：
DLG和s-ENG；
s-ENG和1-HD；
s-ENG、DLG和1-HD；或
s-ENG、DLG，以及1-HD、CL、L-ERG、SC、NGM中的任何一种、两种或三种。
在一个实施方案中，当未检测到第一纳入预后信号的存在，且未检测到第一排除预后信号存在时，该方法包括以下附加步骤：根据变量组的第三或第四子集的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第二纳入或第二排除预后信号的存在；并根据第二纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算早产子痫前期的预测风险。
在一个实施方案中，当检测到第二排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生早产子痫前期的风险降低；或者当检测到第二纳入预后信号的存在时，则确定该孕妇发生早产子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，当未检测到第二排除预后信号的存在时，该方法包括以下附加步骤：根据变量的第五或第六子集的水平来提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第三纳入或第三排除预后信号的存在。
在一个实施方案中，当检测到第三排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险降低，或者其中当未检测到第三排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生早产子痫前期的风险升高。
在另一方面，本发明提供了预测孕妇足月子痫前期风险的方法，其包括以下步骤：
(a)确定代谢物变量组的水平，其包括HVD3或1-HD，其中代谢物水平从妊娠早期孕妇的生物样品中测得；
(b)基于(i)包括HVD3或1-HD的变量组的第一子集的水平，和(ii)从妊娠早期的孕妇获得的血压测量值提供分数，并将分数与阈值分数进行比较，以检测第一纳入预后信号的存在；或者
(c)基于(i)包括HVD3或1-HD的该组变量组的第二子集的水平，和(ii)从妊娠早期的孕妇获得的血压测量值提供分数，并将分数与阈值分数进行比较，以检测第一排除预后信号的存在；和
(d)基于纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算足月子痫前期的预测风险。
在一个实施方案中，该方法包括步骤(b)和步骤(c)。
在一个实施方案中，当检测到第一纳入预后信号，且未检测到第一排除预后信号时，则确定孕妇发生足月子痫前期的风险升高，或者
当检测到第一排除预后信号，且未检测到第一纳入预后信号时，则确定孕妇发生足月子痫前期的风险降低。
在一个实施方案中，代谢物变量组包括1-HD和HVD3。
在一个实施方案中，变量组还包括TR、L-LEU、L-ISO、CR、DHA、NGM和BV中的至少一种或多种。
在一个实施方案中，变量的第一子集和/或变量的第二子集，各自包括多种代谢物变量。
在一个实施方案中，变量的第一子集包括：
HVD3和(TR、1-HD或L-ISO或L-LEU)；
HVD3和(L-ISO或L-LEU)和(TR或CR)；
1-HD和(TR、L-ISO或DHA)；
1-HD、NGM和H-L-ARG或
HVD3、1-HD和(NGM，TR或BV)。
在一个实施方案中，变量的第二子集包括
HVD3和(TR、1-HD、WRV或H-L-ARG)；
1-HD和(CR或20-CL)；或者
HVD3、H-L-ARG和(CR或TR)。
在一个实施方案中，当未检测到第一纳入预后信号的存在，未检测到第一排除预后信号的存在时，该方法包括以下附加步骤：根据变量组的第三或第四子集的水平和可选的临床风险因子测量值提供分数，然后将分数与阈值分数进行比较，以检测第二纳入或第二排除预后信号的存在；基于第二纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算足月子痫前期的预测风险。
在一个实施方案中，当检测到第二排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生足月子痫前期的风险降低；或者当检测到第二纳入预后信号的存在时，就确定该孕妇发生足月子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，当未检测到第二排除预后信号的存在时，该方法包括以下附加步骤：基于变量组的第五或第六子集的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第三纳入或第三排除预后信号的存在。
在一个实施方案中，当检测到第三排除预后信号的存在时，确定孕妇发生足月子痫前期的风险降低，或者其中当未检测到第三排除预后信号的存在时，确定孕妇发生足月子痫前期的风险升高。
本发明的方法可以完全或部分地由计算机实施。
本发明还提供一种计算机程序，该计算机程序包括用于使计算机执行本发明的任何方法的程序指令。该计算机程序可以嵌入在记录介质、载波信号或只读存储器上。
在另一方面，本发明提供了一种预测孕妇子痫前期风险的方法，该方法包括以下步骤：
(a)确定一组变量的水平，所述变量选自一种或多种代谢物、蛋白质和临床风险因子，其中代谢物和蛋白质的水平从孕妇的血液样本中测得；
(b)基于一种或多种变量的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第一纳入或第一排除预后信号的存在；
(c1)当未检测到第一纳入预后信号的存在时，将另一种或多种变量的水平与阈值进行比较，建立该阈值是为了检测第一排除预后信号的存在；或者
(c2)当未检测到第一排除信号的存在时，将另一种或多种变量的水平与阈值进行比较，建立该阈值是为了检测第一纳入预后信号的存在；以及
(d)将纳入和排除预后信号的存在和不存在与子痫前期的风险相关联。
当纳入或排除信号是单变量信号时，通常地，步骤(b)包括将所确定的变量水平与变量的定义阈值水平进行比较，并确定测试水平是高于还是低于阈值水平。
当纳入或排除预后信号是多变量信号时，通常地，步骤(b)包括将所确定的变量水平输入至统计模型，该统计模型被配置为以分数形式提供输出，并将分数与多变量预后信号的阈值分数进行比较，确定测试分数是高于还是低于阈值分数。
在一个实施方案中，当检测到第一纳入预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高，或者当检测到第一排除预后信号的存在时，确定孕妇发生子痫前期的风险降低。
在一个实施方案中，当未检测到第一纳入预后信号的存在，且检测到第一排除预后信号的存在时，确定孕妇发生子痫前期的风险降低。
在一个实施方案中，当未检测到第一纳入预后信号的存在，且未检测到第一排除预后信号的存在时，该方法包括以下附加步骤：根据一种或多种变量的水平提供分数，并将分数与阈值分数进行比较，以检测第二排除预后信号或第二纳入预后信号的存在。与第一和第二步骤相比，附加步骤通常地采用不同的变量或变量的不同组合。
在一个实施方案中，当检测到上述第二排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险降低。
在一个实施方案中，当未检测到上述第二排除预后信号的存在时，该方法包括以下附加步骤：根据一种或多种变量的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第三排除预后信号的存在。与先前的比较步骤相比，附加步骤通常采用不同的变量或变量的不同组合。
在一个实施方案中，当检测到第三排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险降低，或者其中当未检测到第三排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，当未检测到第一排除预后信号的存在，且检测到第一纳入预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，当检测到第二纳入预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，当未检测到第一排除预后信号的存在，且未检测到第一纳入预后信号的存在时，该方法包括以下附加的步骤：根据一种或多种变量的水平提供分数，将该分数与阈值分数进行比较，以检测第二纳入预后信号或第二排除预后信号的存在。与先前的比较步骤相比，附加步骤通常采用不同的变量或变量的不同组合。
在一个实施方案中，当检测到第二纳入预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，当未检测到第一排除预后信号的存在，且未检测到第一纳入预后信号的存在，且未检测到第二纳入预后信号的存在时，该方法包括以下附加的步骤：根据一种或多种变量的水平提供分数，将该分数与阈值分数进行比较，以检测第三纳入预后信号的存在。与先前的比较步骤相比，附加步骤通常地采用不同的变量或变量的不同组合。
在一个实施方案中，当检测到第三纳入预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高，或者其中当未检测到第三纳入预后信号的情况下，确定孕妇发生子痫前期的风险降低。
在一个实施方案中，当检测到第二排除预后信号的存在时，确定孕妇发生子痫前期的风险降低。
在一个实施方案中，子痫前期是早产子痫前期。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号包括PIGF。
在一个实施方案中，第一排除预后信号包括-DLG。
在一个实施方案中，第二排除预后信号包括L-ERG、s-ENG、L-LEU、L-ISO或(L-ISO和L-LEU)。
在一个实施方案中，第一、第二和第三排除预后信号的组合选自包括以下项的组：
第一-DLG、第二-L-ERG和第三-s-ENG；
第一-DLG、第二-s-ENG和第三-1-HD；
第一-DLG、第二-L-LEU和第三-s-ENG；
第一-DLG、第二-s-ENG和第三-L-LEU；
第一-DLG、第二-L-ISO和第三-s-ENG；
第一-DLG、第二-(L-ISO+L-LEU)和第三-s-ENG；
第一-DLG、第二-L-ERG和第三-L-LEU；
第一-DLG、第二-L-ERG和第三-L-ISO；以及
第一-DLG、第二-L-ERG，第三-(L-ISO+L-LEU)。
在一个实施方案中，排除预后信号是包括s-ENG和DLG的多变量信号。
在一个实施方案中，排除预后信号是包括s-ENG和1-HD的多变量信号。
在一个实施方案中，排除预后信号是包括s-ENG DLG和1-HD的多变量信号。
在一个实施方案中，排除预后信号是包括s-ENG DLG以及1-HD、CL、L-ERG、SC、NGM中的任何一种、两种或三种的多变量信号。
在一个实施方案中，纳入预后信号是包括PIGF、s-ENG、DLG和2-HBA的多变量信号。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号是包括PIGF和DLG的多变量信号。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号是包括DLG和s-ENG的多变量信号。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号是多变量信号，所述变量包括PIGF、s-ENG、DLG以及ECG、L-ERG、SC、2-HBA中的任何一种或两种。
在一个实施方案中，当未检测到多变量排除预后信号的存在，且检测到多变量排除预后信号的存在时，确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号包括BP。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号是多变量信号，所述变量包括选自以下变量的组合：BP和(HVD3或1-HD)；BP、HVD3和(TR、1-HD或L-ISO或L-LEU)；BP、HVD3和(L-ISO或L-LEU)和(TR或CR)；BP、1-HD和(TR、L-ISO或DHA)；以及BP、HVD3、1-HD和(NGM，TR或BV)。
在一个实施方案中，第一排除预后信号包括BP。
在一个实施方案中，第一排除预后信号是多变量信号，所述变量包括选自以下项变量的组合：BP和(HVD3或1-HD)；BP、HVD3和(TR、1-HD或L-ISO)；BP、1-HD和(TR、L-ISO或DHA)；以及BP、HVD3、1-HD和(NGM、TR或BV)。
在一个实施方案中，排除预后信号是包括BP和1-HD的多变量信号，和/或纳入预后信号是包括BP和1-HD和NGM的多变量信号。
在一个实施方案中，当未检测到多变量排除预后信号的存在，并且检测到多变量纳入预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期和早产子痫前期(所有的子痫前期)。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号包括BP。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号是多变量信号，所述变量包括BP和选自包括以下变量组的一种或多种变量：PIGF、1-HD、HVD3、DLG、S-1-P、2-HBA、CR、ADMA、L-ERG、s-ENG、fh_pet、L-LEU、L-ISO、r_葡萄糖、HL-ARG和妊娠期(gest)。
在一个实施方案中，第一纳入预后信号是多变量信号，所述信号包括选自以下组合的变量的组合：BP和(PIGF或1-HD或HVD3)；BP、PIGF和(1-HD或DLG)；BP、1-HD和S-1-P；BP、HVD3和2-HBA；BP、HVD3、CR和ADMA；BP、HVD3、DLG、1-HD和L-ERG；BP、DLG和s-ENG；BP、DLG、PIGF和(fh_pet或L-ERG)；BP、DLG、s-ENG和L-ERG；BP、HVD3、1-HD和L-LEU；(PIGF或BP)、1-HD、s-ENG和L-ISO；BP、HVD3、2-HBA和(r_葡萄糖或H-L-ARG；以及BP、HVD3、fh_pet和妊娠期。
在一个实施方案中，第一排除预后信号包括BP。
在一个实施方案中，第一排除预后信号是多变量信号，包括BP和选自包括以下项的一种或多种变量：PIGF、1-HD、HVD3、DLG、S-1-P、ADMA、s-ENG、fh_pet、L-ARG、NGM、GG、20-CL和WRV。
在一个实施方案中，第一排除预后信号是多变量信号，其包括选自以下组合的变量的组合：BP和1-HD；BP和(1-HD或HVD3或DLG)；BP和1-HD和(HVD3或DLG或s-ENG；BP和1-HD和(ADMA，GG或sFlt1)；BP和HVD3和WRV；BP和S-1-P和fh_pet；BP和(WRV、L-ARG、sFlt1、NGM、PIGF、GG或20-CL)；以及BP和1-HD和HVD3和s-ENG。
在一个实施方案中，排除预后信号是包括BP和s-ENG以及1-HD的多变量信号。
在一个实施方案中，纳入预后信号是包括BP和PIGF以及DC的多变量信号。
在一个实施方案中，当未检测到多变量排除预后信号的存在，且检测到多变量纳入预后信号的存在时，则确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
在另一方面，本发明提供了一种预测孕妇子痫前期风险的方法，其包括以下步骤：
(i)确定变量组的水平，其选自一种或多种代谢物、蛋白质和临床风险因子，其中代谢物和蛋白质的水平从孕妇的血液样本中测得；
(ii)使用统计模型，根据一种或多种变量的水平提供分数，并将分数与阈值分数进行比较，以检测纳入或排除预后信号的存在(比较步骤)；和
(iii)将纳入和排除预后信号的存在或不存在与子痫前期的风险相关联。
在一个实施方案中，比较步骤包括将变量的水平输入至统计模型中，该统计模型被配置为输出变量组合的分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第一纳入或第一排除预后信号的存在。
在一个实施方案中，变量组的预后选择包括至少两种变量类中的至少一种变量，所述变量选自代谢物、蛋白质和临床风险因子。在一个实施方案中，对预后变量组的纳入或排除的选择，包括至少一种，优选地多种(即2、3、4或5)代谢物。在一个实施方案中，对预后变量组的纳入或排除的选择，包括至少一种代谢物和至少一种蛋白质。
在一个实施方案中，子痫前期是早产子痫前期，比较步骤(ii)被配置为检测纳入预后信号的存在，其中纳入预后信号包括预后变量组合，所述预后变量组合选自由以下项组成的组：PIGF+s-ENG；
PIGF+s-ENG+(DLG或ECG或L-ERG或20-CL)；PIGF+s-ENG+DLG；PIGF+s-ENG+ECG；PIGF+s-ENG+DLG+20-CL；PIGF+s-ENG+ECG+20-CL；和PIGF+s-ENG+DLG+(L-ERG或SC)。
在一个实施方案中，子痫前期是早产子痫前期，并且比较步骤(ii)被配置为检测排除预后信号的存在，其中所述排除预后信号包括预后变量组合，所述预后变量组合选自由以下项组成的组：
s-ENG+(DLG或1-HD)；s-ENG+DLG；s-ENG+DLG+(CL、1-HD、L-ERG、SC和NGM)的一个或两个；s-ENG+DLG+1-HD；以及s-ENG+DLG+随机葡萄糖。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期，并且比较步骤(ii)被配置为检测纳入预后信号的存在，其中纳入预后信号包括包括预后变量组合，所述预后变量组合选自由以下项组成的组：BP和(HVD3或1-HD)；BP和HVD3和(TR、1-HD或L-ISO)；BP和1-HD和(TR、L-ISO或DHA)；BP和HVD3以及1-HD和(NGM、TR或BV)。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期，并且比较步骤(ii)被配置为检测排除预后信号的存在，其中所述排除预后信号包括包括预后变量组合，所述预后变量组合选自由以下项组成的组：BP和(HVD3或1-HD)；以及BP和HVD3和1-HD。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期和早产子痫前期(所有的子痫前期)，并且比较步骤(ii)被配置为检测纳入预后信号的存在，其中纳入预后信号包括预后变量选择，其包括BP和一种或多种选自由以下项组成的组的变量：PIGF、1-HD、HVD3、DLG、S-1-P、2-HBA、CR、ADMA、L-ERG、s-ENG、fh_pet、L-LEU、L-ISO、r_葡萄糖、HL-ARG和妊娠期。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期和早产子痫前期(所有的子痫前期)，并且比较步骤(ii)被配置为检测纳入预后信号的存在，其中纳入预后信号包括预后变量组合，所述预后变量组合选自由以下项组成的组：BP和(PIGF或1-HD或HVD3)；BP、PIGF和(1-HD或DLG)；BP、1-HD和S-1-P；BP、HVD3和2-HBA；BP、HVD3、CR和ADMA；BP、HVD3、DLG、1-HD和L-ERG；BP、DLG和s-ENG；BP、DLG、PIGF和(fh_pet或L-ERG)；BP、DLG、s-ENG和L-ERG；BP、HVD3、1-HD和L-LEU；(PIGF或BP)、1-HD、s-ENG和L-ISO；BP、HVD3、2-HBA和(r_葡萄糖或H-L-ARG；以及BP、HVD3、fh_pet和妊娠期。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期和早产子痫前期(所有的子痫前期)，并且比较步骤(ii)被配置为检测排除预后信号的存在，其中所述排除预后信号包括预后变量选择，其包括BP和一种或多种选自包含以下项的组的变量：PIGF、1-HD、HVD3、DLG、S-1-P、ADMA、s-ENG、fh_pet、L-ARG、NGM、GG、20-CL和WRV。
在一个实施方案中，子痫前期是足月子痫前期和早产子痫前期(所有的子痫前期)，并且比较步骤(ii)被配置为检测排除预后信号的存在，其中所述排除预后信号包括预后变量组合，所述预后变量组合选自由以下项组成的组：BP和1-HD；BP和(1-HD或HVD3或DLG)；BP和1-HD和(HVD3或DLG或s-ENG；BP和1-HD和(ADMA，GG或sFlt1)；BP和HVD3和WRV；BP和S-1-P和fh_pet；BP和(WRV、L-ARG、sFlt1、NGM、PIGF、GG或20-CL)；以及BP和1-HD、HVD3和s-ENG。
概括和分析
在一个实施方案中，预测早产子痫前期、足月子痫前期或早产和足月子痫前期(所有的子痫前期)的概率至少为50％，假阳性率至多为20％。
在一个实施方案中，预测早产子痫前期、足月子痫前期或早产和足月子痫前期的概率为至少60％，假阳性率至多为20％。
在一个实施方案中，预测早产子痫前期、足月子痫前期或早产和足月子痫前期的概率为至少60％，假阳性率至多为20％。
在一个实施方案中，该生物样品是在子痫前期出现之前，例如在妊娠8-22周或11-18周时从孕妇身上获得的。
在一个实施方案中，该方法包括对来自孕妇身上的生物样品中的代谢物进行分析的步骤。在一个实施方案中，该方法包括对来自孕妇身上的生物样品中的表2的所有或基本上所有的代谢物进行分析的步骤。
在一个实施方案中，通过检测一种或多种变量的水平来确定该纳入预后信号或排除预后信号，将该水平与该变量或每种变量的阈值水平进行比较，并根据比较结果确定受试者是否表现出纳入或排除预后信号。
在一个实施方案中，比较步骤包括将变量的水平输入到统计模型中，该统计模型被配置为输出变量组合的分数，并将该分数与阈值水平进行比较。
在一个实施方案中，至少一个测定步骤包括借助于质谱法，更优选地液相色谱质谱法(LC-MS)来定量测定生物样品中的代谢物。
在一个实施方案中，质谱法包括代谢物的电离，优选地为电喷雾电离，以及电喷雾衍生的电离方法。也可以采用其他与LC-MS兼容的电离方法，例如连续流动快速原子轰击电离、大气压化学电离、大气压光电离。
当本发明的方法以如下方式使用时：将LC洗脱液分馏，以离散液滴的形式沉积在表面上，或在表面上追踪，以保持通过色谱法获得的空间分辨率，以用于以后的分析，串联质谱分析，也可以使用其他电离技术进行。其中，例如，电子电离、化学电离、场解吸电离、基质辅助激光解吸电离、表面增强激光解吸电离。
在一个实施方案中，质谱在阳极和阴极的喷雾电离下进行。
在一个实施方案中，质谱法采用选择性离子监测。
在一个实施方案中，质谱是串联质谱(MS/MS)。
在一个实施方案中，串联质谱法包括使离子化代谢物断裂的步骤。
在一个实施方案中，串联质谱采用多反应监测。
在一个实施方案中，本发明的方法包括质谱分析，其包括以下步骤中的一个或多个步骤：
使生物样品在适宜的条件下进行电离，以产生由代谢物衍生的带正电或带负电的代谢物离子，或代谢物加合物离子。这些离子是所谓的“前驱体离子”。
使用第一质量分析器(过滤器)，根据前驱体离子与其他离子背景的质荷比(m/z)进行区分；
通过与诸如氮气或氩气的碰撞气体碰撞，将预选的“前驱体离子”破碎成特定的碎片离子，即所谓的“产物离子”；
使用第二质量分析器(过滤器)根据产物离子的质量选择一种、一般为2种、或多种特定的产物离子，在质谱仪的离子检测器中确定一种或多种带电产物离子的量；
使用所确定的产物离子的量来确定样品中相应代谢物的量；
从而质谱仪被配置为电离多种不同的代谢物；产生多种不同的前驱体离子；使用第一质量分析器选择多个不同的前驱体离子中的任何一种；将多种前驱体离子中的任何一种分解为来自多种前驱体离子中的任何一种的产物离子；从多种前驱体离子中的任何一种中选择一种、一般为2种、或多个特定产物离子；确定从质谱仪离子检测器中的多种前驱体离子中的任何一种获得的一种或多种带电产物离子的量；使用来自多种前驱体离子中任何一种所确定的产物离子的量来确定样品中相应的多种不同代谢物的量。
在一个实施方案中，该方法包括用代谢物提取剂预处理生物样品，以提供预处理的样品的步骤。
在一个实施方案中，提取溶剂包括甲醇、异丙醇和乙酸盐缓冲剂。
在一个实施方案中，提取溶剂包括比例为约10:9:1(v/v/v)的甲醇、异丙醇和乙酸盐缓冲剂。
在一个实施方案中，提取溶剂包括0.01至0.1％的BHT(m/v)。
在一个实施方案中，在分离沉淀的蛋白质之前，将生物样品和提取溶剂的混合物在小于5℃的温度下孵育一段时间，以帮助蛋白质沉淀。
在一个实施方案中，生物样品是液体样品，其被收集并存储于吸收取样装置中，优选地，体积控制取样装置。
在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
通过第一形式的液相色谱法(例如反相液相色谱法(RPLC))分离样品的第一等份，以提供包含第一类分解代谢物(例如疏水性代谢物)的第一洗脱液；以及
通过第二种形式的液相色谱法(例如HILIC)分离样品的第二等份，以提供包括第二类分解代谢物(例如亲水性代谢物)的第二洗脱液；以及
可选地，使用以多反应监测模式操作的靶向电喷雾串联质谱法来测定第一和第二洗脱液。
在一个实施方案中，RPLC采用包括水、甲醇和乙酸盐缓冲剂的第一流动相A，和包括甲醇、乙腈、异丙醇和乙酸盐缓冲剂的第二流动相B的变化的混合物。
在一个实施方案中，RPLC流动相根据流动相B的变化的体积梯度，约1-20％(优选地约10％)至80-100％(优选地约100％)，在例如1-20分钟或大约8-12分钟，优选地约10分钟期间内混合。变化的体积梯度可以是线性梯度或逐步梯度。
在一个实施方案中，HILIC采用包括甲酸铵的第一流动相A，和包括乙腈的第二流动相B的变化的混合物。
在一个实施方案中，HILIC流动相根据流动相B的变化的体积梯度，约80-100％(优选地约10％)至40-60％(优选地约50％)，在约8-12分钟的，优选地约10分钟的期间内混合。变化的体积梯度可以是线性梯度或逐步梯度。
在一个实施方案中，生物样品包括至少一种对应于代谢物的稳定同位素标记的内标(SIL-IS)。
质谱兼容的缓冲液列表请见https://www.nestgrp.com/protocols/trng/buffer.shtml。
在一个实施方案中，生物样品包括对应于多种代谢物的稳定的同位素标记的内标(SIL-IS)。
在另一方面，本发明涉及一种检测或预测孕妇早产子痫前期风险的方法，该方法包括以下步骤：
(a)分析从孕妇身上获得的生物样品，以测量包括DLG在内的变量组的水平；
(b)将变量组的测量水平与组中的所述或每种变量的参考水平进行比较；以及
(c)根据比较步骤(b)，检测或预测早产子痫前期的风险。
在一个实施方案中，变量组包括一种以上变量。
在一个实施方案中变量组包括一种或多种蛋白质，或一种或多种代谢物。
在一个实施方案中，比较步骤(b)包括将变量组合的水平输入至统计模型中，该统计模型被配置为提供输出分数，然后将输出分数与变量组合的参考分数进行比较。
在一个实施方案中，生物样品是在早产子痫前期的任何临床症状出现之前，例如在妊娠11-18周之前，从孕妇身上获得的。
本发明还涉及一种治疗孕妇的方法，该孕妇被确定为具有发展为早产PE、足月PE或所有的PE的风险，该方法包括对孕妇进行预防性治疗的步骤。在一个实施方案中，在PE的临床症状出现之前进行预防性治疗。
因此，本发明还涉及根据本发明的方法治疗预测有发展为早产PE、足月PE或所有的PE的风险的孕妇的方法，该方法包括对孕妇进行预防性治疗的步骤。
在一个实施方案中，预防性治疗在PE的临床症状出现之前进行，可选地，在妊娠期间继续进行。
在一个实施方案中，预防性治疗包括施用药剂，所述药剂选自由以下项组成的组：阿斯匹林；二甲双胍；低分子量肝素；降低血糖指数的益生菌；瓜氨酸或抗氧化剂；线粒体抗氧化剂；他汀类药物；抗高血压治疗；抗炎疗法；和氧化应激损伤抑制剂。
在一个实施方案中，子痫前期是早产子痫前期，其中预防性治疗包括将阿司匹林、二甲双胍或掺有二甲双胍的阿司匹林的药剂施用。
还提供了一种计算机程序，该计算机程序包括用于使计算机程序执行本发明的方法的程序指令，该方法可以嵌入在记录介质、载波信号或只读存储器上。还提供一种被配置为执行本发明的方法的计算机实施系统。参考附图描述的本发明的实施例，包括计算机设备和/或在计算机设备中执行的处理。但是，本发明还扩展到计算机程序，特别是存储在适于实施本发明的载体上或载体中的计算机程序。该程序可以是源代码、目标代码，或在源代码和目标代码之间的代码的形式，例如以部分地编译的形式，或适用于根据本发明的方法的任何其他实施方式。载体可以包括存储介质，诸如ROM(例如CD ROM)，或磁记录介质(例如软盘或硬盘)。载体可以是电或光信号，其可以经由电缆或光缆，或通过无线电或其他方式传输。
还提供一种被配置为执行本发明的方法的计算机实施系统。
在一个实施方案中，提供了一种用于预测孕妇子痫前期风险的计算机实施系统，该系统包括：
(a)用于确定变量组的水平的装置，其选自代谢物、蛋白质和临床风险因子，其中代谢物和蛋白质水平从孕妇的生物样品中测得；
(b)基于一种或多种变量的水平，用于提供分数，将该分数与阈值分数进行比较，以检测第一纳入或第一排除预后信号的存在的装置；
(c1)用于将变量组中的另一种变量的水平与该变量的阈值水平进行比较，以检测第一排除预后信号的存在的装置；或者
(c2)用于将变量组中的另一种变量的水平与该变量的阈值水平进行比较，以检测第一纳入预后信号的存在的装置；以及
(e)使纳入和排除预后信号的存在或不存在与子痫前期风险相关联的装置。
在一个实施方案中，提供了一种用来检测或预测孕妇早产子痫前期风险的计算机实施系统，该系统包括：
(a)用于分析从孕妇获得的生物样品，以确定包括DLG在内的变量组的水平的装置；
(b)将变量组的测量水平与组中的所述或每种变量的参考水平进行比较的装置；以及
(c)基于比较步骤(b)，检测或预测早产子痫前期风险的装置。
本发明的其他方面和优选的实施例，在下面列出的其他权利要求中定义和描述。
附图说明
图1实施例7A；依次应用排除分类器，然后是纳入分类器，以实现预设的PPV截止预后性能，以预测“所有的PE”。组A：在ROC空间中绘制PPV＝0.133截止值，对未来PE的患病率p＝0.05进行预测试。组B：步骤1；与统计模型M1相对应的所选排除分类器(bp+s-ENG+1-HD)的ROC曲线：0.292700587596098 log10[s-ENG(MoM)]+0.0103090246336299[第二_sbp]-0.335817558146904 log10[1-HD].；完整测试人群(P1)的分类是在10％的FNR阈值下完成的。这与统计模型M1的排除阈值分数小于(<)0.66643052785405相对应。此操作的结果是38.3％的真实阴性(未来非病例)分类为低风险，再加上10％的未来PE病例(假阴性)。这些个体从测试人群中删除。组C：步骤2；与统计模型M2相对应的实施例性纳入分类器(bp+PIGF+DC)的ROC曲线：-0.195394942337404 log10[PIGF(MoM)]+0.00590836118884227[map_第一]+0.143670336856774 log10[DC]和模型M2纳入阈值分数大于(>)0.581930006682247，作为在测试人群(P2)的剩余部分中应用的纳入分类器，实现了用于预测“所有的PE”的预设PPV性能。在步骤1排除分类之后，将来的“所有的PE”的患病率增加到p＝0.071，其导致PPV线的斜率发生变化，从而提高了预设PPV标准的敏感性(检测率)。
图2实施例7B；依次应用排除分类器，随后是纳入分类器，以实现预设的PPV截止预后性能，以预测“早产PE”。组A：在ROC空间中绘制的PPV＝0.071截止值，对未来PE的患病率p＝0.014进行预测试。组B：步骤1；与统计模型M1对应的所选排除分类器(s-ENG+DLGDLG)的ROC曲线：0.22139876465602 log10[s-ENG]+0.0162829949120052 log10[DLG]；完整测试人群(P1)的分类是在10％的FNR阈值下完成的。这与统计模型M1的排除阈值分数小于(<)0.710765699780132相对应。此操作的结果是43.7％的真实阴性(未来非病例)被分类为低风险，再加上10％的未来早产PE病例(假阴性)；这些个体从测试人群中移除。组C：步骤2；ROC曲线对应于具有统计模型M2的实施例性纳入分类器(PIGF+s-ENG+DLG+2-HBA)；0.20043337818718 log10[s-ENG(MoM)]-0.212088369466248 log10[PIGF_(MoM)]+0.112046727485729 log10[2-HBA]+0.227265325783904 log10[DLG]和模型M2纳入阈值分数大于(>)0.668333882056883，在剩余的测试总体(P2)中，作为纳入分类器，实现了用于预测“早产PE”的预设PPV性能。在步骤1排除分类之后，未来的“早产PE”的患病率增加到p＝0.023，其导致PPV线的斜率发生变化，从而提高了预设PPV标准的敏感性(检测率)。
图3实施例7C；依次应用纳入分类器，随后是排除分类器，以实现预设的PPV截止预后性能，以预测“足月PE”。组A：在ROC空间中绘制的PPV＝0.154的截止值，对未来PE的患病率p＝0.037进行预测试。组B：步骤1；与统计模型M1对应的所选排除分类器(bp+1-HD)的ROC曲线：0.0115467461789923[map_第一]-0.324977743714534 log10[1-HD]；完整测试人群(P1)的分类是在10％的FNR阈值下完成的。这与统计模型M1的排除阈值分数小于(<)0.680257687736226相对应。此操作的结果是38.2％的真实阴性(未来非病例)分类为低风险，再加上10％的未来足月PE病例(假阴性)；这些个体从测试人群中移除。组C：步骤2；ROC曲线对应于具有统计模型M2的实施例性纳入分类器(bp+1-HD+NGM)；0.0093936118486756[第二_sbp]+0.560572544580583 log10[NGM]-0.302082838614281 log10[1-HD]，模型M2纳入阈值分数是大于(>)0.581599411310977的。作为在剩余测试人群(P2)中应用的纳入分类器，实现了用于预测“足月PE”的预设PPV性能。遵循步骤1排除分类后，将来的早产PE的患病率将增加到p＝0.053，其导致PPV线的斜率发生变化，从而提高了预设PPV标准的敏感性(检测率)。
图4实施例8A；确定预测早产PE的最小预后标准。对于任何分类器，与区域“A”中的某个点相符的风险分数将满足最低纳入标准，而与区域“B”中的某个点相符的风险分数将满足最小排除标准。为了使分类器同时满足纳入和排除标准标准，其关联的ROC曲线(或成对的敏感性-特异性值)将在相交区域(A∩B)处有一点。
图5实施例8B的散点图，示出了取样时的PIGF水平vs递送时间。星号：早产PE。“条形”符号：足月PE。“圆圈”符号：无PE。区域“A”包含未来的早产PE病例，如图所示，其将由于单独的PIGF阈值的应用而错过。PIGF水平低于目标阈值的受试者被分类为“高风险”，因此PPV>＝0.071。PIGF水平高于目标阈值的受试者将被考虑作进一步分类(参见文本)。
图6实施例8C散点图，示出了研究受试者的变量PIGF和DLG取样时的生物标记物值。根据(未来)妊娠结果标记研究样本；即无PE或“早产”PE。区域“A”表示散点图中的大区域，没有(将来)早产PE病例。
图7实施例8D；使用PIGF水平作为纳入分类器对研究-Pop1进行细分。
图8实施例8E；通过应用基于PIGF的1步(纳入)分类实现的“总分类”。
图9实施例8F；使用DLG水平作为排除分类器对研究-Pop2进行细分。DLG含量低于目标阈值的受试者被分类为“低风险”，DLG含量高于目标阈值的受试者将被考虑作进一步分类(参见文本)。
图10实施例8G；通过应用涉及PIGF(纳入)和DLG(排除)的两步分类而实现的“总分类”，其中分别考虑纳入和排除分类器。还绘制了阴性分类(非纳入，非排除)。
图11实施例8H；使用L-ERG水平作为排除分类器，对研究-Pop3进行进一步细分。L-ERG水平低于目标阈值的受试者被分类为“低风险”，L-ERG水平高于目标阈值的受试者将被考虑作进一步分类(参见文本)。
图12实施例8I；通过应用涉及PIGF(纳入)、DLG(排除)和L-ERG(排除)的3步分类实现的“总分类”，其中，分别考虑纳入和排除的分类器。还绘制了阴性分类(非纳入，非排除x2)。
图13实施例8J；使用s-ENG作为排除分类器对研究-Pop4进行了进一步细分，从而创建了第3个排除人群(Pop-LR3)和剩余人群。s-ENG水平低于目标阈值的受试者被分类为“低风险”，s-ENG水平高于目标阈值的受试者将被考虑作进一步分类(参见文本)。
图14实施例8K；通过应用涉及PIGF(纳入)、DLG(排除)、I-ERG(排除)和s-ENG(排除)的3步分类而实现的“总分类”。A.分别考虑纳入分类器和排除分类器。还绘制了阴性分类(非纳入，非排除x3)。B.总分类器作为单一分类器，将任何受孕人群或孕妇分为发生早产PE的高风险组(具有的PPV>＝0.071)，或发生早产PE的低风险组(具有的NPV>＝0.9975)。
图15实施例8L；代替总分类器(如文本中所识别)也对早产PE表现出优异的预后性能。
图16实施例9A；示出了通过应用手性LC(下部示踪剂)，通过LC-MS/MS方法获得的与本申请中阐述的方法类似的二甘油酰甘油信号可以被分成3个亚种。通过与参考物质的比较，发现前两个信号与对映异构体1,2-/2,3-二亚油酰基-甘油对映体一致，而第三个信号与1,3-二亚油酰基-甘油对映体一致。
图17实施例9B：不同总的DLG和不同的DLG异构体之间，以及不同异构体之间的相关性。
图18实施例9C：箱形图，其总结了妊娠早期取样时“总二亚油酰基-甘油”和不同的二亚油酰基-甘油异构体的水平，其与孕妇在妊娠结束时所经历的妊娠结果有关。即“早产PE”：n＝17；“足月PE”：n＝42且“无PE”；n＝574。还给出了两组之间中位值差异的倍数变化。
具体实施方式
出于所有目的，本文中提及的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献，均通过引用其整体的方式并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请，均被明确地并单独地指出，通过引用的方式并入其全部内容一样。
定义和一般优选
在本文中使用的情况下，除非另有明确说明，否则以下术语除具有本领域可能享有的任何较宽(或较窄)含义外，还具有以下含义：
除非上下文另外要求，否则本文中的单数应理解为包括复数，反之亦然。关于实体中使用的术语“一(a)”或“一(an)”应理解为是指该实体中的一个或多个。这样，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个或多个”，以及“至少一个”，在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“包括(comprise)”或其变体，例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，应被理解为表示包括任何所述整体(integer)(例如特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)或整体组(例如特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)，但不排除任何其他整体或整体组。因此，如本文所使用的，术语“包括”是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未叙述的整体或方法/过程步骤。
如本文所用，术语“疾病”用于定义任何损害生理功能，并与特定症状相关的异常状况。该术语广泛地用于涵盖生理功能受损的任何紊乱、疾病(illness)、异常、病理、疾病，病症或综合症，而不论病因的性质如何(或实际上是否建立了该病的病因基础)。因此，它涵盖了由感染、创伤、伤害、手术、放射消融、中毒或营养缺乏引起的疾病。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指干预措施(例如，向受试者施用药剂)，其能够治愈、改善或减轻疾病症状，或消除(或减轻其影响)其原因(例如，降低溶酶体酶的病理学水平的积累)。在这种情况下，该术语与术语“治疗(therapy)”同义地使用。
另外，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指干预措施(例如，向受试者施用药剂)，其可以预防或延缓疾病的发作或发展，或减少(或根除)疾病在治疗人群中的发病率。在这种情况下，术语“治疗(treatment)”与术语“预防(prophylaxis)”同义使用。
如本文所用，药剂的有效量或治疗有效量定义为，可以给药于受试者而无过度的毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症的量，其具有合理的获益/风险比，但是该量足以提供所需效果，例如以受试者状况的永久性或暂时性地改善为特征的治疗或预防。根据个体的年龄和一般状况、给药方式和其他因素，该量因受试者而异。因此，尽管不可能指定确切的有效量，但是本领域技术人员将能够使用常规实验和背景常识，在任何情况下确定适当的“有效”量。在这种情况下的治疗结果，包括根除或减轻症状、减轻疼痛或不适、延长生存期、改善活动能力和其他临床改善标记物。治疗结果不必完全治愈。
在如上定义的治疗和有效量的上下文中，术语受试者(在上下文允许的情况下，应理解为包括“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”)定义为任何受试者，尤其是哺乳动物受试者，需要对其进行治疗。哺乳动物受试者包括但不限于人、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物，例如猿、猴子、猩猩和黑猩猩；狗和狼等犬科动物；猫、狮子、老虎等猫科动物；马、驴和斑马等家畜(equid)；食用动物，例如牛、猪和绵羊；有蹄类动物，例如鹿和长颈鹿；啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。在优选的实施例中，受试者是人类。
如本文所用，术语“子痫前期”或“PE”定义为妊娠20周后血压升高(≥140mmHg收缩压或≥90mmHg舒张压)加上蛋白尿(＞0.3g/24小时)后。该术语包括不同类型的PE，包括足月PE、早产PE和早发PE。术语“早产子痫前期”是指子痫前期的发生，其导致在妊娠37周之前分娩。术语“所有的子痫前期”指足月子痫前期和早产子痫前期。本发明的方法涉及孕妇的子痫前期的早期预测。但是，本发明的方法也可用于早期预测孕妇高血压疾病的风险，包括例如子痫、轻度子痫前期、慢性高血压、EPH妊娠、妊娠高血压、叠加子痫前期、HELLP综合征或肾病。此外，尽管参照妊娠的人类描述了本发明，但是本发明也适用于妊娠的高等哺乳动物。
如本文所用，术语“生物样品”(或测试样品或对照)可以是从受试者孕妇或胎儿身上获得的任何生物液体，包括血液、血清、血浆、唾液、羊水、脑脊髓液、乳头吸出液。理想地，生物样品是血清。当获得生物样品时，受试者可以实施禁食或非禁食。在一个优选的实施例中，生物样品是从测试孕妇身上获得的血液，或来自该血液。
如本文所用，术语“变量”是指血源性代谢物或蛋白质，或临床风险因子。术语“选自代谢物、蛋白质和临床风险因子的一组变量”，是指至少一种，一般地，多于一种选自代谢物、蛋白质和临床风险因子的变量。一般地，该组包括两种变量类别，例如代谢物和蛋白质，代谢物和临床风险因子，或蛋白质和临床风险因子。在一个实施方案中，所述组包括至少一种代谢物、蛋白质和临床风险因子。一般地，该组包括多种代谢物。
如本文所用，术语“蛋白质”是指血源性蛋白质，其水平可以可选地与其他变量结合使用，以用于预测子痫前期。可用于预测子痫前期的蛋白质的实施例包括胎盘生长因子(PIGF)、可溶性fms样酪氨酸激酶1(sFlt1)，以及可溶性内皮糖蛋白(s-ENG)。
如本文所用，术语“临床风险因子”是指除蛋白质或代谢物测量值以外的临床测量值，其水平可以可选地与其他变量结合使用，以用于预测子痫前期。该术语包括血压测量值(收缩压、舒张压或平均动脉压(MAP)、受试者的年龄、子痫前期的家族史(fh_pet)-即受试者的母亲或姐妹发生PE、体重、体重指数(BMI)、腰围、妊娠前三个月的每日香烟数量(cig_1st_trim_gp)，采集生物样品时的妊娠期，以及采集生物样品时通过血糖仪测量的随机葡萄糖。
如本文所用，术语“体重相关变量”或“WRV”是指受试者的体重、BMI或腰围。
如本文所用，术语“BP”是指选自第一收缩压和第二收缩压、第一舒张压和第二舒张压、第一平均动脉压和第二平均血压(MAP)的血压参数。在一个实施方案中，可以采用包括两次测量的平均值的复合BP值。
如本文所用，术语“代谢物”或“多种代谢物”是指新陈代谢，特别是哺乳动物新陈代谢过程终的中间体和产物。通常地，代谢物是与子痫前期有关的代谢物(与PE有关的代谢物)，其实施例如表2所示。可以根据代谢物类别对代谢物进行分类。代谢物类别的实施例包括乙酰基、无环烷烃、酰基肉碱、醛、氨基酸、氨基酮、芳烷基胺、氮杂环化合物、苯及其取代的衍生物、四吡咯及其衍生物、联苯及其衍生物、肉碱、胆碱、皮质类固醇及其衍生物、香豆素及其衍生物、二酰基甘油、二元羧酸、二肽、类花生酸、脂肪酸(氢过氧脂肪酸、酮或羟基脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、环氧脂肪酸)、甘油磷脂、羟基酸及其衍生物，单糖磷酸酯、N-酰基-α氨基酸、苯基丙酸、磷酸鞘脂、氮杂环化合物(吡啶)、鞘脂、糖醇、雄激素和类固醇(睾丸激素)、维生素D及其衍生物。在一个实施方案中，代谢物选自表2。在一个实施方案中，代谢物是与PE相关的代谢物，所述代谢物选自由以下项组成的组：25-羟基维生素D 3(HVD3)；2-羟基丁酸(2-HBA)；L-亮氨酸(L-LEU)；瓜氨酸(CR)；二十二碳六烯酸(DHA)；二亚油酰基-甘油；1,3二亚油酰基-甘油；1,2-二亚油酰基-甘油(异构体混合物)(DLG)；胆碱(CL)；L-异亮氨酸(L-ISO)；L-蛋氨酸(L-MET)；NG-单甲基-L-精氨酸(NGM)；不对称二甲基精氨酸(ADMA)；牛磺酸(TR)；硬脂酰肉碱(SC)；1-十七烷酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-HD)；胆绿素(BV)；1-磷酸鞘氨醇(S-1-P)；和二十碳五烯酸(EPA)。在一个实施方案中，该方法包括测量所有或基本上所有与PE相关的代谢物的水平。
除非另有说明，否则本文所指的代谢物和蛋白质标记物是指代谢物或蛋白质的总水平，包括代谢物或蛋白质的任何异构体。然而，应理解的是，本发明的方法可以使用给定代谢物或蛋白质的特定异构体。对于代谢物DLG(二亚油酰甘油)，术语“DLG”是指总的DLG，包括sn-1,3-二亚油酰甘油，以及sn-1,2-二亚油酰甘油和sn-2,3-二亚油酰基甘油(倒数第二有时缩写为sn-1,2-rac-二亚油酰基甘油)的外消旋混合物。然而，本发明的方法可以使用构成总DLG的任何一个或两个或全部三个立体异构体。
如本文中所使用的，公式符号[变量]涉及该变量在血液中的(相对)浓度，如通过本说明书中举例说明的测定法所确定的。
如本文所用，公式符号log10[变量]涉及该变量在血液中(相对)浓度以10为底的对数，由此该变量通过本说明书中举例说明的测定法确定。
如本文所用，制剂[变量(MoM)]涉及变量的中位数(MoM)标准化浓度。该变量通过本说明书中举例说明的测定法确定。
如本文所用，术语“纳入预后信号”是指变量或变量组合的特征，其水平或多个水平在一个或多种变量的限定阈值水平之上或之下，当在受试者中检测到时，其表示受试者发展为子痫前期的风险升高。每种变量的定义的阈值水平，通常地是基于对研究人群的巢式病例对照研究，与预定义的纳入测试要求相结合而预先确定的，因此，根据先兆子痫的类型和测试所需的阳性预测值(PPV)，不同的测试会有所不同。纳入预后信号可以是单变量的(即由单种变量，例如一种蛋白质、一种代谢物或一种临床风险因子组成)或多变量的(即由两种或多种选自蛋白质、代谢物或临床风险因子的变量组成)。当预后信号是单变量时，检测受试者(在临床风险因子变量的情况下)或生物样品(在蛋白质或代谢物变量的情况下)中预后信号的存在常涉及测量变量的水平，将水平与变量的定义阈值水平进行比较，并确定测试水平是高于还是低于阈值水平。例如，在预测早产子痫前期的风险的情况下，从受试者血液中检测到的蛋白PIGF的水平低于PIGF的阈值水平，构成早产子痫前期的纳入预后信号。在这种情况下，相对于相同胎龄的未发展为子痫前期的对照人群，阈值水平的百分数确定为7.56％。当预后信号是包括两种或多种变量(例如一种代谢物和一种蛋白质，或两种代谢物，或一种临床风险因子和一种代谢物)的多变量信号时，确定受试者中预后信号的存在通常涉及测量变量的水平，然后将水平输入到统计模型中，该统计模型被配置为以分数的形式提供输出，并将该分数与多变量预后信号的定义阈值分数(或参考分数范围)进行比较，并确定该测试分数是否高于或低于阈值分数。基于研究人群和预定义的纳入或排除测试性能要求，定义阈值分数可以是预先确定的，因此根据子痫前期的类型和与测试的期望严谨性，定义阈值分数在每次测试中可能有所不同。以下是子痫前期的纳入的多变量预后信号的实施例：
早产子痫前期：
纳入的多变量预后信号包括蛋白质-ENG和PIGF的水平，以及代谢物DLG和L-ERG的水平，以及统计模型：
0.0942921407169182 log10[s-ENG]-0.127933447595162 log10[PIGF]+0.177562360580178 log10[DLG]-0.0840930458415515 log10[L-ERG]，其中，当统计模型的输出分数<0.478254130106926时，则认为纳入预后信号是存在的，表明受试者发生早产子痫前期的风险升高。
足月子痫前期
纳入预后信号包括以下变量的水平：BP、HVD3、L-ISO和1-HD，以及统计模型：0.00853293587443292[bp]+0.096620376132676 log10[HVD3]+0.24599289739986 log10[L-ISO]-0.300891766915803 log10[1-HD]，其中当统计模型的输出分数小于1.09653388177747时，认为纳入预后信号是存在的，表明受试者发生足月子痫前期的风险升高。
所有的子痫前期
“所有的”子痫前期的纳入预后信号采用以下变量的水平：BP、HVD3、PIGF和DLG，以及统计模型：
-0.176060524601929 log10[PIGF]+0.0143316978786453[bp]+0.0149559619104756 log10[HVD3]+0.116776043392906 log10[DLG]，其中当统计模型的输出分数小于1.33083720900868时，表示纳入预后信号是存在的，表明受试者发生“所有的”子痫前期的风险升高。
下面的实施例3至8示出其它的单变量和多变量纳入预后信号的实施例。
如本文所用，术语“排除预后信号”是指变量或变量组合的特征，其水平在一个或多种变量的限定阈值水平之上或之下，当在受试者中检测到时，表示受试者发展子痫前期的风险降低。每种变量的定义的阈值水平，通常地是基于对研究人群的巢式病例对照研究，与预定义的纳入测试要求相结合而预先确定的，因此，根据先兆子痫的类型和测试所需的阴性预测值(NPV)，不同的测试会有所不同。排除预后信号可以是单变量的(即由单种变量，例如一种蛋白质、一种代谢物或一种临床风险因子组成)或多变量的(即由两种或多种选自蛋白质、代谢物或临床风险因子的变量组成)。当预后信号是单变量时，检测受试者(在临床风险因子变量的情况下)或生物样品(在蛋白质或代谢物变量的情况下)中预后信号的存在通常地涉及测量变量的水平，并将该水平与该变量的定义阈值水平进行比较，并确定测试水平是高于还是低于阈值水平。例如，在预测早产子痫前期的风险的情况下，在低于阈值水平的水平上检测到的受试者血液中的代谢物DLG，构成了早产子痫前期的排除预后信号。在这种情况下，相对于相同胎龄的未发展为子痫前期的对照人群，阈值水平的百分数确定为61.1％。另一个例子，在预测早产子痫前期的风险的情况下，从受试者获得的血液中代谢物L-ERG的检测低于阈值水平，其构成早产子痫前期的排除预后信号。在这种情况下，对于相同胎龄的未发展为子痫前期的对照人群，阈值水平的百分数确定为44.1％。当预后信号是包括两个或多种变量(例如一种代谢物和一种蛋白质，或两种代谢物，或一种临床风险因子和一种代谢物)的多变量信号时，确定受试者中预后信号的存在通常地涉及测量变量的水平，并将水平输入到统计模型中，该统计模型被配置为以分数的形式提供输出，并将分数与用于多变量预后信号的定义阈值分数进行比较，并确定测试分数是否高于或低于阈值分数。。基于研究人群和预定义的纳入或排除测试性能要求，定义阈值分数可以是预先确定的，因此根据子痫前期的类型和与测试的期望严谨性，定义阈值分数在每次测试中可能有所不同。以下是子痫前期的排除多变量预后信号的实施例：
早产子痫前期：
排除预后信号包括s-ENG、DLG、NGM和1-HD的水平，以及统计模型：
0.253406507128582 log10[s-ENG]+0.187688881253026 log10[DLG]+0.168200074854411 log10[NGM]-0.213566303707572 log10[1-HD]，其中，当统计模型的输出分数小于0.14882970770599时，认为排除预后信号是存在的，这表明该受试者发生子痫前期的风险降低。
足月子痫前期
排除预后信号包括以下变量的水平：BP和1-HD，以及统计模型：0.0115467461789923[bp]-0.324977743714534 log10[1-HD]，其中，当统计模型的输出分数小于1.19965110779133时，认为排除预后信号是存在的，表明受试者发生子痫前期的风险升高。
所有的子痫前期
“所有的”子痫前期的排除预后信号采用以下变量的水平：s-ENG、BP、HVD3和1-HD，以及统计模型：
0.166860970853811 log10[s-ENG]+0.0126847727730485[bp]+0.115675583588397 log10[HVD3]-0.154060908375255 log10[1-HD]，其中，当统计模型的输出分数小于1.36693873303307782时，认为存在排除预后信号，表明受试者发生“所有的”子痫前期的风险升高。
下面的实施例3至8示出单变量和多变量纳入预后信号的其他实施例。
应当理解，可以在纳入预后信号和排除预后信号中，使用相同的生物标记物或变量。一个实施例是在预测足月子痫前期的情况下的BP。
如本文所用，术语“预测子痫前期的风险”应理解为，意指预测子痫前期的风险升高或风险降低。在检测到风险升高的情况下，测试后的概率一般地会高于测试前的概率，例如是测试前概率的1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍。在一个实施方案中，本发明的方法被配置为检测40-60％的子痫前期病例(即40％-50％或50-60％)，假阳性率(FPR)为5-25％，优选地，FPR约为10-20％。在检测到风险降低的情况下，测试后的概率一般地低于测试前的概率，例如比测试前的概率低1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍。在一个实施方案中，本发明的方法被配置为检测40-60％的非子痫前期病例(即40％-50％或50-60％)，假阴性率(FNR)为5-25％，并且优选地，约10-20％的FNR。
如本文所用，应用于生物样品的术语“多种代谢物”是指含有至少5或10种不同代谢物，一般地，含有至少40、50、70、90或100种不同代谢物的样品。本发明的方法可以用于分析生物样品中的多种代谢物，特别是提供生物样品中多种代谢物的定性和定量分布。
如本文所用，术语“代谢剖析”是指通过质谱法，优选地是LC-MS、双液相色谱-质谱联用和理想地双LC-MS/MS，测定生物样品中的代谢物(或优选地，多种代谢物)。样品中代谢物的测定可以是所有代谢物，或所选代谢物的测定。优选地，该测定是与妊娠高血压疾病，特别是子痫前期有关的代谢物的测定。代谢物的确定可以是定性的、定量的或定性和定量的组合。在一个实施方案中，定量测定是相对定量测定，即相对于已知量的与目标的代谢物相对应的稳定同位素标记的内标(SIL-IS)，确定样品中特定代谢物的丰度。在另一个实施例中，定量测定以绝对定量。样本的代谢剖析可用于病例对照研究(尤其是巢式病例对照研究)，以识别可作为疾病的预后和诊断变量的代谢物和代谢物组合。在一个实施方案中，代谢剖析是靶向分析，其用于确定特定的代谢物，通常地采用调谐的MS设置，并且通常地采用电喷雾电离-三重四极杆(QqQ)MS/MS分析。
如本文所用，术语“代谢物提取剂”是指用于从样品中的其他组分，特别是蛋白质中提取代谢物的溶剂。一般地，溶剂是提取剂/蛋白质沉淀溶剂，其使样品中的蛋白质沉淀，可以使用常规分离技术(即，离心或过滤)将其分离，从而留下富含代谢物的上清液。然后可以将上清液施加到色谱柱上以分解样品中的代谢物，然后可以通过在线质谱法测定来自该柱的洗脱液。在一个实施方案中，代谢物提取剂包括甲醇、异丙醇和缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐缓冲剂。在一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂是乙酸铵缓冲剂。可以使用其他挥发性缓冲剂或缓冲盐，例如氨水：乙酸、甲酸铵、三甲胺、醋酸。在一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂的浓度为约150-250mM，优选地为约200mM。在一个实施方案中，将缓冲液配置为将萃取溶剂的pH缓冲至约4-5，优选地为约4.5。在一个实施方案中，萃取溶剂包括甲醇和异丙醇，二者的体积比为约5-15:5-15或8-12:8-12。在一个实施方案中，萃取溶剂包括甲醇、异丙醇和缓冲剂，其比例为约10-30:10-30:1-5(v/v/v)。在一个实施方案中，提取溶剂包括比例为约10:9:1(v/v/v)的甲醇、异丙醇和乙酸铵缓冲液。
如本文所用，术语“色谱法”是指一种过程，在该过程中，由于不同物理状态的两相(一个相是固定的，一个相是流动的)之间组分的不同理化性质而产生的差异分布和/或吸附，将化学混合物分离成组分。
如本文所用，术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地渗透通过细分物质的柱或通过毛细管通道时，选择性阻滞流体溶液的一种或多种组分的过程。阻滞是由于当一种流体相对于一种或多种固定相移动时，该混合物的组分在一种或多种固定相与本体流体(即流动相)之间的分布所致。“液相色谱法”的示例包括正相液相色谱法(NPLC)、反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)和湍流液相色谱法(TFLC)(有时称为高湍流液相色谱法(HTLC)或高通量液相色谱法)。
如本文所用，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”(有时称为“高压液相色谱法”)是指通过迫使流动相在压力下通过固定相(通常是密集填充柱)来增加分离度的液相色谱。
如本文所用，术语“超高效液相色谱法”或“UHPLC”(有时称为“超高压液相色谱法”)是指通过迫使流动相在高压下通过固定相(通常是密集填充柱)来增加分离度的液相色谱，所述固定相包括平均粒径小于2μm的填充颗粒。
如本文所用，术语“湍流液相色谱法”或“TFLC”(有时称为高湍流液相色谱法或高通量液相色谱法)是指一种色谱形式，其利用通过柱填充的被分析物质的湍流，作为进行分离的基础。在通过质谱分析之前，TFLC已用于制备包括两种未命名药物的样品。参见，例如，Zimmer et al.,J Chromatogr A854:23-35(1999)；另参见美国专利5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其进一步解释了TFLC。本领域普通技术人员可以理解“湍流”。当流体缓慢而平稳地流动时，该流动称为“层流”。例如，以低流速流经HPLC色谱柱的流体是层流的。在层流中，流体粒子的运动是有序的，粒子通常沿直线运动。在更快的速度下，水的惯性克服了流体的摩擦力，从而产生了湍流。不与不规则边界接触的流体，“超出”了因摩擦而变慢或因不平坦表面而偏转的流体。当流体湍流地流动时，它以涡流和旋涡(或漩涡)的形式流动，比层流时有更多的“阻力”。许多参考资料可用于帮助确定流体流动是层流或湍流(例如，Turbulent Flow Analysis Measurement第二Prediction,P.S.Bernard&J.M.Wallace,John Wiley&Sons,Inc.,(2000)；An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu&Julian Scott,Cambridge University Press(2001))。
如本文所用，术语“双重液相色谱法”或“双重LC”应用于生物样品指的是分离步骤，其中用第一类型的LC处理样品的第一等份(即C18 RPLC)，用第二类型的LC处理样品的第二等份(即HILIC)。这特别适用于本发明的方法，其中多个代谢物被剖析，因为样品的双LC分离可提高代谢物的分离度，从而改善分析测定。在一个实施方案中，双LC步骤包括对相同样品的单独等份试样进行的三个或更多个色谱步骤，例如两个RPLC步骤，其被配置为分离(不同)组疏水性代谢物，以及两个HILIC步骤，其被配置为分离(不同)组亲水性代谢物。当样品中的代谢物组太宽而无法通过在线质谱法在单个双RPLC-MS–HILIC-MS分析中进行充分分析时，可以采用这种方法。
如本文所用，术语“固相萃取”或“SPE”是指由于溶液通过或绕过的固体(即，固定相)的溶液(即，流动相)中溶解或悬浮的组分的亲和力，将化学混合物分离成组分的过程。在某些情况下，当流动相通过或绕过固定相时，固定相可能会保留流动相中不需要的组分，从而导致流动相中分析物的纯化。在其他情况下，分析物可以被固定相保留，从而使流动相中不需要的组分通过或绕过固定相。在这些情况下，然后使用第二流动相从固定相上洗脱保留的分析物，以进行进一步处理或分析。包括TFLC在内的SPE，可以通过单一模式或混合模式机制进行操作。混合模式机制利用离子交换和疏水性保留在同一根色谱柱中；例如，混合模式SPE色谱柱的固定相可能表现出强阴离子交换和疏水性保留。或可能会出现色谱柱表现出强阳离子交换和疏水保留的现象。
如本文所用，应用于质谱的术语“在线("in-line)”或“在线("on-line)”指的是配备有任何电离源的质谱，该电离源能够实时电离LC洗脱液中存在的分析物，所述LC洗脱液直接和连续地引导到质谱仪。
如本文所用，术语“质谱法”或“MS”是指根据化合物的质量确定化合物的分析技术。MS是指根据离子的质荷比或“m/z”进行过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括(1)电离化合物以形成带电荷的化合物；以及(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可以通过任何合适的方法被离子化和检测。“质谱仪”通常地包括离子发生器和离子检测器。通常地，一个或多个目标分子被电离，然后将这些离子引入质谱仪中，由于磁场和电场的结合，这些离子沿着空间中的一条路径移动，该路径取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。参见例如美国专利6,204,500，标题为“Mass Spectrometry From Surfaces”；美国专利6,107,623，标题为“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry”；美国专利6,268,144，标题为“DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry”；美国专利6,124,137，标题为“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption AndDetection Of Analytes；”Wright et.al.,Prostate Cancer and Prostatic Diseases1999,2:264-76；和Merchant and Weinberger,Electrophoresis 2000,21:1164-67。
如本文所用，术语“串联质谱法”是指涉及至少两个阶段的质量分析的方法，该方法与解离过程或化学反应相结合，以引起离子质量或电荷的变化。使用MS/MS的主要优点是可以区分化学噪声，其可能来自不同的来源(例如基质化合物、色谱柱流失、离子源污染)。
MS/MS中有两种不同的方法：在空间上通过将仪器的两个或多个物理上不同的部分耦合在一起(例如，三重四极杆(QqQ)，或四极杆–飞行时间、Qq-TOF、三重TOF、四极杆轨道飞轮)；或通过在离子存储设备(例如，离子阱、IT)或其杂化物(例如，四极–离子阱–轨道飞行器)中执行一系列事件来及时处理。MS/MS串联扫描的主要方式是产物离子、前驱体离子、中性损失、所选反应监控、多反应监控和MSn扫描。
通常地，定量串联质谱仪使用三重四极杆(QqQ)MS分析仪进行。
MS/MS方法通常地涉及所选离子的激活，通常地通过与惰性气体发生碰撞来激活，足以诱发碎裂(碰撞诱发的离解，CID)并生成产物离子。产物离子扫描涉及选择目标前驱体离子(使用第一质量过滤器(Q1)，其激活(q2)和质量分析扫描(Q3)以确定其产物离子。与前驱体离子扫描相比，产物离子扫描代表相反的过程；第二质量过滤器(Q3)设置为分析单个产物离子，而第一质量过滤器(Q1)用于扫描将(在q2中)离解为所述产物离子的前驱体离子。中性损耗扫描涉及扫描碎片(固定的、预定质量的中性损耗)；Q1和Q3将平行地扫描设定的m/z范围，但其过滤器会根据预定的中性质量偏移。对于代谢研究中的快速筛选很有用。MSn通常用于离子阱分析仪。通过从质谱仪中排出所有其他质量来选择和分离前驱体离子。前驱体离子的CID产生可能具有不同质量的离子(MS/MS)的产品质量为选择分析物，并从细胞中排出其他碎片离子。该产物离子可以再次进行CID，从而生成更多的产物离子，并进行质量分析(MS/MS/MS)。此过程可以重复几次。但是，如上所述，对于小分子(如代谢物)，实际上仅主要使用MS/MS或MS/MS/MS。选择性反应监测(SRM)是选择性离子监测(SIM)的特例，其中串联仪器通过选择前驱体离子和产物离子来增强SIM的选择性。如果同时监视几个不同的反应，则使用长期多反应监视(MRM)。
如本文所用，术语“选择性离子监测”是用于质谱仪的检测模式，其中仅相对窄质量范围内的离子，通常地在一个质量单位左右能被检测到。
如本文所用，“多种反应模式”，有时也称为“所选反应监测”，是用于质谱仪的检测模式，其中选择性地检测前驱体离子和一个或多个碎片离子。在一个实施方案中，本发明的质谱法采用多种反应模式检测。
如本文所用，术语“以阴离子模式操作”是指产生和检测阴离子的那些质谱法。如本文所用，术语“以阳离子模式操作”是指产生和检测阳离子的那些质谱方法。
如本文所用，术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”是指产生具有等于一个或多个电子单元的净电荷的分析物离子的过程。阴离子是具有一个或多个电子单元的净负电荷的离子，而阳离子是具有一个或多个电子单元的净正电荷的离子。
如本文所用，术语“电子电离”或“EI”，是指气相或气相中的目标分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物的碰撞产生分析物离子，然后可将其进行质谱技术。
如本文所用，术语“化学电离”或“CI”是指使反应气(例如，氨)受到电子冲击，并且通过反应气离子与分析物分子的相互作用，形成分析物离子的方法。
如本文所用，术语“快速原子轰击”或“FAB”是指高能原子束(通常地为Xe或Ar)撞击非挥发性样品，使样品中包括的分子解吸和电离的方法。将测试样品溶解在粘性液体基质中，例如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。为化合物或样品选择合适的基质是一个基于经验的过程。
如本文所用，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指将非挥发性样品暴露于激光照射的方法，该方法通过各种电离途径解吸和电离样品中的分析物，包括光电离、质子化、去质子化和团簇衰变。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，这有助于分析物分子的解吸。
如本文所用，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指另一种方法，其将非挥发性样品暴露于激光照射下，其通过各种电离途径解吸和电离样品中的分析物，包括光电离、质子化、去质子化和团簇衰变。对于SELDI，样品通常与优先保留一种或多种目标分析物的表面结合。如在MALDI中一样，此过程也可以使用能量吸收材料来促进电离。
如本文所用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指一种方法，其使溶液沿较短长度的毛细管通过，并在其毛细管的末端施加高正或负电势。到达管末端的溶液被汽化(雾化)成喷射或喷出非常小液滴的溶剂蒸汽。液滴的雾流过蒸发室。随着液滴变小，表面电荷密度会增加，直到类似电荷之间的自然排斥导致离子以及中性分子被释放。加热的ESI是相似的，但包括一个热源，其用于在毛细管中加热样品。如本文所用，Agilent Jet Stream电离源是指使用热梯度聚焦技术生成优化的ESI条件的ESI变量。
如本文所用，术语“大气压化学电离”或“APCI”，是指与ESI相似的质谱法；但是，APCI通过在大气压下的等离子体内发生的离子-分子反应产生离子。等离子体通过喷雾毛细管和反电极之间的放电而保持。然后，通常地，通过使用一组差动抽油机级，将离子提取到质量分析器中。干燥和预热的N2气体的逆流可用于提高溶剂的脱除率。在分析极性较小的物质时，APCI中的气相电离比ESI更有效。
如本文所用，术语“大气压光电离”或“APPI”是指质谱的形式，其中分子M的光电离的机理是光子吸收和电子喷射以形成分子离子M+。因为光子能量通常地刚好高于电离电势，所以分子离子不易解离。在许多情况下，无需色谱即可分析样品，从而节省大量时间和费用。在水蒸气或质子溶剂的存在下，分子离子可以萃取H形成MH+。如果M具有高质子亲和力，则倾向于发生这种情况。这不会影响定量准确度，因为M+和MH+之和是恒定的。质子溶剂中的药物化合物通常以MH+的形式观察到，而非极性化合物(例如萘或睾丸激素)通常以M+的形式观察到。参见，例如，Robb et al.,Anal.Chem.2000,72(15):3653-3659。
如本文所用，术语“场解吸”是指其中将非挥发性测试样品放置在电离表面上，并使用强电场来产生分析物离子的方法。
如本文所用，术语“解吸”是指从表面去除分析物和/或使分析物进入气相。激光解吸热解吸是一种通过激光脉冲，其中将含有分析物的样品热解吸到气相中的技术。激光打在特制的带有金属底座的96孔板的背面。激光脉冲加热基体，热量使样品转移到气相中。然后将气相样品吸入质谱仪。
如本文所用，体液样品中分析物的“量”通常是指反映在样品体积中可检测的分析物质量的绝对值。然而，一个量还考虑与另一分析物量相比的相对量。例如，样品中分析物的量可以大于样品中通常存在的分析物的对照或正常水平的量。
如本文所用，术语“吸收取样装置”是指用于生物材料的液体取样装置，例如血液的生物材料的液体取样装置，该液体取样装置使用吸收介质，该吸收介质快速地将生物流体吸到以干燥形式存储该流体的吸收介质上。在一个实施方案中，吸收取样装置是“体积控制吸收取样装置”，其被配置为以体积，或体积受控的方式，对流体进行取样的吸收取样装置。体积取样是通过对吸收介质使用固定的可重复的内部体积(控制介质的容量)，或通过控制沉积在吸收介质上的体积来实现的，后者通常采用微流控技术。一个实施例是“体积吸收微取样装置”或“VAM装置”，其是指采用具有预定内部体积的亲水性多孔材料的血液取样装置。它们在EP2785859和EP16753193(Neoteryx LLC)中有所描述。实施例包括可从美国加利福尼亚州托伦斯的Neoteryx获得的Neoteryx MITRA微量进样器。其他类型的体积控制取样设备，包括DBS Systems HEMAXIS设备(体积沉积控制)以及来自SpotON Sciences的HEMASPOT(介质容量控制)。
如本文所用，以这种方式收集的样品也称为“干燥的液体”或“干燥的血液”样品，术语“色谱法”是指这样的过程，其中当化学实体在固定液相或固定相周围或上方流动时，由于化学实体的差异分布，由液体或气体携带的化学混合物被分离成组分。
如本文所用，术语“预防性疗法”是指对孕妇进行的一种治疗干预，以防止子痫前期的发展，通常是在怀孕的第二或第三个月。治疗干预的示例包括阿司匹林[7]、二甲双胍[8]；低分子量肝素[12]、降低血糖指数的益生菌[13]；瓜氨酸[14]或抗氧化剂，包括但不限于，抗氧化剂维生素(例如抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素)[15]、无机抗氧化剂(例如硒)和植物衍生的多酚，和/或针对线粒体的抗氧化剂[25]，包括但不限于，Mito VitE和麦角硫氨酸[16,17]；他汀类药物，包括但不限于普伐他汀[18]；抗高血压治疗(包括使用β受体阻滞剂；血管扩张剂，包括但不限于H2S[19]或NO供体，如西地那非或其他[20]；DOPA脱羧酶抑制剂)或抗炎治疗剂，包括但不限于地高辛抗体[21]；或者抗氧化应激损伤的抗氧化剂，包括但不限于(a1-微球蛋白)[22]，均可以考虑。此外，人们可以容易地预见到优选的治疗组合，例如但不限于阿司匹林和/或线粒体抗氧化剂，或联合疗法，其包括二甲双胍和其他药物(例如阿司匹林、噻唑烷二酮、DPP-4抑制剂、磺酰脲和美格列奈)。
范例
现在将参考具体实施例来描述本发明。这些仅是示例性的，仅用于说明目的：它们并非旨在以任何方式限制所声称的垄断范围或发明所描述的内容。这些实施例构成了当前考虑用于实施本发明的最佳模式。
实施例1
参加者和样本：
从妊娠15+/-1和20+/-1周的单胎妊娠孕妇中，收集预期的临床样本，这些样本在进一步的妊娠过程中被诊断为子痫前期(病例)或未被诊断为子痫前期(对照)。所有样本均来自未分娩妇女的SCOPE(妊娠终点筛查)前瞻性筛查研究的参与者[23,24]。
征得了每个参与者的书面同意。应用于研究的纳入标准为未分娩、单胎妊娠、妊娠14周0天至16周6天之间的胎龄，知情同意参与。应用的排除标准为：末次月经(LMP)不确定、不愿意在<＝20周时进行超声扫描、>＝3次流产、>＝3次终止、重大胎儿异常/核型异常、妊娠前治疗过原发性高血压、预约时中-重度高血压≥160/100mmHg、糖尿病、肾病、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、镰状细胞病、HIV阳性、主要子宫异常、宫颈缝合、刀锥穿刺活检、现在胎膜破裂，长期服用类固醇、小剂量阿司匹林治疗、钙治疗(>1g/24h)、二十碳五酸(鱼油)治疗、维生素C>＝1 000mg治疗和Vit E>＝400iu、肝素/低分子量肝素治疗。
子痫前期定义为妊娠高血压(妊娠20周后至分娩开始前相隔4小时内，收缩压(BP)>140mmHg和/或舒张压BP>＝90mmHg(Korotkoff V)至少2次)，或产后收缩压BP>＝140mmHg和/或舒张压BP>＝90mmHg至少2次，产后4小时内出现，尿蛋白>＝300mg/24h或斑点尿蛋白：肌酐比>＝30mg/mmol肌酐，或尿液试纸>＝2或子痫前期的任何多系统并发症。多系统并发症包括以下任何一项：1)急性肾功能不全，定义为产前血清肌酐>＝100μmol/L或产后>130μmol/L的新增加；2)肝病，定义为天冬氨酸转氨酶和/或丙氨酸转氨酶升高＞45IU/L和/或严重的右上腹或上腹痛或肝破裂；3)神经系统疾病，定义为子痫或即将发生的子痫(严重头痛伴反射亢进和持续性视觉障碍)或脑溢血；4)血液系统疾病，包括血小板减少症(血小板<100x109/L)，弥散性血管内凝血或溶血，可通过血膜上的特征(例如碎片细胞、头盔细胞)以及触珠蛋白减少来诊断。子痫前期可以在妊娠期间的任何阶段、招募后直至分娩，或分娩后的两周内被诊断出来。
通过对妊娠15+/-1和20+/-1周孕妇的访谈和检查，收集了已知的子痫前期危险因素的临床数据(Zhong et al,Prenatal Diagnosis,30,p.293-308,2010；Sibai et al,365,p.785-799,2005)。在第20周获取胎儿测量、解剖学、子宫和脐动脉多普勒以及宫颈长度的超声数据。在24周时测量胎儿的生长、子宫和脐带多普勒。跟踪妊娠结果，并在分娩后48小时内对妇女进行检查。婴儿测量结果是在分娩后48小时内获得的。
使用的样本集：
在SCOPE的欧洲范围内进行了巢式病例对照研究，使用妊娠15+/-1周时采集的血液样本；队列构成病例：对照的比例约为1:3.5。病例定义为在妊娠过程中发展为子痫前期(如前所述)的孕妇：在研究中考虑了97例，这与SCOPE欧洲范围内所有可获得样本的病例相对应。在所有其他妊娠中随机选择对照。为避免因选择偏见而造成的假象，比较了选择参加研究的对照人群的人群统计学和临床特征，并使用适当的统计检验验证是否存在偏见；适当使用卡方检验、Spearman相关系数、Mann Whitney U和Kruskal-Wallis检验。选择了335例孕妇对照的样本进行研究。
在表1A中，列出了该研究队列的基线特征。
表1A：研究人群的特征
Figure BDA0002716241410000361
Figure BDA0002716241410000371
结果表示为平均值(SD)、中位数(四分位数范围)或n(％)。
*尿液试纸≥2+或24h尿蛋白排泄≥300mg或斑点尿蛋白：肌酐比值≥30mg/mmol。
Figure BDA0002716241410000372
病例vs对照，卡方检验、T或Mann Whitney U检验。
目标代谢物：
表2列出本申请中考虑的目标代谢物的非限制性列表。考虑到识别代谢物的非显而易见的预后组合，发明人认为这些代谢物和/或代谢物类别是相关的，以便在妇女子痫前期的临床症状出现之前，预测孕妇子痫前期的风险。在可能的情况下，通过CAS号或/和其HMDB标识符来识别目标代谢物；还给出了分子量(na：不可用)。
表2目标代谢物
Figure BDA0002716241410000373
Figure BDA0002716241410000381
Figure BDA0002716241410000391
为了开发本文所公开的分析方法的集合，上述代谢物的参考材料购自：Fluka(阿克洛，爱尔兰)、Fischer Scientific(布兰奇敦，爱尔兰)、IsoSciences(普鲁士国王，宾夕法尼亚，美国)、Sigma-Aldrich(威克洛，爱尔兰)、Avanti Lipids(阿拉巴斯特，阿拉巴马，美国)、QMX实验室(萨克斯泰德，英国)，LGC(特丁顿，英国)，Alfa Chemical(霍尔茨维尔，纽约，美国)、Generon(梅登黑德，英国)、Larodan(索尔纳，瑞典)和R&D Systems(阿宾登，英国)。根据目标代谢物的理化特性，有时会获得目标代谢物的盐形式。
子痫前期风险分层测试的示例性预后目标：
如本申请中其他地方所详述的，本文公开的方法能够发现总的子痫前期的变量组合，而且还适用于子痫前期的临床相关子类型，或/和具有不同风险特征的不同患者人群。
在本申请中，重点是针对特定患者人群，即第一次没有明显临床风险因子的孕妇，建立子痫前期的不同子类型的预后组合。因此，发明人披露的方法的集合应用于其他患者人群，在肥胖孕妇人群和非肥胖人群中都具有子痫前期风险。
本文处针对的子痫前期子类型是
-所有的子痫前期(“所有的PE”)
-早产子痫前期(PT-PE)：定义为在妊娠37周，或早产前，导致(医源性)分娩的子痫前期。
足月子痫前期(T-PE)：定义为在妊娠37周或足月，或其之后，与分娩有关的子痫前期。AUROC目标：
Royston等人注意到临床预后模型的AUROC通常地在0.6到0.85之间。[25]
因此，发明人将AUC>＝0.65的最小性能作为任何变量组合的最小AUROC，任何变量组合被认为是预后模型/核心。
基于假阳性率(特异性)阈值的纳入目标：
在本申请中，还考虑了对于预后子痫前期病例的给定假阳性率(FPR或(1-特异性))，可以最大程度地提高子痫前期未来病例的检出率(敏感性)的预后模型/核心的发现。这些预后模型侧重于识别会发展子痫前期的个体。考虑了以下FPR:20％的FPR(特异性＝0.8)和10％的FPR(特异性＝0.9)。为了提供具有临床意义的纳入测试，提出了以下最低检出率：
-20％的FPR：>＝50％的未来PE病例检出率(敏感性>＝0.5)
-10％的FPR：>＝40％的未来PE病例检出率(敏感性>＝0.4)
基于假阴性率(敏感性)阈值的排除目标：
在本申请中，还考虑了对于预后模型/预后将针对未来病例的给定假阴性率(FNR或(1-敏感性))，可以最大程度地提高未来子痫前期非病例的检出率(特异性)的预后模型/核心的发现。这些预后模型侧重于识别不会发展子痫前期的个体。考虑了以下FNR：20％的FNR(敏感性＝0.8)和10％的FNR(敏感性＝0.9)。鉴于进行临床上有意义的排除试验，提出了以下最低检出率：
-20％的FNR：>＝40％的未来非PE病例检出率(特异性>＝0.40)
-10％的FPR：>＝30％的未来非PE病例检出率(特异性>＝0.30)
阳性-阴性预测值的阈值
所有的PE：与未分娩的妇女相比，初次妊娠的孕妇发生子痫前期的风险为～1/20，[24],或相对风险约为2。[26]
在努力开发具有临床意义的筛查测试的过程中，发明人最近公开了以下基本原理。[27]多次分娩妇女子痫前期的产前管理，在很大程度上取决于其先前的妊娠史。流行病学研究表明，先前的子痫前期与复发风险升高有关。据报道，第二次妊娠的复发风险约为8.6分之1至6.8分之1(或PPV为0.116至0.147)，[28][29]而没有子痫前期的女性具有较低的复发风险，为77分之1至100分之1(或NPV为0.987至0.99)。[28][29]与此相符，如果一名妇女在先前的妊娠中患过子痫前期，在资源丰富的环境的大多数医疗保健系统中，她将得到更加谨慎的管理，与在任何早孕中均未发生子痫前期的妇女相比，她会有更多的产前检查。
基于以上所述，我们建议对未分娩妇女进行子痫前期风险分层测试应理想地模仿第二次孕妇可获得的子痫前期风险信息。因此，测试应将未分娩妇女分层为高风险组，其子痫前期可能性至少为7.5分之1(相当于PPV＝0.133；纳入)，或将她们分层为低风险组，其测试后概率至少为90分之1(相当于NPV＝0.988；排除)，理想情况下两者均有。基于此基本原理，并考虑到SCOPE队列中报告的PE发病率，确定了“所有的PE”PPV和NPV阈值；参见表3。
早产PE：对于早产PE，已从基准早产PE测试(其已经安排)中采用了PPV和NPV阈值；如本申请中其他地方所讨论的。[10][30]，参见表3。
足月PE：对于足月PE，阈值是与临床医生一起确定，与任一方向的测试前发病率相比，总体上对应于5倍富集；即高风险阈值对应于～5倍的未来PE病例的预测试概率；低风险阈值对应于～5倍的未来非PE病例的预测试概率。在此应用程序中，仅详细阐述了术语PE的预后模型。参见表3。
鉴于以上各段为每种PE子类型和/或患者亚群设置了最低PPV(纳入)，对于任何给定的PPV阈值，都追求以下最低(未来)的PE病例检测率，即，(未来)病例检测率至少为40％(敏感性>＝0.4)。同样地，对于任何预设的NPV-(排除)标准，针对任何给定的NPV阈值，即未来的非PE阈值，都追求以下最小的未来非PE情况(或“对照”)检测率。即未来的非病例检出率至少为30％(特异性>＝0.3)。
表3基于PPV和NPV的性能目标，用于预测在出现PE的临床症状之前孕妇的子痫前期风险。
Figure BDA0002716241410000411
为了避免疑问，尽管以上性能指标是基于临床意义的，但并不限于此；不同的医疗设置可能需要不同的目标。此外，当可获得新的预防性治疗选择时，基于例如治疗成本或/和副作用，可能需要不同的靶标。
为了避免疑问，如本申请中所公开的，变量的预后组合也与第二或更多妊娠妇女的子痫前期的预后有关。由于这些多次妊娠妇女将有“妊娠史”，这将影响其子痫前期的风险，因此很容易理解，当与本申请中披露的发现结合使用时，该信息将增强预测妊娠中子痫前期风险的预后性能。
实施例2
收集所应用的分析方法和统计模型
A)分析方法基于以下
1.使用提取溶剂/蛋白质沉淀溶剂，可以提取不同类型(类别)的代谢物。该萃取溶剂组合物是甲醇、异丙醇和200mM的醋酸铵(水溶液)的混合物，其比例为10:9:1，然后再用0.05％的3,5-二叔-4-丁基-羟基甲苯强化；在本实施例的剩余部分中，此溶剂称为“崩解剂(crash)”。
2.使用双(高压)液相色谱(LC)系统，可以在短时间内，进行识别和定量不同类别的代谢物。开发了色谱系统，以便可以将它们直接连接到质谱检测系统上。这种双色谱系统可分离不同代谢物类型/类别，并同时在质谱仪水平上产生可检测的信号。具有短周转时间的单一色谱系统，无法有效地生成所有类别的可检测信号。1)与预后问题相关，全面分析不同类别代谢物中的代谢物；在2)较短的周转时间内的能力，对于在经济上可行的时间和成本框架内生成足够大的样本集(对于启用统计稳健的多变量模型而言是必要的)是重要的。
LC方法的通常但非限制性的实施例详述如下：
双分离中使用的材料和试剂。
采购自Fluka(阿克洛，爱尔兰)的LC-MS级的醋酸铵(NH4OAc)和甲酸铵(NH4HCOO)。采购自Fischer Scientific(布兰奇敦，爱尔兰)的LC-MS最优级的乙酸、乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和2-丙醇(IPA)。
对于RPLC，使用的色谱柱类型为Zorbax Eclipse Plus C18快速分辨率高清HD2.1x50mm，1.8微米色谱柱(P.N.959757-902；Agilent Technologies，Little Island，爱尔兰)。对于HILIC-MS/MS，色谱柱类型为Ascentis Express HILIC 15cmx2.1mm，2.7微米(P.N.53946-U：Sigma-Aldrich，阿克洛，爱尔兰)
仪器：所用的LC-MS/MS平台由1260Infinity LC色谱系统(AgilentTechnologies，瓦尔德布龙，德国)组成。后者与配备有JetStream电喷雾电离源(AgilentTechnologies，圣克拉拉，加利福尼亚，美国)的Agilent三重四极杆6460质谱仪(QqQ-MS)耦合。
RPLC：
RPLC方法由以下设置/参数定义：
-进样量：7μL
-柱温箱温度：60℃
-使用二元溶剂系统进行梯度RPLC分离疏水代谢物：
ο流动相A：在pH 4.5时，水:MeOH:NH4OAc，缓冲液200mM，(92:3:5)
ο流动相B：在pH 4.5时，MeOH:乙腈:IPA:NH4OAc，200mM，(35:35:25:5)
应用线性梯度程序：在10分钟内从10％的流动相B到100％的流动相B。使用以下梯度-流速程序：
表3A
时间(min) 流动相A％ 流动相B％ 流体速率(ml/min)
0.00 100％ 0％ 0.350
6.00 0％ 100％ 0.5
8.00 0％ 100％ 0.5
8.10 100％ 0％ 0.5
9.00 100％ 0％ 0.5
10.00 100％ 0％ 0.350
RPLC色谱柱的流出物直接通入QqQ-MS，用于质谱测定目标疏水化合物(见下文)。
HILIC：
HILIC方法由以下设置/参数定义：
-进样量：3μL，其中将注入塞用3μL的ACN溶剂塞包围；为此专门设计了一个注射器程序。
-柱箱温度：30℃
-使用二元溶剂系统进行梯度HILIC拆分疏水代谢物：
ο流动相A：50mM的甲酸铵(水溶液)
ο流动相B：ACN
-应用线性阶梯梯度程序：在10分钟内从10％的流动相B到100％的流动相B。使用以下梯度-流速程序：
表3B
Figure BDA0002716241410000431
Figure BDA0002716241410000441
RPLC色谱柱的流出物直接通入QqQ-MS，用于质谱测定目标疏水化合物(见下文)。
3.使用定量质谱法的一种形式，即以多重反应监测模式操作的串联质谱系统(MS/MS)，以允许对代谢物进行敏感而具体的分析。样品在一定条件下，进行电离以产生目标代谢物的电离形式。然后将电离的代谢物破碎成代谢物衍生的碎片离子。确定每种代谢物两个特定片段的量，以识别和量化样品中原始代谢物的量(更多详细信息，请参见下文)。串联质谱在正电喷雾电离和负电喷雾电离以及多反应监测(MRM)模式下进行。对于与子痫前期相关的每种目标代谢物，针对每种目标代谢物和每种可用的SIL-IS，专门建立并优化以下参数：
-合适的前驱体离子m/z，包括其优选的电离模式(正或负)，
-在各种碰撞电压条件下的产物离子光谱(参见在不同的能量方案下引发离子-分子碰撞，导致生成特定的产物离子)，并选择最合适的定量和定性产物离子，用于质谱识别和定量。
-确定用于定量评估的参考定量离子/定性离子比例。
-此外，每种目标化合物还优化了许多特定于测定的仪器参数：四极杆分辨率、停留时间、碎裂电压、碰撞能量和细胞加速器电压。
同时，对仪器特定的参数进行了优化，以最大程度地保持电喷雾源中的化合物完整性，并实现了灵敏且特定的代谢物分析；源温度、鞘气流量、干燥气流量和毛细管电压。所使用的质谱仪是配备有JetStream电喷雾电离源(Agilent Technologies，圣克拉拉，加利福尼亚，美国)的安捷伦三重四极杆6460质谱仪(QqQ-MS)。
RPLC-ESI-MS/MS
对于用于分析目标疏水代谢物的质谱方法，优化的电喷雾电离源参数如下：
表3C
Figure BDA0002716241410000442
Figure BDA0002716241410000451
HILIC-MS/MS：
对于用于分析目标亲水代谢物的质谱方法，优化的电喷雾电离源参数如下：
表3D
源参数 正模式 负模式
气体温度，℃ 200 200
气体流量，l/min 13 13
雾化器，psi 40 40
鞘气加热器 400 400
鞘气流量 12 12
V毛细管 2500 3000
V充电 300 300
4.对于每种代谢物，针对每个靶标以及每个SIL-IS，开发了特定的LC-MS/MS分析方法；特定的LC-MS/MS分析需要结合以上2和3点。
5.为明确地识别目标代谢物/SIL-IS，每种测定将构成一组特定的实验参数，其将明确地识别目标化合物。值得注意的是，这些实验参数的值特定于所使用的LC-MS/MS技术并已针对其进行了优化。对于正在考虑的LC-MS/MS分析的情况，这组特定参数如下：
a)保留时间(Rt)：进样和出现最大峰值之间的时间(在检测器上)。确定每种代谢物的特定保留时间。
b)前驱体离子m/z：通过发生在质谱仪电离源中的带电过程直接从目标化合物中得到的离子的质量/电荷比。在这项工作中，前驱体离子通常是目标化合物的质子化[M+H]+或去质子化形式[M-H]-。在某些情况下，所考虑的前驱体离子在电离源中遇见中性实体(即水分子(H2O))的额外损失。在另一些情况下，目标化合物的电离是在中性化合物与另一种可用离子(即钠加合物)之间形成加合物之后进行的。为每种代谢物建立适当的前驱体离子。
c)前驱体离子电荷：通过在质谱仪电离源中发生的带电过程，直接从目标化合物中得到的离子电荷，前驱体离子可以带正电或带负电。为每种代谢物建立适当的电荷状态。
d)定量产物离子：作为涉及特定前驱体离子的反应产物形成的离子。该反应可以是不同类型的，包括单分子解离形成碎片离子、离子分子碰撞、离子分子反应[31]，或仅涉及电荷数的变化。通常地，定量产物离子是最强的片段和/或特定于目标化合物。定量产物离子数据用于定量目标化合物。为每种代谢物和SIL-IS确定了适当的定量产物离子。
e)定性产物离子：作为涉及特定前驱体离子的反应产物而形成的离子。该反应可以是不同类型的，包括单分子解离形成碎片离子、离子分子碰撞、离子分子反应[31]，或仅涉及电荷数的变化。通常，定性产物离子是所关注化合物的强度较小的片段。定性产物离子数据可作为LC-MS/MS对目标化合物特定的附加确认。在特定情况下，考虑使用不止一种定性离子。为每种代谢物和SIL-IS确定了合适的定性产物离子。
f)定量离子/定性离子比例(或者反之亦然)：在定义明确的串联质谱条件下，由目标化合物产生的前驱体离子将以可控的方式解离，并产生可预测比例的定量产物离子和定性产物离子。通过监测定量/定性比例，可以进一步确保LC-MS/MS可以特异性定量目标化合物。干扰物在相同的保留时间洗脱、产生相同的前驱体离子，并以与目标物相同的比例分解在相同的定量离子和定性离子中的机会，被认为非常低。在特定情况下，可以考虑使用一个以上的定量/定性的比例。为每种代谢物和SIL-IS确定合适的定量离子/定性离子比例(或者反之亦然)。
以上6个参数的可用性可以确定地对目标化合物进行高度特异性的测定。在某些情况下，当前驱体离子不会分解成有意义的产物离子时，并非所有6个参数都可用。
对于这些代谢物靶标，需要对结构相同的SIL-IS标准进行共同分析，因此还有一个额外的特异性指标：代谢物靶标和SIL-IS，除质量外，化学性质相同，因此保留时间相同。在极少数情况下，由于所谓的氘效应，无法实现完美的共洗脱[32]。
以下表4和表5列出了为预测子痫前期所关注的代谢物类别中的示例性代谢物，以及相关的SIL-IS建立的具体参数集，以及一些仪器特有的(但不限于)电离源设置。
表4.目标疏水性代谢物和相关的SIL-IS的LC-MRM参数
Figure BDA0002716241410000461
Figure BDA0002716241410000471
Figure BDA0002716241410000481
+读数是1,3-rac-二亚油酰基甘油和1,2-rac-二亚油酰基甘油的组合信号
表5.目标亲水性代谢物和相关的SIL-IS的MRM参数
Figure BDA0002716241410000491
Figure BDA0002716241410000501
Figure BDA0002716241410000511
#在源碎片中
6.使用稳定同位素标记的内标(SIL-IS)来进行稳定同位素稀释质谱分析，以实现准确和精确的基于质谱的化合物定量[33][34]。简而言之，稳定同位素稀释质谱法基于以下原理：在分析过程开始时，用相同体积的明确定义的SIL-IS混合物，强化所有研究样品。这些SIL-IS通常地与目标内源化合物(在此情况下为代谢物)相同，但在分子结构中具有许多特定原子(通常地为氢1H、氮14N或碳12C)，并被相同的元素的稳定的、重同位素取代(通常地为氘2H、氮15N、碳13C)。因此，SIL-IS具有相同的化学性质，但与内源同类物质相比，“较重”物质有所不同。由于它们具有相同的化学性质，因此它们将像所有目标的内源性代谢物一样，“经历”所有实验变异性。例如，样品制备期间，研究样品之间任何不同的提取率都会同等影响目标代谢物及其相应的SIL-IS。同样地，目标代谢物及其相应的SIL-IS将进行相同的色谱分析，通常地在质谱分析过程中对变异性同样敏感。结果任何目标代谢物信号及其对应的SIL-IS信号的比例在很大程度上与实验变异性无关，因此“代谢物信号/相应的SIL-IS信号”的比例，与血液样品中靶标的原始浓度直接相关。因此，在本文公开的方法中，精确定量样品中目标代谢物的量的优选方法，是通过建立“目标代谢物定量离子的量/相应的SIL-IS的定量离子的量”的比例。因此，在本文公开的方法中，可以实现在一次样品分析中定量多种不同的目标代谢物。此外，由于所有研究样品均用相同体积的SIL-IS混合物进行了强化，因此可以容易地比较所有研究样品中目标代谢物的水平。SIL-IS是外源性化合物，因此无法在天然生物样品中发现，因此其加标浓度可作为所有研究样品的通用参考。
7.使用特定的样品处理方案，来同时处理具有高可重复性和低技术变异性的大批生物样本。以下详细说明适合用途的处理方案的非限制性的实施例。
作为方法的一部分，已经建立了专门的生物样本制备方法，包括用相关的SIL-IS混合物强化样品，并使用“崩解”法提取目标代谢物。在样品处理方面，最大限度地减少任何潜在的误差，对于确保可靠和准确的结果至关重要。这种方法中的关键误差源与体积控制有关；其中最关键的体积是可用于分析的实际样品体积，并且添加了SIL-IS的体积。尽管经验丰富的实验室分析人员将能够精确地制备样品，但是在保证处理大量生物样本以消除人为引起的技术差异时，优选地使用机器人液体处理器。
在此，作为非限制性的实施例，我们使用液体处理机器人，详细地说明了与本申请中的方法相关的专用血液处理过程。
该机器人被配置为使用成熟的96孔格式，可以平行地采集96个血液样本；这也是此处方法收集所采用的分析批处理格式。
仪器：
Agilent Bravo自动化液体处理平台(BRAVO，型号16050-102，AgilentTechnologies，圣克拉拉，加利福尼亚，美国)，配备有96LT一次性吸头、一个轨道振动台和一个珀耳帖热站(Agilent Technologies)。机器人平台具有9个预定义的工作站，其可用于96个孔板(样本、试剂、移液器吸头盒)或功能工作站(例如Peltier工作站等)
实验方案：
简而言之，对每批96个40μl等份试样执行以下步骤；部分批次(n<96)的处理相同：
a)96-位置板(8x12个位置，PN：W000059X，威尔穆特，巴塞罗那，西班牙)，具有预先订购的和40μl的等份试样(0.65ml的冷冻管，PN:W2DST，威尔穆特，巴塞罗那，西班牙)，其构成将分析批次从-80℃的存储中取出，放在BRAVO平台(定轨振荡器)上，涡旋20分钟以帮助解冻。当解冻后，将小瓶开盖(手动地)。
b)同时，
a.从-20℃的储藏室中，取出准备好的SIL-IS等份试样进行热调节，然后将SIL-IS涡旋(1分钟)和超声处理(5分钟)，然后将合适的体积放在一根柱子中(8孔)的聚丙烯(PP)96孔板。然后将SIL-IS板放在BRAVO平台(在4℃下的Peltier)上。
b.从-20℃的储存库中，取出预先准备的专有的[蛋白质沉淀-代谢物提取]配方“崩解”储备液，搅拌，并填充适当体积的PP的96孔板，然后将“崩解”板放在机器人平台上。
c)然后启动Bravo方案，此过程的关键步骤是：
d)从SIL-IS板的填充柱中吸取140μl SIL-IS，然后依次在每个样品瓶中分配10μl。
e)然后将强化样本在平台上以1200rpm的转速涡旋5分钟
f)增加了“崩解”解决方案；样品制备的这一部分在两个单独的步骤中进行
a.第一步：添加200μl“崩解”溶液，然后在平台上以1200rpm的转速涡旋1分钟，
b.第二步：添加140μl“崩解”溶液，然后以1000rpm涡旋4分钟
g)然后将样品板从BRAVO机器中取出并在4℃下涡旋10min，然后超声处理2min
h)将样本板转移到冰箱中，将其在-20℃下保持20分钟，以最大程度地沉淀蛋白质。
i)沉淀后，将样品瓶在4℃下，以8000rpm的速度离心20分钟，然后将其送回BRAVO机器；将样品板放在4℃的Peltier站上。
j)将上清液(即代谢物提取物)分成两个等份分试样，以能够分别分析疏水性化合物和亲水性化合物。至此，将240μl的上清液吸出，然后以120μl分配两次，至单独的PP的96孔板中(重复“样本提取物”板)。
k)然后将样品提取板通过在40℃下真空蒸发60分钟而干燥。通常地，将一块干燥的样本提取板转移到-80℃直至进行进一步分析，另一块样本提取板返回到BRAVO机器进行重新配制，为提取的样本做好LC-MS/MS分析的准备。
鉴于以上例举的方法被用于分析与子痫前期相关的目标代谢物；对于所考虑的健康结果以及相关的相关代谢物，还可以适当采用上述方法的各种变体。非限制性变化包括
-对样品进行预处理，并使用固相萃取代替沉淀法进一步萃取代谢物；机器方案已就位。
-连续添加不同的SIL-IS混合物，例如，需要不同溶解的溶剂的SIL-IS。
8.使用特定的质量保证方案以避免引入实验偏差，并确保目标代谢物的定量质量。这些方案定义例如：分析批次大小和批次组成、质量控制样品的数量和类型、数据读出的接受标准、操作员盲目性、设计功能强大的研究、选择适当的研究样品。为了避免实验偏差，使用特定方法将研究样本随机化。然后使用适当的统计检验确认样本顺序中没有偏差。在对质谱数据进行信号处理后，将使用特定的分析后质量方法来评估每种目标代谢物，整个临床研究中的数据缺失率，是否存在任何(不必要的)实验偏差，最终的信号漂移以及所选量读数的适当性(即“代谢物定量离子/所选SIL-IS定量离子比例”)。必要时，可以选择其他定量读数。常规执行分析物定量检查，以定量其稳定性和可靠性。在这种情况下，如果观察到一些日间批次漂移可以进行适当的校正。为每种目标代谢物建立了适当的量化指标。在进行质量控制和选择最可靠的量化指标之后，将使用可用的QC样本和/或重复测量，通过计算方差系数(％CV)来评估每种代谢物定量的不精确性。
9.一组选择标准(“质量阶段门标准”)的应用，用于确定哪些目标代谢物可以进行生物标记物性能分析。通常但非限制性地，考虑精度、特异性和缺失标准。或者，也可以考虑缺失值的推算[35]。通常的精度极限的实施例是例如，％CV<＝15％，或<＝20％CV或<＝25％。为每个生物样本研究专门建立了适当的质量阶段门标准，每个目标代谢物可能会有所不同。此步骤将定义哪些目标代谢物可进行下一步，并将其用于多组分预后/诊断测试发现中；其根据生物样本的研究而有所不同。
10.鉴于进行生物标记物分析，使用方法来预处理目标代谢物的定量数据。通常地，这些方法涉及测试是否需要进行数据转换(例如对数转换以获得正态分布)，以及在必要时进行数据转换。其他方法将测试是否需要对代谢物生物标记物读数进行校正，在必要时进行校正，例如根据患者或取样特征来调节代谢物读数，而与所研究的预后或诊断问题无关。通常但非限制性地，这些方法涉及测试代谢物定量的中位数的倍数，在必要时建立代谢物定量的中位数的倍数。对这些因素的校正，旨在减少样本之间/患者之间的差异。在某些情况下，可能需要对代谢物定量进行二分法或分类。为每个生物样本研究专门建立了适当的数据转换和适当的校正，其根据每种目标代谢物可能会有所不同。
a)对数-转换：
对于所选目标代谢物(实施例10)，在建模之前对定量读数进行了对数转换；实施例8中显示的数据除外。
b)多种手段–转换：
每种分析物定量对常见患者特征(例如临床中心、超重或取样时的胎龄)的依赖性。使用中位数倍数(MoM)方法对确实显示对这些因素有显著依赖性(Mann-Whitney U检验、Spearman相关性、Benjamini、Hochberg和Yekutieli，p<0.01)的分析物进行归一化。对以下目标代谢物进行了多次均值校正：
表5A
变量 临床变量
TR 样品采集中心
S-1-P 样品采集中心
Sa-1-P 样品采集中心
s-ENG 取样时的bmi(对数)
1-HD 取样时的bmi(对数)
L-GLU 取样时的bmi(对数)
2-MGA_GLU 取样时的bmi(对数)
L-ERG 产妇年龄(对数)
DHA 产妇年龄(对数)
PIGF 取样时的胎龄(对数)
使用质谱平台量化的所有所选目标代谢物，均用作预测疾病预测模型的预测因子。对于MoM归一化变量，无论是非归一化变量还是归一化变量，均被视为计算疾病预测模型的预测因子。
c)数据二分法：可替宁
可替宁(COT)是烟草中发现的一种生物碱，也是尼古丁的主要代谢物。可替宁的体内半衰期约为20小时，通常在使用烟草后几天(长达一周)即可检测到。血液、唾液和尿液中的可替宁水平与烟草烟雾暴露量成正比，因此它是包括二手烟(被动烟)在内的烟草烟雾暴露的重要指标[36]。尽管吸烟是预测子痫前期的目标危险因素[37]，但它可能易于漏报。在这项研究中，对可替宁进行了分析，以评估吸烟状况并评估其是否与SCOPE内报告的吸烟状况相关。在所考虑的数据集中，可替宁的存在确实与吸烟状况有关。该分析物的读数丢失率确实与报告的“妊娠早期(类别)每天的香烟数量”相关(卡方检验，p<0.05)。
外源性分析物(例如可替宁)，在许多患者中无法量化。缺乏定量分析通常与缺乏暴露有关。因此，与血液中分子的实际浓度相比，分子的可检测性可能是更好的生物标记。可替宁的情况就是这样，其血液中的存在表明吸入了香烟烟雾。因此，对可替宁的(相对)定量进行了二值化，未定量可替宁的样品和低可替宁值的样品的分数为0。高可替宁浓度的样品的分数为1。预测患者是否吸烟的准确性被用来定义最佳可替宁的相对浓度截止值。该截止值对应于可替宁分布中的低密度，其表明分数的可靠性。
11.在多组分预后/诊断测试发现中，一组特定的测量值的选择将被视为输入变量(或推定的预测变量)。这组变量将构成在上一步中生成的预处理的代谢物定量数据，并且可以使用相关的非代谢变量进行补充，以供研究生物样本使用。例如，当目标是创建多成分风险分层测试(或预后测试)以确定个人将获得(或未获得)医疗状况的概率时，这些非代谢变量可能构成，例如但不限于，取样时收集的或在(医学)记录中可用的相关(临床)风险因素，或相关的，公认的临床测试结果(例如葡萄糖测量结果)或其他类型相关推定的定量数据生物标记分子，例如蛋白质、DNA、RNA等，可用于同一样本/发起者个人。根据研究和多组分预后/诊断测试发现的特定目标，专门确定适当的一组非代谢变量的选择。由于申请人专门着手寻找子痫前期的预后测试，该预后测试可以由一线护理提供者和/或资源有限的医疗保健系统容易地实施，且结果可靠，因此仅选择这些行之有效且易于获得的临床风险因子。出于同样的原因，明确并专门排除了以下类型的变量：容易出错的患者数据，例如但不限于，详细的生活方式变量或详细的病史数据，以及需要专业人员收集的变量，例如但不限于：通过多普勒超声(子宫动脉多普勒)评估子宫胎盘血流量及其派生参数，如搏动指数或阻力指数。尽管这些子宫胎盘血流指标与子痫前期风险相关，但它们仍需要专业的超声检查师和先进的超声设备。由于目标代谢物通常将在临床实验室环境中确定，因此还应考虑可以在临床实验室环境中评估的，并且已广泛报道与子痫前期风险相关的实施例性变量，因此选择了3种特定蛋白质的测量值作为其他输入变量。下面给出了子痫前期研究中应用的非代谢物输入，作为通常但非限制性的例子。
a)第一sbp：在采血时的第一收缩BP(mm Hg，血压计)
b)第一dbp：在采血时的第一舒张BP(mm Hg，血压计)
c)map第一：在采血时的第一MAP(平均动脉压)BP
d)第二sbp：在采血时的第二收缩BP(毫米汞柱，血压计)
e)第二dbp：在采血时的第二舒张BP(mm Hg，血压计)
f)map第二：在采血时的第二MAP(平均动脉压)
g)年龄：参加者年龄
h)fh_pet：早产子痫前期(PE)的家族史，即参与者的母亲或姐姐曾经患有PE
i)wgt：在采血时(公斤)
j)bmi：在采血时的BMI
k)腰围：采血时的腰围(cm)
l)cig_1st_trim_gp：前三个月(类别)每天的香烟数量1-5支香烟/6-10支香烟/>10支香烟
m)妊娠期：采血时的妊娠
n)r_葡萄糖：采血时通过血糖仪测量的随机(非禁食)葡萄糖(mmol/L)
研究发现与子痫前期有关的三种血源性蛋白质生物标记物，即
o)PIGF：胎盘生长因子(PIGF、PGF(基因))，
p)sFlt1：类似酪氨酸激酶1的可溶性fms(sFlt1、FLT1(基因))，以及
q)s-ENG：可溶性内皮糖蛋白(s-ENG、ENG(基因))[38]。
这些蛋白生物标记物，是在SCOPE研究中使用ELISA测定法，对推定蛋白生物标记物进行大规模评估的一部分。[24]这3种蛋白质也被认为是该疾病预测模型计算的预测因子。
B)统计方法基于以下
1.单变量分析
针对所有所选输入变量，评估了使用单变量方法确定用于区分(未来)病例与(未来)对照的预后和/或诊断价值。该方法不限于2类。通常但不限于，应用接收工作曲线(AUROC)下的区域来量化每个所选输入变量的区分性能。AUROC的95％的置信区间下限大于或等于0.5的输入变量被标识为目标结果的单个生物标记。其他统计检验，例如但不限于，t检验、Mann-Whitney检验、卡方检验和Fisher精确检验，可用于识别目标的单个预测因子。其中p值<＝0.05通常被认为是显著的。当认为相关时，这些方法还会考虑多次测试的校正(例如Bonferroni、Holm或Hochberg校正)。在适当的情况下，执行单变量逻辑回归，以确定所选输入变量是否是所考虑结果的危险因素；至此，建立了与输入变量的单位增加/减少相关的比值比。通常但不限于，这些单位以标准差(例如+/-1SD，+/-2SD等)或分位数表示。实施例3给出了目标变量的单变量性能。
2.开发多变量模型：
申请人认识到，预测个人将来健康状况的风险(或概率)的预测分类器的相关性在很大程度上取决于这些分类器的预测价值满足医疗保健提供者和/或医疗保健系统所确定的临床要求的程度。
然而，不同的临床环境对分类器的要求可能具有不同要求。例如，某些临床环境将主要集中于寻找未来健康结果风险升高的个体。对于这些风险升高的个体，可以提高护理水平，和/或可以采取预防性治疗。在其他情况下，识别未来风险降低的个体更合适，例如，使某些护理途径的合理化。在某些情况下，两个分类器问题都会引起关注。
另外，或可备选地，未来健康状况可能存在不同的亚类型(或等级)，例如在结果严重性方面。对分类器的要求可能会因结果子类型而异。另外，或可备选地，可能存在个体亚组，其表现出不同的先验风险数据，和/或更倾向于结果或其任何子类型。再次，分类器的临床要求可能会因个体亚组而异。因此，本申请人采用最佳子集回归方法，使用一种或多种与变量和结果的输入相关的多变量建模技术，来创建所有可能的多变量预测模型的空间(例如，连续或分类)。通过这样做，一个人有可能同时解决多个分类器问题和/或分类器需求问题，前提是该研究必须足够大且针对的目标人群具有代表性，并且只要输入变量携带的预后信息以及它们的组合确实支持发现此类分类器。例如，对于风险的二进制分类器，可以应用PLS-DA、逻辑回归、分数多项式。根据手头的问题和可用的研究规模，每个模型允许的变量数量可以变化。通常但不限于，模型空间由例如1至3、1至4、1至5或1至6变量的所有组合构成。另外，例如通过应用交叉验证，应用方法以确保仅考虑统计上稳健的多变量分类器。下面详细说明用于创建子痫前期研究的综合模型空间的方法。
对于一到四个预测变量的每种可能组合，使用已知病例和控制模型训练模型，使用逻辑回归或偏最小二乘判别分析(PLS-DA)预测结果。计算了三种结果模型，分别是子痫前期、足月子痫前期和早产子痫前期。对于足月子痫前期的结果，对没有子痫前期的患者(对照)和具有子痫前期并在孕周为37周或更晚时间分娩的患者，进行了模型训练和测试。对于预后子痫前期的结果，模型针对未发展为子痫前期的患者(对照组)和子痫前期并在孕周以下37周分娩的患者进行了训练和测试。对患者的选择是为了考虑子痫前期的低发病率和子痫前期患者在研究数据集中的过度代表性。
对于每个模型，都可以得出一系列统计数据，以评估其区分性能和临床相关性。这些统计数据是：
-AUC和(95％CI)
-PPV(95％CI)处的敏感性
-NPV(95％CI)处的特异性
-敏感性达80％(95％CI)处的特异性
-敏感性为90％(95％CI)处的特异性
-敏感性为80％(95％CI)处的特异性
-敏感性为90％(95％CI)处的特异性
-对照数量(全病例)
-病例数(全病例)
CI代表置信区间。
3.可靠的变量预后组合/预后核心的选择：
这些统计信息是在三次交叉验证的三个迭代中为测试集计算的。生成了三个迭代中每个统计量的平均值，并使用下一段阐述的改进标准进行模型选择。
此外，还将生成所有上述统计信息以及完整的样本集。在以后的病例中，对所有对照和病例进行了模型训练和评估。为了控制过度拟合，仅将“均值”(参见3倍交叉验证)和“完整”的相应AUC度量值之差<＝0.1的模型保留在模型空间中。
此外，还清除了“均值”或“完全”中，AUC统计量的下限为95％的置信度(ICI)低于<＝0.495的模型。
为了获得统计上可靠的结果，选择预后模型/预后核心通常是基于对95％的置信度(ICI)下限的评估，该评估是使用3倍交叉验证得出的“均值”统计量计算得出的。为了确保选择稀疏模型，使用3倍交叉验证得出的“均值”统计数据计算出的改进也作为选择标准。
出于报告目的，使用为完整数据集计算的统计数据。实际上，由于使用了保守的建模和选择方法，很少或几乎没有观察到过拟合。
记录：
-尽管通过逻辑回归或偏最小二乘判别分析(PLS-DA)建立了全面的模型空间，但对于该应用，仅考虑了遵循PLS-DA的预后模型/核心(为了简化报告)。尽管逻辑回归和PLS-DA的单个预后模型的统计数据可能不同，但这两种方法都导致基本选择相似的预测变量组合，并且潜在的预后预测核心基本相同。
-对于本申请中考虑的子痫前期研究，4种变量/模型通过以下项进行限制：1)识别稀疏预后核心的期望；2)早产PE的受限统计能力；3)当考虑四个以上的变量时，在子痫前期数据集中举例说明的观察中，几乎没有额外的“改进”。
为了在所创建的全面预后模型空间内识别相关的预后核心，发明人建立了逻辑规则以估计模型的相关性。重要的是，评估其构成输入变量中的每种变量是否对模型的判别性能有所贡献。为了对此进行估算，针对所考虑的每个统计数据，计算出该模型与其母模型之间的最小性能差异。母模型是指所有的1)变量少于所讨论模型的变量，2)变量均为所讨论模型的变量的模型。计算出的差异称为“改进”。出于预后核心所选目的，只有“改进”高于给定正阈值的模型，才被认为具有相关性。对于本文报道的子痫前期研究，应用了一系列改善；在剩余部分中缩写为“Imp”。
4.模型空间
对于本申请中考虑的子痫前期研究(实施例1)，对于所研究的3个结果中的每个结果，针对一到四个预测变量的每种可能，组合计算模型(参见上面)。在生成的PLS-DA模型空间中，>256.000个模型符合实施例15中提到的基本性能要求。
然后，发明人着手发现变量的非平凡(non-trivial)核心组合，并具有如实施例1所述的每个性能目标的预测优点。为此，使用95％的置信区间的下限过滤模型空间(ICI)，所述95％置信区间(ICI)的下限是使用相关统计数据的3倍交叉验证导出的“平均值”计算的，以及针对每种PE子类型(所有的PE，早产PE和足月PE)的每个性能目标(AUC、纳入、排除)的改进，使用导出的3倍交叉验证来计算改进。人工调整过滤阈值，以产生2到4种变量(模型)的核心组合的有限集合(通常在20到60之间)。发现这足以识别出始终有助于性能模型的这些变量。这些变量和/或其特定组合，构成了与子痫前期风险预测相关的预后核心。如本申请书中其他地方所述，变量的预后核心可能会有所不同，具体取决于所考虑的PE子类型和/或是否具有一般的预后性能(AUC)、高风险预测(“纳入”、FPR-或PPV-阈值的敏感性)，或低风险的预测(“排除”；FNR或NPV阈值的特异性)。为了进行报告，在“完整数据集”内获得的相关统计数据，当其在考虑过滤阈值时，从此处缩写为“完整”。
5.具有临床意义的模型的识别过程
a)一般的预后性能
通常但不限于，使用接收器工作特征下的表观面积(AUROC；也称为c统计)曲线，估算(多变量)分类器的预后性能。ROC曲线遵循对研究中分类器获得的所有测试值的敏感性和特异性的计算。在ROC曲线中，真阳性率(灵敏性)被绘制为分类器不同界点的假阳性率(100-特异性)的函数。ROC曲线上的每个点，代表一个对应于特定决策阈值[敏感性-特异性]对。ROC曲线下面积(AUC)，是衡量参数区分两个诊断组((未来)病例/(未来)非病例)的程度。敏感性(Sn)等于真实阳性率，特异性(Sp)等于真实阴性率。AUROC被认为是对预后测试性能的一种度量，范围从0.5(非歧视性测试，对角线)到1(对未来病例和对照，均能完美区分的完美测试)。AUROC越高，分类器越好。在本文应用的方法的框架内，将在模型空间中搜索模型，这些模型首先产生可靠的AUROC等于或高于预设AUROC阈值，其次使AUROC最大化。另外，稀疏模型(构成最少数量的变量)与非稀疏模型相比更为优选。这转化为附加标准，该标准确定具有(n+1)种变量的模型，与其特定的具有n种变量的母模型相比，应具有改进的性能，如由特定的“改进”量所定义的。
使用此过程，还可以找到“预后核心”，即，所考虑的健康结果具有特殊预后价值的特定变量组合：通过全面地评估通过上述过程所选模型的构成变量，人们能够识别变量的反复组合。这种反复组合被认为是“预后核心”。
尽管上述用于识别预后模型和/或预后核心的方法的集合涉及对许多个体的群体及其多个特征(即变量)的研究，由此产生的预后测试在单个个体的水平上具有适用性。在与研究人群中的个体相似的任何个体中(例如，子痫前期的预后情况：该个体已妊娠且未表现出子痫前期的临床症状)，现在可以根据所识别的预后模型/核心来确定例如但不限于特定的非明显血液传播代谢物组合的水平/值，使用所识别的预后模型/核心来计算个体风险分数，以及将该风险分数转换为未来时间框架内发生的结果的概率(风险)。实施例4中提供了基于AUROC的预后核心实施例。
b)预后性能-“纳入”和“排除”测试
临床决策和获得某些临床护理途径主要取决于在预期使用人群水平上权衡收益与成本。对于所谓的“纳入”测试，需要权衡及早发现罹患这种疾病的人的风险(真阳性)的好处与错误地将个人识别为高危个体(假阳性)的代价。反之亦然，对于“排除”测试，权衡找到真阴性的好处与将假阴性错误识别为低风险的代价。
b.1)基于经典解释的方法；
传统上，为了识别高风险人群，通常地将假阳性率(FPR，1-特异性)锁定在目标值，然后对于任何给定的分类器，观察ROC曲线与特异性标准的交叉敏感性(未来病例的检出率)[39][40]。相反地，为了确定低风险人群，通常将假阴性率(FNR，1-敏感性)锁定为目标值，然后对于任何给定的分类器，观察在哪种特异性下(检测未来的非病例)，ROC曲线与FNR标准交叉以识别低风险人群。通常地，首先会开发出一个预测模型，该模型将AUROC最大化，然后以设定的标准下建立其估计的检测率。但是，当预期的临床应用为纳入或排除时，具有较高AUROC的预后模型并不总是最佳模型。
不同的是，当临床应用需要纳入的预后测试时，本申请中详细阐述的方法确实允许在预设的FPR标准下识别具有异常未来病例检测率的预后模型和/或预后核心。类似地，当临床应用需要排除预后测试时，该方法将能够在预设的FNR标准下识别具有异常的未来非病例检出率的预后模型和/或预后核心。然后，在这个空间内，将识别那些在给定的预设标准下最大化检出率的预后模型和/或预后核心，而不是仅仅关注AUROC。值得注意的是，这也支持了申请人所认识到的概念，即构成具有优异的纳入优点的预后测试的特定变量组合，不一定是构成具有优异的排除预后测试的变量的相同组合。
b.2)基于最新解释的方法
统计数据AUROC、Sn和Sp，被认为是与发病率无关的统计信息，[41]然而，患病率(或发病率；取决于应用)在评估预后测试的临床有效性时是很重要的。[42]当在临床相关情况下评估/应用预后测试时，考虑到疾病患病率(或发病率)的指标(例如阳性和阴性预测值(PPV和NPV))更为合适[43]。在这里，PPV对应于，在测试结果为阳性(真阳性+假阳性(FP))的所有患者组中实际会发展成疾病(TP，真阳性)的患者比例。NPV对应于在测试结果为阴性(真阴性+假阴性(FN))的所有患者组中实际上不会发展成病症(TN，真阴性)的患者比例。
容易理解的是，预测值是分类器性能的重要决定因素，因为预测值可以量化与预后测试结果后临床途径改变相关的“成本”。出于说明目的，考虑以下假设方案。如果可用的预防性治疗的总金钱成本(和/或因例如不良副作用而导致的健康成本)很高，则医疗保健系统可能会基于成本效益分析，确定其可以支持治疗患病机会为1:5高风险人群，(即，至少五分之一的人会有效地患病(并需要进行治疗)，而五分之四的人为假阳性，因此将不必要地提供治疗)。该标准转化为预后测试，应选择PPV＝0.2的高风险人群。
在这种情况下，从健康经济学的角度出发，将PPV＝0.2的50％的未来病例分类为高风险组的测试，(从健康经济学的角度来看)被认为比对PPV＝0.1的高风险人群中75％的未来病例进行分类的测试更好。后者相当于每个“真阳性”的“假阳性”成本为9，在预防性治疗成本很高的医疗保健系统中，这被认为不符合目的。这也限制了ROC曲线分析的用途，因为ROC曲线分析广泛用于评估预后测试。
为了克服这个问题，申请人开发了统计方法，以将这两种观点与预后测试性能无缝地联系起来：在接收器工作特性(ROC)空间中绘制PPV或NPV标准的能力，这些标准解释了普遍性[27]。这种新颖的方法论于2017年11月发布，可以被认为是最新技术。因此，该方法论整体上被认为是本申请的组成部分[27]。
通过集成这种新颖的统计方法，本申请中概述的方法，特别适合于识别具有临床实用性的预后模型和/或预后核心。当临床应用需要控制假阳性比例的纳入预后测试时，它们可以按照预先设定的PPV标准，以优异的未来病例检出率，来识别预后模型和/或预后核心。
类似地，当临床应用需要控制假阳性比例的排除预后测试时，这些方法将能够以预先设定的NPV标准，以优异的未来非病例检出率识别出预后模型和/或预后核心。同样，这些方法利用了全面的预测模型空间的建立，以及其中特定成功标准的应用。然后在模型空间内，将识别那些在给定的预设预测值标准下，最大化检出率的预后模型和/或预后核心，而不仅仅关注于AUROC。明显地，这也支持了申请人所认识到的概念，即构成针对给定的PPV标准优化的预后测试的特定变量组合，不一定是构成针对给定的NPV标准优化的预后测试的变量的相同组合。
通过扩展，针对给定PPV标准进行纳入测试的优化的预后模型和/或预后核心，对于为给定的FPR标准进行了优化的纳入检验，不一定与预测模型和/或预测核心构成相同的变量。排除测试(NPV标准与FNR标准)也是如此。实施例5中考虑了子痫前期的优选的纳入核心；实施例6中详细地说明了优选的排除核心。
鉴于以上发现特定组合的方法集合涉及对许多个体的人群及其多重特征(即变量)的研究，所得的预后测试在单个个体的水平上具有适用性。在与研究人群中的个体相似的任何个体中，可以根据所确定的预后模型/核心确定特定变量的水平/值，并使用所确定的纳入(或排除)来计算个体风险分数预后模型/核心。然后，根据使用本申请中阐述的方法集合建立的纳入(或排除)进行分类，人们将评估该风险分数是高于还是低于预先设定的阈值，由此该阈值将分类定义为“测试阳性”或“测试阴性”。结果，如果他/她将在特定的未来时间范围内(纳入)发生结果的风险升高(高风险)，或者如果他/她在特定的未来时间范围(排除)中发生结果的风险降低(低风险)，人们将能够确定任何这样的个体。
b.3)基于“超越现有技术”的方法
上面的段落清楚地表明，将PPV和/或NPV标准的使用整合在一起，以找到预后模型和/或预后核心的方法，特别适合于识别具有临床意义的预后性能的预后测试。
当临床要求需要对特定PPV进行纳入测试进行预后测试时，随着结果患病率(或发病率)的降低，此类测试要符合所述特定PPV目标的成对[敏感性和特异性]要求变得越来越严格；以至于这种分类器的存在变得不太可能。同时，可以理解的是，在临床实践中，预后纳入测试对目标人群中具有低发病率(发病率)的健康结果最有用。
相反地，当临床要求需要对特定NPV进行排除测试进行预后测试时，随着结果患病率(或发病率)的升高，此类测试要符合所述特定NPV目标的成对[敏感性和特异性]要求变得越来越严格；同时，可以理解的是，在临床实践中，预后排除测试对结果最有用，而这些结果在目标人群中是相当常见的。。
面对这个问题，其实质上阻碍了对许多健康结果的临床意义的预后测试的发展，发明人提出了一种可以克服该障碍的方法。
适用于纳入预后测试的过程：
鉴于临床上需要预后测试，以便为未来病例提供最低检出率(Sn，检验>＝Sn，目标)，对于具有最低患病率(或发病率)的健康结果具有预先设定的PPV阈值(PPV检验>＝PPV阈值)，该过程涉及以下离散步骤，以建立这种预后性能：
1)使用如前所述的方法，为给定的研究人群(研究-Pop1)创建可能的预后模型的第一全面的模型空间(模型-S1)。
2)定义可能被误分类为低风险的未来非病例的“可允许的”概率(FNR允许)或比例(NPV允许)。
3)确定预后排除模型和/或预后核心，在模型-S1中，它最大化了与上一步中定义的排除标准((FNR允许)或(NPV允许))相符的特异性Sp(或未来非病例的检出率)。
4)选择上一步确定的适当的排除模型(分类器排除)，并将其应用于研究人群(研究-Pop1)；得到确定的低风险人群(PopLR)，所述低风险人群符合假阴性的预先指定数量(FNR允许)或比例(NPV允许)，是真实阴性的很大一部分，即未来的非病例。从最初的研究人群中清除该人群，以生成一个新的研究人群(研究-Pop2)，其中(研究-Pop1)–(PopLR)＝(研究-Pop2)。值得注意的是，与最初的研究-Pop1相比，新的研究的研究-Pop2在未来病例中的患病率(或发病率)更高。
5)使用上述方法为新的研究人群(研究-Pop2)创建可能的预后模型的第二全面的模型空间(模型-S2)。
6)识别纳入模型和/或预后核心，在模型-S2中，其最大化符合阈值PPV标准(PPV阈值)的敏感性Sn(或未来病例的检测率)。与研究-Pop1相比，由于研究-Pop2在以后的病例中的患病率(或发病率)更高，因此更容易找到满足符合特定PPV阈值所需的成对[敏感性和特异性]要求的分类器。
7)选择上一步中确定的合适的纳入模型(分类器纳入)，该模型可以为以后的病例提供检测率，在对允许的误分类进行校正后(参见步骤2和3)，可以达到目标敏感性，即Sn，检测>＝Sn，目标。
该过程的结果是一对特定的预后模型(或预后核心)，即一个特定的排除模型和特定的纳入模型，当联合和顺序地应用时，它们将提供优异的纳入预后性能，根据临床要求进行预后纳入测试。
为实现临床相关的预后纳入性能而概述的过程，构成了本申请中详述的有关识别非明显预后组合的方法的组成部分。子痫前期的排除/纳入核心的实施例性组合，在本申请的随后的实施例7中公开。
适用于排除预后测试的流程
根据临床需要进行预后排除测试，以便为未来的非病例(Sp，检测>＝Sp，目标)提供最大的检出率，对于预设的NPV阈值(NPV检测>＝NPV阈值)，以确保具有中到高患病率(或发病率)的健康结果，该过程涉及以下离散步骤以建立这种预后性能：
1)使用如前所述的方法，为给定的研究人群(研究-Pop1)，创建可能的预后模型的第一全面的模型空间(模型-S1)。
2)定义可能被误分类为高风险的未来非病例的“可允许的”概率(FNR允许)或比例(NPV允许)。
3)确定预后纳入模型和/或预后核心，在模型-S1中，它最大化了与上一步中定义的纳入标准((FNR允许)或(NPV允许))相符的特异性Sn(或未来非病例的检出率)。
4)选择上一步确定的适当的纳入模型(分类器排除)，并将其应用于研究人群(研究-Pop1)；得到确定的高风险人群(PopHR)，所述高风险人群构成假阳性的预先指定数量(FNR允许)或比例(NPV允许)，是真实阳性的很大一部分，即未来的病例。从最初的研究人群中清除该人群，以生成一个新的研究人群(研究-Pop2)，其中(研究-Pop1)–(PopHR)＝(研究-Pop2)。值得注意的是，与最初的研究-Pop1相比，新的研究研究-Pop2在未来非病例中的患病率(或发病率)更高。
5)使用上述方法为新的研究人群(研究-Pop2)创建可能的预后模型的第二全面的模型空间(模型-S2)。
6)识别排除模型和/或预后核心，在模型-S2中，其最大化符合阈值PPV标准(PPV阈值)的敏感性Sn(或未来病例的检测率)。与研究-Pop1相比，由于研究-Pop2在以后的病例中的患病率(或发病率)更高，因此更容易找到满足符合特定PPV阈值所需的成对[敏感性和特异性]要求的分类器。
7)选择上一步中确定的合适的排除模型(分类器排除)，该模型可以为以后的病例提供检测率，在对允许的误分类进行校正后(参见步骤2和3)，可以达到目标敏感性，即Sn，检测>＝Sn，目标。
该过程的结果是一对特定的预后模型(或预后核心)，即一个特定的纳入模型和特定的排除模型，当联合和顺序地应用时，它们将提供优异的排除预后性能。
值得注意的是，这些详细的逐步过程利用了发明人认识到的概念，即构成具有特殊排除优点的预后测试的特定变量组合，不一定是构成预后测试且具有特殊排除优点的变量的相同组合。此外，与最初的测试人群(研究-Pop1)相比，移出特定的几组个体后，暂住人群(研究-Pop2)的特征将有所不同。结果，各个全面的模型空间内的预测模型，即模型-S1和模型-S2)可能不同。
鉴于以上发现特定组合的方法集合涉及对许多个体的人群及其多重特征(即变量)的研究，所得的预后测试在单个个体的水平上具有适用性，所述特定组合包括：(1)纳入预后模型和/或预后核心，以及2)排除预后模型和/或预后核心(反之亦然)。在与研究人群中的个体相似的任何个体中，可以根据第一确定的预后模型/核心确定特定变量的水平/值，并使用确定的排除(或纳入)的预后模型/核心，来计算个体风险分数。然后，人们将评估该风险分数是高于还是低于预先设定的阈值，由此该阈值根据使用本申请阐述的方法的集合建立的纳入(或排除)分类，以“测试阳性”或“测试阴性”分类。如果个体被分类为“测试阴性”，则可以根据第二确定的预后模型/核心确定特定变量的水平/值，并使用确定的纳入(或排除)预后模型/核心计算个人风险分数。通过执行这两个连续的步骤，如果他/她将在特定的未来时间范围内(纳入)发生结果的风险升高(高风险)，或者如果他/她在特定的未来时间范围(排除)中发生结果的风险降低(低风险)，人们将能够确定任何这样的个体。
值得注意的是，与两个独立分类器相关的变量可以在一次分析中确定，并且在适当时将其水平/值用于分类。同样地，可以计算连续的风险分数，“测试阳性”/“测试阴性”的描述以及最终风险分类，即处于高风险(纳入)或处于低风险(排除)，可以在单个计算过程中执行。
b.4)预后性能–通过顺序分类器的过程使性能最大化。
在某些情况下，鉴于实现与满足临床实用性要求有关的目标，发明人发现上述概念的进一步扩展可以提供优异的预后性能。
根据临床上需要预后测试，以提供未来病例的最大检出率(Sn，测试最大值)，对于预设PPV阈值(PPV测试>＝PPV阈值)或(/和)，预后测试可以提供未来非病例的最大检出率(Sp，测试最大值)，对于低发病率(或发病率)的健康结果的预设NPV阈值(NPV检测>＝NPV阈值)，该过程涉及以下离散步骤以确保建立这种预后性能：
1)使用如前所述的方法，为给定的研究人群(研究-Pop1)创建可能的预后模型的第一全面的模型空间(模型-S1)。
2)
a.在研究-Pop1中确定一个分类器，该分类器确定符合PPV阈值的高风险子群体(PopHR1)(前进至3.a))，或者
b.在研究-Pop1中确定一个分类器，该分类器确定符合NPV阈值的低风险子群体(PopLR1)(前进至3.b))。
3)
a.从最初的研究人群中清除该人群，以产生一个新的研究人群研究-Pop2，其中(研究-Pop1)–(PopHR1)＝(研究-Pop2)。值得注意的是，与最初的研究-Pop1相比，新的研究-Pop2在未来的非病例可以有效富集。如果后面的研究-Pop2人群也符合预设的NPV标准，则当达到预设的目标时，分类过程将停止。否则，进行下一步。
b.从最初的研究人群中清除该人群，以产生一个新的研究人群(研究-Pop2)，其中(研究-Pop1)–(PopLR1)＝(研究-Pop2)。值得注意的是，与最初的研究-Pop1相比，新的研究研究-Pop2在将来的病例可以有效富集。如果后面的研究-Pop2人群也符合预设的PPV标准，则在达到预设目标时，分类过程将停止。否则，进行下一步。
4)使用前面描述的方法，为新的研究人群(研究-Pop2)创建可能的预后模型的第二全面模型空间(模型-S2)。
5)
a.在研究-Pop2中确定一个分类器，该分类器确定符合PPV阈值的高风险子人群(PopHR2)并将此新子人群添加到PopHR1中，以创建PopHR_总的(前进至6.a))，或者
b.在研究-Pop2中确定一个分类器，该分类器确定符合NPV阈值的低风险子人群(PopLR2)，并将此新子人群添加到PopLR1中，以创建PopLR_总的(前进至6.b))。
6)
a.从(研究-Pop2)人群中清除该人群，以生成一个新的研究人群(研究-Pop3)，其中(研究-Pop2)–(PopHR2)＝(研究-Pop3)。值得注意的是，与研究-Pop2相比，新的研究研究-Pop3在将来的非病例中可以有效富集。如果后面的研究-Pop3人群也符合预设的NPV标准，则当达到预设的目标时，分类过程将停止。否则，进行下一步。
b.从最初的研究人群中清除该人群以产生一个新的研究人群(研究-Pop3)，其中(研究-Pop2)–(PopLR2)＝(研究-Pop3)。值得注意的是，与研究-Pop2相比，新的研究研究-Pop3在将来的病例中可以有效富集。如果后面的研究-Pop3人群也符合预设的PPV标准，则当达到预设的目标时，分类过程将停止。否则，进行下一步。
7)重复步骤4到6，直到将来病例的最大检出率(Sn，测试最大值)可以使用，对于预设的PPV阈值(PPV检测>＝PPV阈值)或(/和)，对于预设的NPV阈值(NPV检测>＝NPV阈值)，可用于研究个体的变量来实现。
该过程的结果是一个特定的总分类器，该分类器由一组预后模型(或预后核心)组成，当联合和顺序地应用时，它们将提供优异的纳入和/或排除预后性能，根据临床要求进行风险分类。
值得注意的是，在此过程的应用中，可以随时选择纳入分类器或排除分类器。换句话说，为了获得所期望的预后分类性能，应始终采用最佳分类器，因此可能但并非必需地，在纳入分类器和排除分类器之间进行交替。
此外，为了符合预设的PPV和/或NPV要求，各自的最终PopHR_总的＝PopHR1+PopHR2+…+PopHRn和/或PopLR_总的＝PopLR1+PopLR2+...+PopLRn符合预设标准就足够了；临时分类可能会偏离设置的阈值。
为实现临床相关的预后纳入表现而概述的过程，构成了本申请中详细描述的，非明显预后组合识别方法的组成部分。早产子痫前期的多种预后分类器的优选组合，将在本申请的稍后的实施例8中公开。
鉴于以上发现特定组合的方法集合涉及对许多个体的人群及其多重特征(即变量)的研究，所得的预后测试在单个个体的水平上具有适用性。在与研究人群中的个体相似的任何个体中，可以根据第一确定的预后模型/核心确定特定变量的水平/值，并使用所确定的预后模型/核心计算个体风险分数。然后，人们将评估该风险分数是高于还是低于预先设定的阈值，由此该阈值根据使用本申请阐述的方法集合建立的分类(纳入或排除)，以“测试阳性”或“测试阴性”分类。当将个人分类为“测试阳性”时，将报告相应的结果(根据所应用的分类器，将个人分类为高风险还是低风险)。在这种情况下，将个体分类为“测试阴性”，可以根据第二确定的预后模型/核心确定特定变量的水平/值，并使用确定的纳入(或排除)预后模型/核心来计算个体风险分数。然后，人们将评估该风险分数是高于还是低于预先设定的阈值，由此该阈值根据使用本申请阐述的方法集合建立的分类(纳入或排除)，以“测试阳性”或“测试阴性”来分类。当在第二步中将个人分类为“测试阳性”时，将报告相应的结果(根据所使用的分类器，将个人分类为高风险还是低风险)。在这种情况下，个人被归类为“测试阴性”，可以根据第三个确定的预后模型/核心确定特定变量的水平/值，并使用确定的纳入(或排除)预后模型/核心来计算个人风险分数，等等。这将重复进行，直到将个人分类为“测试阳性”组或直到为该个人计算出构成“总分类器”的每个分类器的风险分数为止。届时，该个体将被分类为高风险或低风险，或者仍未按照预设的PPV-或/和NPV-标准进行分类。
如果临床要求规定预后测试应同时考虑PPV和NPV标准，则对于预设PPV和NPV标准仍未分类的个体将被视为未分类。
值得注意的是，可以在单个分析中测量与n个顺序分类器相关的变量，并在适当时将其水平/值用于分类。类似地，计算连续的风险分数，“测试阳性”/“测试阴性”的描述以及最终风险分类，即可以在单次技术过程中，执行处于高风险(纳入)、处于低风险(排除)，或未分类(在合并[纳入-排除]标准情况下)。
实施例3-单变量的性能
对于在本申请中阐述的子痫前期的实施例，此处列出了具有所有已考虑变量的单变量性能指标的非限制性表。从下表中可以清楚地看出，根据目标为先兆子痫的类型，不同的变量具有预后相关性。该观察结果支持发明人在本申请中提出的方法。
基于AUC的子痫前期的单标记物预后性能
对于此处考虑的子痫前期类型的每种类型，即“所有的子痫前期”(所有的PE)、“早产PE”和“足月PE”，列出了总结AUC(95％CI)和倍数变化(FC；95％CI)的表格。只有子痫前期预后的结果才被选择为预测(单个)标记物，其变量的下限为AUROC的95％的置信区间的下限，其大于或等于0.50。
所有的PE：
表6所有的PE：基于AUC的单变量预后性能评估。
FC：倍数变化，ICI和uCI：95％的置信区间的上下限。
Figure BDA0002716241410000681
当仅通过AUC评估预后性能时，可以观察到经典的临床因素具有预测所有的PE的有利的单变量预后优点，但是大量目标代谢物也显示出了预后优点。从临床分析的角度来看，倍数变化很重要。考虑到这一点，发现以下一级代谢物与“所有的PE”风险的预后有关(由AUC评估)；相关性排序：DLG、1-HD。
早产PE：
表7早产PE：基于AUC的单变量预后性能评估
Figure BDA0002716241410000691
当通过AUC评估预后性能时，可以观察到经典的临床因素在预测早产PE方面具有有限的单变量预后优点，但是许多目标蛋白质和代谢物显示出显著的预后优点。考虑到AUC和“倍数变化”，发现以下一级代谢物与“早产PE”风险的预后相关(由AUC评估)；相关性排序：DLG、2-HBA。根据这些结果，很明显，DLG对早产PE的预后很高，类似于最著名的蛋白质标记物PIGF。
足月PE：
表8足月PE：基于AUC的单变量预后性能评估
Figure BDA0002716241410000692
Figure BDA0002716241410000701
当通过AUC评估预后性能时，可以观察到经典的临床因素具有预测早产PE的有利的单变量预后优点，但是大量目标代谢物显示出了预后优点。可以注意到，没有一种蛋白具有预测足月PE的预后能力。考虑到AUC和“倍数变化”，发现以下一级代谢物与“足月PE”风险的预后相关(由AUC评估)；相关性顺序：L-ISO、1-HD和DC
实施例4：多变量一般预后性能-AUROC
实施例4A；PE子类型：所有的PE
应用的模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；平均AUC>＝0.65；平均AUC Imp：>＝0.02。
从高到低对完整的AUC进行排名，并选择低至第一单个标记物的模型。
基于此过滤，找到了一组44个多变量模型，参见表9。
Figure BDA0002716241410000702
Figure BDA0002716241410000711
[表9]
预后核心：
由于血压(bp)测量是性能最高的单种变量，因此与血压的组合具有很多功能就不足为奇了。发现以下以血压为中心的2到4个可变的预后核心(按性能顺序)：
1.bp+HVD3，可能会增加WRV(bmi/体重/腰围)和/或PIGF。
2.bp+DLG
3.bp+s-ENG，可能通过1-HD和/或L-ISO增强
4.bp+PIGF
5.bp+WRV(体重/体重/腰围)
另外，还发现了一些没有血压的核心；即
以下3种变量的预后核心；
1.s-ENG+{PIGF或DLG}+{WRV(体重/体重/腰围)或1-HD或fh_pet}
以下4种变量的预后核心；
2.{s-ENG和1-HD}+{PIGF、L-ISO、L-LEU、EPA}中的任何2种变量
总结：
通过AUC评估预后性能时，可以观察到，当将血压测量与HVD3、DLG、s-ENG或PIGF结合使用时，用于预测所有的PE的多变量预后性能符合预设的AUC>＝0.65标准。
通过进一步添加以下任意变量，可以进一步提高预后性能：1-HD、L-ISO、任何与体重相关的变量。其他潜在的附加变量是EPA或L-LEU。在所有这些变量中，以下变量对与附加性预后性能(s-ENG+1-HD)、(s-ENG+DLG)或(s-ENG+PIGF)相关。
实施例4B；PE子类型：早产PE
应用的模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；平均AUC>＝0.70；平均AUC Imp：>＝0.02。
从高到低对完整的AUC进行排名，并选择低至第一单个标记物的模型。
基于此过滤，找到了39个多变量模型集合，请参见表10
Figure BDA0002716241410000721
Figure BDA0002716241410000731
表10
预后核心：
从表10可以看出，3种变量具有非常互补的预测性能，即PIGF、DLG和s-ENG。PIGF与DLG结合使用可提供最强的性能。从改进中可以明显看出，将这3种变量成对组合以及将所有3种变量组合在一起可显著提高性能。
因此，基于此，可以识别以下高性能的预后2-标记物核心；即
1.PIGF+DLG
2.PIGF+s-ENG
3.DLG+s-ENG
4.PIGF+fh_pet
当考虑3种变量时，发现一个特别强烈的核心
1.PIGF+DLG+s-ENG
备选3种变量预后核心始终具有核心预测因子PIGF、DLG、s-ENG的1或2个：
2.PIGF+s-ENG+1-HD
3.PIGF+SC+CL
4.DLG+s-ENG+1-HD
5.DLG+SC+L-ERG
6.s-ENG+SC+2-HBA
在此数据集中，通过将第4个预测变量添加到上述核中，无法实现进一步的改进。但是，更多的附加值可能在较大的患者队列中变得明显。为了找到可能是预测具有特殊AUC的早产PE的更广泛核心的一部分的这些变量，还建立了以下4种变量预后核心。再次，备选的4个标记物核心，始终具有核心预测因子PIGF、DLG、s-ENG中的1个或2个。
1.{DLG和SC}+L-ERG+{s-ENG或fh_pet}
2.{DLG和SC}+DHA+DGLA
3.DLG+HVD3+fh_pet+r_葡萄糖
4.{s-ENG和ECG}+{2-HBA或NGM}+来自{DHA、STERA、20-CL、AcCAR}的任意1个预测因子
5.{PIGF和20-CL}+ECG+{MYRA或LINA}
6.{PIGF和20-CL}+PALMA+LINA
总结：
当通过AUC评估早产PE的预后性能时，可以观察到，当将DLG与PIGF或s-ENG结合使用时，可以实现优异的多变量预后性能，所有2种变量组合均明显优于最佳单变量PIGF。
此外，当将所有DLG和PIGF以及s-ENG组合时，发现进一步的附加作用。这种代谢物-蛋白质组合对于早产PE确实具有优异的预后优点。
与早产PE一般(AUC)预后性能相关的其他潜在附加变量为：SC、1-HD、ECG、20-CL、2-HBA和NGM。
实施例4C；PE子类型：足月PE
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；平均AUC>＝0.65：平均AUC Imp：>＝0.01。
从高到低对完整的AUC进行排名，并选择低至第一单个标记物的模型。
根据此过滤，找到了56个多变量模型的集合，参见表11。
Figure BDA0002716241410000751
Figure BDA0002716241410000761
表11
预后核心：
从表11可以明显看出，必须进行血压测量才能实现子痫前期的有意义的预测性能。从这些改进可以明显看出，将血压与多种代谢物结合可以增加预测性能。因此，找到了以下第一层2个预测因子核心：
1.bp+HVD3
2.bp+L-ISO
3.bp+1-HD
4.bp+L-LEU
还发现了一些第二层2个预测因子核心：
5.bp+{WRV(体重指数/体重/腰围)、s-ENG、ADMA、L-MET、DLG、L-GLU}中的任意一个预测因子
在此基础上，3种变量的组合通常地构成一个血压测量值和第1层代谢物中的1个，并增加了第3个标记物(通常是在2个预测因子核心中找到另一个第1层或第2层变量)。发现了以下3个变量的预后核心：
1.{bp和HVD3}+{L-LEU、L-ISO、H-L-ARG、1-HD}中的任意1个预测因子
2.{bp和1-HD}+{L-LEU或L-ISO}
3.bp+DLG+fh_pet
4.bp+s-ENG+L-MET
4种变量的组合都构成了血压测量值以及HVD3。然后，将这组预测因子对与3个预测因子中的任意2个进行扩充，以产生以下4种变量预后核心：
1.{bp和HVD3}+{H-L-ARG、L-ISO、1-HD}中的任意2种变量
总结：
通过AUC评估预后性能时，可以观察到，将血压测量值与HVD3、1-HD、L-ISO或L-LEU结合使用时，用于预测足月PE的多变量预后性能超过了预设的AUC>＝0.65标准。通过将{血压和HVD3}与1-HD、L-ISO、L-LEU或H-L-ARG和/或其组合结合，可以实现进一步的预后性能提高。
实施例5：纳入预后性能
为了确定可靠的预后纳入核心，选择能够以20％的FPR(即，特异性＝0.8)标准和10％的FPR(即，特异性＝0.9)标准的敏感性(Sens)的预后性能的模型，因此，尽管在临床环境中相关性较低，但FPR为20％的Sens被认为是更可靠的标准。通常地，针对90％的置信区间的下限以及改进而言，用于Spec 0.80的Sens标准使用的过滤器，要比Spec 0.90的Sens更为严格。
针对PPV阈值的Sens分析，其对于所考虑的每种疾病子类型是不同的(参见实施例1)，采用单独报告。
实施例5A；PE子类型-所有的PE
FPR阈值：
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；对于特异性为0.80的敏感性的统计平均值：ICI>＝0.2和改进>＝0.03；对于特异性为0.90的敏感性的统计平均值：ICI>＝0.1和imp>＝0.02。
从高到低对完整的特异性为0.80的敏感性进行排名，并选择低至第一单个标记物的模型基于此过滤，找到了49个多变量模型的集合，参见表12。
Figure BDA0002716241410000781
Figure BDA0002716241410000791
Figure BDA0002716241410000801
表12
预后核心：
从表12可以清楚地看出，对于所有的子痫前期，血压测量是实现所有的子痫前期有意义的纳入预测表现的关键变量。从这些改进可以明显看出，将血压与多种代谢物结合，可以增加预测性能；因此，找到了以下第一层的2个预测因子核心：
1.bp+PIGF
2.bp+DLG
3.bp+HVD3
4.bp+L-MET
还发现了一些第二层2种变量的预后核心：
5.bp+{L-ALA、L-ARG、L-LEU、NGM、EPA、s-ENG}中的任何一种变量
3种变量的大多数组合还包括bp测量。在以下方面可以找到强烈的预测核心：
1.bp+HVD3+fh_pet
HVD3和fh_pet在其他3种变量预后核心排列中也有特色：
2.{bp和HVD3}+PIGF
3.{bp和fh_pet}+{CR、H-L-ARG、BV、SDMA、S-1-P}中的任何一种变量
具有bp的备选3种变量预后核心是：
4.bp+s-ENG+{ECG或L-ISO}
5.bp+DLG+EPA
还发现另外三个没有血压测量的预后核心：
6.s-ENG+PIGF+1-HD
只有一个4种变量的预后核心在3种变量组合上有所改进，但据报道其他符合的4种变量的预后核心在更大的患者队列中，可能会表现出额外的价值。
1.{bp和HVD3}+{CR+ADMA}或{fh_pet+妊娠期}
2.{bp和DLG和L-ERG}+{HVD3、s-ENG、EPA}中的任何一种变量
还发现了没有进行血压测量的4种变量的预后核心。它基于前面提到的3种变量组合：
3.s-ENG+PIGF+1-HD+L-LEU
PPV阈值：
对于此处阐述的子痫前期实施例，将“所有的PE”的PPV阈值设置为PPV＝0.133，并根据实施例1所述的原理和表3中汇总的目标阈值，计算PE发病率＝0.05。
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；PPV为0.133的Sens(SensAtPPV)的统计平均值：ICI>＝0.1；和imp>＝0.05；从高到低对完整的PPV处的Sens进行排名，并选择低至第一单个标记的模型
基于此过滤，找到了23个多变量模型的集合，参见表13。
Figure BDA0002716241410000811
Figure BDA0002716241410000821
表13
预后核心：
从表13可以清楚地看出，血压测量对于实现所有的子痫前期有意义的纳入预测表现(PPV)，都是关键变量。从这些改进可以明显看出，将血压与多种代谢物结合，可以增加这种预测性能。
因此，发现了以下第1层2种变量预后核心：
1.bp+PIGF
2.bp+1-HD
第一层3种变量预后核心还具有bp测量功能。基于第1层2种变量预后核心的强烈的3种变量预测核心包括：
1.{bp和PIGF}+HVD3
2.{bp和PIGF}+DLG
还发现了一些第二层3种变量核心：
3.bp+1-HD+S-1-P
4.bp+HVD3+2-HBA
尽管在考虑4种变量的组合时会出现其他几种变量，但很显然，它们始终构成3种变量核心中发现的2个或多种变量，即，血压测量、HVD3、DLG、PIGF、1-HD中的任意两个或多种变量。当应用临床相关的PPV标准作为表现阈值时，这证实了它们与所有的PE的纳入预后核心的相关性。
一些示例性的高性能4种变量预后核心是：
1.bp+HVD3+CR+ADMA
2.bp+HVD3+DLG+EPA
3.bp+DLG+s-ENG+L-ERG
发现的其他4种变量预后核心是：
1.bp+DLG+PIGF+(fh_pet或L-ERG)
2.bp+DLG+s-ENG+L-ERG
3.bp+HVD3+1-HD+L-LEU
4.{PIGF或bp}+1-HD+s-ENG+L-ISO
5.bp+HVD3+2-HBA+{r_葡萄糖或H-L-ARG}
6.bp+HVD3+fh_pet+妊娠期
总结–所有的PE的纳入预后性能。
当以纳入的阈值(FPR或PPV)将预后性能表示为敏感性(即未来病例的检出率)时，可以观察到，很难预测所有的PE的多变量预后性能。
对于考虑的纳入指标，将血压测量值和PIGF与HVD3或DLG结合使用时，有可能达到具有临床相关性PPV阈值且检测率较高的可能。fh_pet、L-MET、s-ENG是实现“所有的PE”的常规性能的其他相关变量。跨不同纳入标准的特定性能核心是bp+HVD3+CR+ADMA。
值得注意的是，在本文阐述的实施例中，多变量模型限于4个组合，并且应用了严格的改进标准。当考虑更多的变量/模型、改变改善和/或阈值时，可能会出现进一步的预后性能增加。
实施例5B；PE子类型：早产PE
FPR阈值：
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；对于特异性为0.80的敏感性的统计平均值：ICI>＝0.2，并且imp>＝0.03；对于特异性为0.90的敏感性统计平均值：ICI>＝0.1和imp>＝0.01。
从高到低对完整的特异性为0.80的敏感性进行排名，并选择低至第一单个标记物的模型基于此过滤，找到了一组20个多变量模型，参见表14。
Figure BDA0002716241410000831
Figure BDA0002716241410000841
表14
预后核心：
从表14可以明显看出，PIGF对所有性能核心都是通用的。第二高复发变量是s-ENG。
这些变量共同构成了唯一的2-变量预后核心：
1.PIGF+S-ENG
在此基础上，2种特定代谢物可以显著地改进特定PIGF+s-ENG组合的纳入性能，从而导致2个异常强烈的3种变量纳入预后核心：
1.PIGF+s-ENG+DLG
2.PIGF+s-ENG+ECG
备选3种变量预后核心是：
3.PIGF+s-ENG+CL
4.PIGF+s-ENG+L-LEU
高性能的3种变量预后核心之一，可以通过添加第4种变量来产生此第1层，4种变量预后核心来进一步改进：
1.{PIGF和s-ENG和ECG}+{20-CL或fh_pet}
还发现了一些第二层备选4种变量预后核心：
2.{PIGF和s-ENG}+CR+{L-ISO或Sa-1-P}
3.{PIGF和s-ENG}+1-HD+CL
4.{PIGF和fh_pet}+BR+bp
5.{PIGF和fh_pet}+1-HD+H-L-ARG
PPV阈值：
对于此处阐述的子痫前期的实施例，“早产PE”的PPV阈值设置为PPV＝0.071；并根据表3计算出PE发病率＝0.014。
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；统计平均值PPV为0.071的Sens：ICI>＝0.05，而impt>＝0.05。
从高到低对完整的PPV处的Sens进行排名，并选择低至第一单个标记的模型物
基于此过滤，找到了一组19个多变量模型，参见表15
Figure BDA0002716241410000851
表15
预后核心：
PIGF是唯一提供材料单变量性能的变量，但它本身并不满足过滤条件。
从表15可以明显看出，需要至少3种变量的组合，才能显著改善PIGF的纳入性能。
第一层，3种变量的预后核心包括：
1.PIGF+s-ENG+ECG
2.PIGF+s-ENG+L-ERG
3.PIGF+s-ENG+DLG
第二层，3种变量的预后核心包括：
4.PIGF+s-ENG+fh_pet。
尽管此核心性能高效(performant)，但fh_pet是临床风险因子，其容易出错，因为它需要详细了解亲人的医学妊娠史。因此它是第二层预后核心
5.PIGF+DHA+L-ISO
有趣的是，PIGF、s-ENG和DLG和L-ERG也是性能高效的4个标记物模型的一部分，性能最高的核心具有所述4种变量
1.PIGF+s-ENG+DLG+L-ERG
还发现了备选的第一层，4种变量预后核心，从而通过SC或BR交换L-ERG。即
2.{PIGF和s-ENG和DLG}+{SC或BR}
PIGF、s-ENG、DLG组合还具有另外的第二，4层变量预后核心，如下所示：
3.{PIGF和s-ENG和DLG}+{CR或ARA}
还发现了一些备选的第二层，4种变量预后核心，其与主要的3种变量基(PIGF+s-ENG+DLG)不同的3种变量基：
4.{PIGF和s-ENG和ECG}+{fh_pet或UR}
5.{PIGF和DHA}和{L-LEU、CL、L-ISO}中的任意2种变量
总结–早产PE的纳入预后性能。
当以纳入的阈值(如FPR或PPV)将预后性能表示为敏感性(即未来病例的检出率)时，可以观察到，结合蛋白质和代谢物变量后，可实现出色的预测早产PE的多变量预后性能。可以轻松达到每个预设的成功标准(参见实施例1-子痫前期风险分层测试的实施例性预后目标)。
对于所考虑的FPR纳入指标，与以下PIGF和s-ENG和DLG的组合，以及与PIGF和s-ENG和ECG的组合，可以达到临床相关FPR阈值的优异的检测率，可能会增加20-CL。
对于所考虑的PPV纳入指标，以下PIGF和s-ENG与以下ECG、L-ERG和DLG代谢物变量中的任何一个的组合，可以达到在临床相关PPV阈值的优异的检出率。当PIGF和s-ENG和DLG核心补充有L-ERG或SC时，可以实现额外的性能提升。
实施例5C；PE子类型：足月PE
FPR阈值：
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；对于特异性为0.80的Sens的统计平均值：ICI>＝0.2；和imp>＝0.03；对于特异性为0.90的Sens的统计平均值：ICI>＝0.1以及imp>＝0.02。
从高到低对完整的特异性为0.80的Sens进行排名，并选择模型直至第一单个标记物
基于此过滤，找到了一组34个多变量模型，参见表16
Figure BDA0002716241410000871
Figure BDA0002716241410000881
表16
预后核心：
从表16可以清楚地看出，血压测量对于所有性能高效组合都是通用的。HVD3、L-LEU和L-ISO是其他复发变量。
从改进数据中可以看出，用另一种变量补充血压可以显著的改进纳入性能。发现了多种这样的2种变量核心：
1.Bp+{PIGF、HVD3、L-MET、NGM、L-LEU、L-ISO、L-ARG、BV、L-ERG}中的任何一种变量
这两个标记物核心中的一些在以下第一层3种变量预后核心中重复：
2.{bp和HVD3}+{L-ARG、L-ISO、NGM}中的任何一种变量
3.{bp和L-LEU}+1-HD
4.{bp和L-LEU}+{ADMA、TR、1-HD}中的任何一种变量
备选3个变量的纳入核心是：
5.bp+NGM+ECG
6.bp+2-HBA+ADMA
7.bp+L-ARG+BV
8.bp+r_葡萄糖+s-ENG
发现了以下4个变量的预后核心：
1.{bp和HVD3和L-LEU}+{CR或TR}
2.{bp和HVD3}+BV+ADMA
3.bp+L-ARG+BV+Sa-1-P
仅发现了一个4种变量的预后核心，没有使用血压测量。
4.PIGF+L-ISO+DHA+1-HD
PPV阈值：
对于子痫前期的实施例，“足月PE”的PPV阈值设置为PPV＝0.154；并根据表3计算得出PE发病率＝0.037。
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；统计平均值PPV为0.154的Sens：ICI>＝0.05；且imp>＝0.05。
从高到低对完整的PPV处的Sens进行排名，并选择低至第一单个标记物的模型
基于此过滤，发现了41个多变量模型的集合，参见表17，但是在基于95％的CI的下限(即PPV处的Sn ICI>0.05)进行衡量时，只有11个多变量模型具有显著性
Figure BDA0002716241410000891
Figure BDA0002716241410000901
表17
预后核心：
从表17可以清楚地看出，血压测量对于所有性能高效组合都是通用的，并且至少需要3种变量才能达到显著性。
确定了以下2种变量的预后核心；
1.{bp和HVD3}
2.{bp和1-HD}
这2个标记物核心在3种变量预后核心中重复：
1.{bp和HVD3}+{TR、1-HD、L-ISO}中的任何一种变量
2.{bp和1-HD}+{TR、L-ISO、DHA}中的任何一种变量
在有效的4种变量组合中，仅传播较早的核心之一：
1.{bp和1-HD和L-ISO}+{NGM、TR、BV}中的任何一种变量
总结–足月PE的纳入预后性能。
当以FPR或PPV等纳入的阈值将预后性能表示为敏感性(即未来病例的检出率)时，可以观察到，用于预测足月PE的多变量预后性能并不容易实现。对于考虑的基于FPR的纳入指标，将血压测量值和HVD3优先与L-LEU或L-ISO结合使用时，有可能达到临床相关的FPR阈值并达到可接受的检测率。当考虑4种变量组合时，发现进一步添加CR或TR是有利的。
对于所考虑的PPV纳入指标，仅发现中等检测率(低于在PPV时设定的Sens>＝0.4的成功标准)。需要至少3种变量的组合，并具有以下优选的变量组合，即血压测量值和HVD3、血压测量值和1-HD、血压测量值和1-HD和L-ISO。
值得注意的是，在本文阐述的实施例中，多变量模型限于4个组合，并且应用了严格的改进标准。当考虑更多的变量/模型，改变改善目标和/或阈值时，可能会出现进一步的预后性能增加。
实施例6：排除预后性能
为了确定可靠的预后排除核心，所选模型可提供20％的FNR(即敏感性＝0.8)标准的特异性，以及10％的FNR(即敏感性＝0.9)标准的特异性的预后性能，因此在20％的FNR被认为是更可靠的标准，尽管在临床环境中相关性较低。通常地，对于90％的置信区间的下限以及改进，用于Sens为0.80的特异性的标准，使用了比Sens为0.90的特异性的标准更严格的过滤器。
单独报告了在NPV阈值下的规格分析，该分析对于所考虑的每种疾病子类型都不同(参见实施例1)。
实施例6A：PE子类型：所有的PE
FNR阈值：
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；对于Sens为0.80的特异性的统计平均值：ICI>＝0.2，并且imp>＝0.03；对于Sens为0.90的特异性的统计平均值：ICI>＝0.1和imp>＝0.02。
从高到低对完整的特异性为0.80的Sens进行排名，并选择低至第一单个标记物模型
基于此过滤，找到了一组54个多变量模型，参见表18
Figure BDA0002716241410000911
Figure BDA0002716241410000921
Figure BDA0002716241410000931
表18
预后核心：
从表18中可以很明显地看出，3种变量的组合可以提供很好的排除性能，例如血压测量，以及{与体重有关的测量值或1-HD}和{HVD3或s-ENG}。
从这些改进可以明显看出，将血压与多种代谢物结合可以增加预测性能。通过提到的变量，发现了以下第一层2种变量预后核心：
1.bp+1-HD
2.bp+WRV
3.bp+HVD3
4.bp+s-ENG
还发现了一些第二层2种变量预后核心：
5.bp+{GG、L-GLU、DLG、H-L-ARG、SDMA}中的任何一种变量
第一层3种变量预后核心中的两个非常相关的核心是：
1.bp和HVD3和{1-HD或WRV}。
2.bp和s-ENG和{1-HD或WRV}。
还提供了不需要1-HD或WRV的第二层3种变量预后核心：
3.{bp和s-ENG}+{L-MET或NGM}
不具有血压的备选第二层3种变量预后核心是：
4.{1-HD和PIGF}+{s-ENG或2-HBA}
4种变量的组合不能改变3种变量的预后核心中的任何一个，但是据报道某些符合的4种变量的预后核心因为在较大的患者队列中可能会变得更加明显。
1.bp和HVD3和s-ENG+H-L-ARG
2.1-HD和PIGF+s-ENG+{2-HBA或EPA}
3.1-HD和PIGF+L-ISO+EPA
NPV阈值：
对于此处阐述的子痫前期实施例，将“所有的PE”的NPV阈值设置为NPV＝0.9889，并根据表3计算PE发病率＝0.05。
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；NPV为0.9889的特异性的统计平均值：ICI>＝0.075；并且imp>＝0.05。
从高到低对完整的NPV处的特异性进行排名，并选择低至第一单个标记物的模型。
基于此过滤，找到了47个多变量模型的集合，参见表19。
Figure BDA0002716241410000941
Figure BDA0002716241410000951
Figure BDA0002716241410000961
表19
预后核心：
从表19中可以清楚地看出，将血压与许多变量结合起来可以增加预测的排除性能(按照PPV标准)。发现1-HD是一个强烈的附加变量，其具有明显的排除性能。
发现了以下第一层2种变量预后核心：
1.bp+1-HD
2.bp+HVD3
3.bp+DLG
还发现了一些第二层2种变量预后核心：
4.bp+{WRV、L-ARG、s-Flt1、NGM、PIGF、GG和20-CL}中的任何一种变量
在3种变量的组合中，两个非常相关的核心构成：
1.{bp和1-HD}+HVD3
2.{bp和1-HD}+DLG
还发现了一些第二层3种变量预后核心：
3.{bp和1-HD}+{ADMA、GG、sFlt1}中的任何一种变量
4.bp+HVD3+WRV
5.bp+S-1-P+fh_pet
与3种变量预后核心相比，发现唯一的4种变量预后核心可以提高特异性：
1.bp+1-HD+HVD3+s-ENG
4种变量的其他组合不能改进3种变量的组合中的任何一个，但是据报道一组符合的4种变量组合因为在较大的患者队列中可能会变得更加明显。值得注意的是，1-HD仍是这四个可变预后核心中的复发成分，而血压不再如此(未发现比bp模型有显著的改进)
2.bp和1-HD和HVD3+{PIGF、UR、BV}中的任何一种变量
3.bp和HVD3+WRV+年龄
4.1-HD和PIGF和s-ENG+{2-HBA、L-ISO、L-ARG、H-L-ARG}中的任何一种变量
5.1HD和PIGF+L-ARG+2-HBA
6.1-HD和PIGF+L-ISO+EPA
7.1-HD和HVD3+s-Flt1+fh_pet
8.s-ENG+WRV+ADMA+H-L-ARG
9.s-ENG+PIGF+NGM+L-ISO
总结–所有的PE的排除预后性能
当将预后性能表示为在设定的排除阈值(如FNR或NPV)下的特异性(即未来非病例的检出率)时，可以观察到，预测未来PE缺失的最优异的多变量预后性能，最好是通过将血压和1-HD与s-ENG或/和HVD3增强相结合可以实现。通过这样做，达到了预设的FNR成功标准(参见实施例1-子痫前期风险分层测试的实施例性预后目标)，而NPV成功标准则几乎得以实现。
实施例6B：PE子类型：早产PE
FNR阈值：
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；对于Sens为0.80的特异性的统计平均值：ICI>＝0.3，并且imp>＝0.03；Sens为0.90的特异性的统计平均值：ICI>＝0.2，而imp>＝0.02。
从高到低对完整的特异性为0.80的Sens进行排名，并选择低至第一单个标记的模型。
基于此过滤，找到了一组26个多变量模型，参见表20。
Figure BDA0002716241410000971
Figure BDA0002716241410000981
表20
预后核心：
从表20中可以明显看出，排除模型(由FNR评估)由与相应的早产PE纳入模型不同的一组变量的控制。s-ENG对2个预后较高的2-变量排除核心很常见：
确定的两个2种变量预后核心是：
1.s-ENG+DLG
2.s-ENG+1-HD
在此基础上，找到了两个高效性能的第一层排除3种变量预后核心；
1.{s-ENG和DLG}+CL
2.{s-ENG和1-HD}+{CL或COT}
备选的第二层3种变量排除预后核心是：
3.1-HD+CL+L-ERG
4.2-HBA+HVD3+L-ALA
5.ARA+DHA+EPA
4种变量组合中最高效的预后性能具有强烈的2种变量预后核心：
1.{s-ENG和DLG和1-HD}+NGM
2.{s-ENG和DLG}+L-ERG+L-ARG
3.{s-ENG和1-HD}+2-HBA+{HVD3或L-ARG}
一些第二层备选的4种变量预后核心具有CL而不是s-ENG：
4.{CL和1-HD和L-ERG}+{L-ARG、NGM、ADMA、fh_pet}中的任何一种变量
5.{CL和2-HBA和HVD3}+{bp或DHA}
6.{CL和L-ERG}+L-ARG+ADMA
NPV阈值：
对于此处阐述的子痫前期的例子，“早产PE”的NPV阈值设置为NPV＝0.9975；并根据表3计算得出早产PE发病率＝0.014。
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；NPV为0.9975的特异性的统计平均值：ICI>＝0.25和imp>＝0.1。
从高到低对完整的NPV处的特异性进行排名，并选择低至第一单个标记的模型。
基于此过滤，找到了一组37个多变量模型，参见表21
Figure BDA0002716241410001001
Figure BDA0002716241410001011
表21
预后核心：
从表21中可以明显看出以下排除2种变量的预后核心：
1.s-ENG+DLG
2.s-ENG+1-HD
3.s-ENG+WRV
在此基础上，可以找到2个高度的预后3-变量排除核心：
1.s-ENG和DLG和1-HD
2.{s-ENG和1-HD}+r_葡萄糖
还发现了许多其他值得注意的第二层3种变量预后核心：
3.2-HBA+L-ALA+HVD3
4.HVD3+L-ISO+WRV
4种变量的组合中没有一个在3种变量组合中的最佳组合上有所改进，但是据报道一组符合的4种变量组合因为在较大的患者队列中可能会变得更加明显。
1.{s-ENG和DLG}+DHA+{DGLA或H-L-ARG}
2.{s-ENG和DLG}+ARA+{2-HBA、UR、PIGF}中的任何一种变量
3.{s-ENG和DLG}+2-HBA+3-HBA
4.{s-ENG和DLG}+L-ERG+cig_1st_trim_gp
5.s-ENG+CL+ECG+MYRA
6.s-ENG+{PIGF和SC}+{CL、L-ALA、L-MET、NGM}中的任何一种变量
7.s-ENG+PIGF+L-ISO+TR
总结–早产PE的排除预后性能。
当将预后性能表达为在设定的排除阈值(例如FNR或NPV)下的特异性(即未来非病例的检出率)时，可以观察到，用于预测未来早产PE缺失的优异的多变量预后性能，是通过蛋白质和代谢物变量的组合实现的。使用这种组合，可以容易地满足每个预设的成功标准(参见实施例1-子痫前期风险分层测试的示例性预后目标)。
对于所考虑的FNR排除指标，通过以s-ENG和DLG为特征的组合，可以实现未来非病例的优异的检出率，并可能补充CL、1-HD、L-ERG、SC和NGM。
对于所考虑的NPV排除指标，可以通过以下2种变量预后核心，即s-ENG和DLG和s-ENG第二1-HD，以及3个标记物核心s-ENG和DLG和1-HD。
实施例6C：PE子类型：足月PE
FNR阈值：
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；对于Sens为0.80的特异性的统计平均值：ICI>＝0.2，并且imp>＝0.03；Sens为0.90的特异性的统计平均值：ICI>＝0.1和imp>＝0.02。
从高到低对完整的Spec为0.80的Sens进行排名，并选择低至第一单个标记的模型。
基于此过滤，找到了一组16个多变量模型，参见表22
Figure BDA0002716241410001031
表22
预后核心：
从表22可以清楚地看到，在排除模型(由FNR评估)中，其是由至少补充一种变量的血压测量值控制的。
使用以下2种变量的预后核心，可实现2种变量的最佳性能；
1.Bp+1-HD
附加的第二层2种变量预后核心如下：
2.Bp+{WRV、DC、HVD3、ADMA、L-ALA}中的任何一种变量
尽管3种变量和4种变量的组合，都没有比最佳的2种变量组合有所改进，但是据报道一组符合的3种变量和4种变量的组合，在更大的患者队列中可能会表现出额外的价值。
1.Bp+1-HD+HVD3
2.{Bp和HVD3}+{WRV、PIGF、年龄}中的任何一种变量
3.{bp和HVD3和H-L-ARG}+{CR或TR}
NPV阈值：
对于本文阐述的子痫前期的例子，“足月PE”的NPV阈值设置为NPV＝0.99375；根据表3计算得出早产PE发病率＝0.037。
应用模型空间过滤器：平均AUC ICI>＝0.5；NPV为0.99375的特异性的统计平均值：ICI>＝0.1，改进>＝0.05。
从高到低对完整的NPV处的特异性进行排名，选择低至第一单个标记的模型。
基于此过滤，找到了39个多变量模型的集合，请参见表23。
Figure BDA0002716241410001041
Figure BDA0002716241410001051
表23
预后核心：
从表23中可以明显看出以下预后排除2-变量预后核心：
1.bp+1-HD
2.bp+HVD3
3.bp+DLG
4.bp_L-ARG
通过扩展前2种变量预后核心，可以在以下3种变量预后核心中找到较小的改进：
1.{bp和1-HD}+sFlt1
还可以找到许多其他值得注意的第二层3种变量预后核心：
2.{Bp和HVD3}+{TR、s-ENG、H-L-ARG、1-HD、PIGF、MYRA和WRV}中的任何一种变量
3.Bp+DLG+sFlt1
4.{Bp和1-HD}+{CR或20-CL}
5.Bp+sFlt1+L-ISO
4种变量的组合均未改进2种变量组合中的最佳组合。
总结–早产PE的排除预后性能。
当将预后性能表达为在设定的排除阈值(如FNR或NPV)下的特异性(即，早产PE未来非病例的检出率)时，可以观察到，通过将血压测量值与1-HD或/和HVD3结合使用，可以实现(FNR)或接近实现(NPV)预测未来PE的适度的多变量预后性能。
实施例7：排除和纳入顺序应用
介绍
如实施例2所述，发明人通过首先建立排除模型(使用本申请中其他地方阐述的全部方法)，其次应用此统计模型来鉴别(定义的)发生子痫前期可能性较低的那些个体，第三建立纳入模型(使用本申请中其他地方阐述的所有方法)，构思了一个具有在预定PPV纳入截止时提高检测率(敏感性)潜力的过程，所述过程在预设的PPV阈值，最大程度地提高了未来病例的检测率。
在这里，我们使用以下输入来证明此构思的有效性：
-根据实施例1的子痫前期前发病率值，即
-所有的PE的发病率＝0.05
-发病率早产PE＝0.014
-发病率足月PE＝0.037
-根据表3测试后的PPV截止值
-PPV所有的PE＝0.133
-PPV早产PE＝0.071
-PPV足月PE＝0.154
-应用(稀疏)排除模型(根据实施例C1、C2、C3)，从而使用FNR截止值为10％(纳入分类将丢失未来真实病例的10％)的特异性(将来非病例的检出率)，来排除一部分测试人群。
实施例7A：所有的PE
按照Thomas等人的观点[27]，可以在ROC空间中绘制PPV标准，该标准取决于子痫前期发病率。这在图1组A中进行了说明。在实施例5A中使用的示例性框架内，性能最高(单步)的纳入多变量模型(bp+HVD3+CR+ADMA)提供48％的检测率。
鉴于顺序应用了排除模型，随后是应用纳入模型，根据实施例6A，考虑了示例性(稀疏)排除模型，该实施例在图1组B中进行例证。
-所有的PE排除模式：bp+s-ENG+1-HD
应用此排除模型后，从测试人群中去除了38.3％的未来非病例以及10％的未来病例(参见10％的FNR)。结果，剩余测试人群(P2)的子痫前期发病率增加到0.071(从0.05)。如图1组C所示，这具有更改PPV截止线的作用。在剩余人群(P2)中，生成了一组新的预测模型，根据PPV标准评估了其预测性能。用实施例性(稀疏)模型获得的ROC曲线绘制在图1组C中。
-所有的PE纳入模式：bp+PIGF+DC
在测试人群P2中，后一种模型的敏感性为0.56(检测率为56％)。对排除步骤中被忽略的10％未来病例进行校正后，总检出率为51％(56％x0.9)。
在顺序应用排除模型和纳入模型之后，该总体检测率要比根据实施例5A的应用单个纳入模型所获得的48％更好。
因此，根据实施例6A的排除预后核心以及以本申请中考虑的任何变量的多变量组合为特征的纳入预后核心的组合，将为所有的子痫前期提供优异的纳入预后性能。
实施例7B：早产PE
按照Thomas等人的观点[27]，可以在ROC空间中绘制PPV标准，该标准取决于子痫前期发病率。这在图2的组A中进行了说明。在实施例5B中使用的示例性性框架内，性能最高(单步)的纳入多变量模型(PIGF+s-ENG+DLG+L-ERG)可提供65％的检测率。
鉴于顺序应用了排除模型和纳入模型，根据实施例6B，考虑了示例性(稀疏)排除模型，该实施例在图2组B中进行例证。
-早产PE排除模型：s-ENG+DLG
应用此排除模型后，从测试人群中去除了43.7％的未来非病例以及10％的未来病例(参见10％的FNR)。结果，剩余测试人群(P2)的早产子痫前期的发病率增加到0.023(从0.014)。如图2组C所示，这具有更改PPV截止线的作用。在人群(P2)中，生成了一组新的预测模型，并根据PPV标准评估了其纳入性能。用示例性模型获得的ROC曲线绘制在图2组C中。
-早产PE纳入模式：PIGF+s-ENG+DLG+2-HBA
在测试人群P2中，后一种模型的敏感性为0.81(检测率为81％)。对排除步骤中被忽略的10％未来病例进行校正后，总检出率为73％(81％x0.9)。
在顺序应用排除模型和纳入模型之后，该总体检测率要比根据实施例5B的应用单个纳入模型所获得的65％更好。
因此，根据实施例6B的排除预后核心以及以本申请中考虑的任何变量的多变量组合为特征的纳入预后核心的组合，将为早产子痫前期提供优异的纳入预后性能。
实施例7C：早产PE
按照Thomas等人的观点[27]，可以在ROC空间中绘制PPV标准，该标准取决于子痫前期发病率。这在图3组A中进行了说明。在实施例5C中使用的示例性框架内，性能最高(单步)的纳入多变量模型(bp+HVD3+TR)提供35％的检测率，其不符合表3中设置的预设最小检测率。
鉴于顺序应用了排除模型，随后是应用纳入模型，根据实施例6C，考虑示例性(稀疏)排除模型，该实施例在图D组B中进行例证。
-足月PE排除模型：bp+1-HD
应用此排除模型后，从测试人群中去除了38.2％的未来非病例以及10％的未来病例(参见10％的FNR)。结果，在剩余的测试人群(P2)中的子痫前期的发病率增加到0.053(从0.037)。如图D组C所示，这具有更改PPV截止线的作用。在人群(P2)中，生成了一组新的预测模型，并根据PPV标准评估了其纳入性能。用示例性模型获得的ROC曲线绘制在图3组C中绘制。
-足月PE纳入模式：bp+1-HD+NGM+H-L-ARG
在测试人群P2中，后一种模型的敏感性为0.465(检测率为46.5％)。对排除步骤中被忽略的10％未来病例进行校正后，总检出率为42％(46.5％x0.9)。
在顺序应用排除模型和纳入模型后，该总体检测率要比根据实施例5C应用单个纳入模型所获得的35％更好，并且确实满足了预设的最小值检出率见表3。
因此，根据实施例6C的排除预后核心以及本申请中考虑的任何变量的多变量组合为特征的纳入预后核心的组合，将为早产子痫前期提供优异的纳入预后性能。
实施例8：通过顺序分类器的过程最大程度地提高预后性能
介绍
在实施例5、6和7中，无论测试是单步测试还是新颖的2-步测试方法的结果，预后测试的主要目的都是优异的纳入性能或优异的排除性能的成果。
如贯穿本申请所考虑的那样，通过特定变量组合，始终显示出与早产PE的优异的预后相关性，发明人探索了是否可以设想开发一种预后测试，该预后测试同时提供优异的纳入和排除性能，如临床相关指标PPV(纳入)和NPV(排除)所示。
根据表3，考虑了以下临床相关的截止值：
-纳入：测试应将人群分类为高风险组，其中发生早产子痫前期的可能性>＝1/14或PPV>＝0.071
-排除：测试应将人群分类为低风险组，其中发生早产子痫前期的概率为＝<1/400或NPV>＝0.9975。
通过考虑(未来)子痫前期的发病率，即p＝0.014(参见表3)，可以在ROC空间中表示这种测试的预后要求；图4示出了与早产PE相关的临床相关PPV和NPV阈值。
早产PE：顺序分类器
发明人发现，通过使用在本申请中考虑的目标的变量，应用如在实施例2中理论上详细阐述的“纳入”和“排除”分类的特定顺序，可以建立优异的纳入和排除性能的预后测试。
在第一步中，发明人利用PIGF的众所周知的预测优点，来预测早产子痫前期，正如Kenny等人在SCOPE研究中所发表的那样[24]。在图5中，对于在本申请中考虑的所有研究对象，给出了妊娠时在母体血液样品中测定的PIGF水平vs分娩时的胎龄(参见实施例1)。请注意，在抽血时所有妇女均被认为是健康的，没有表现出子痫前期的临床症状，也没有表现出子痫前期的任何临床风险因子。由于子痫前期(“早产子痫前期”)而早产，即在妊娠前37周分娩的妇女以“星号”符号表示，患有子痫前期但足月分娩(即妊娠37周或更迟)的妇女，用“棒”符号表示，未患有子痫前期分娩妇女用“圆圈”符号表示。
从图实施例5中可以看出，在取样时使用PIGF水平可以将测试人群分为两组。PIGF低于所示阈值的女性，发生早产PE的PPV>0.071，被认为是高风险人群。同样清楚的是，PIGF水平高于(或等于)阈值的人群，占未来早产PE病例的50％以上(“A”区)。
在本实施例的剩余部分中，(未来)足月PE病例不再被考虑。
这导致以下研究人群研究-Pop1构成(按照实施例1)
-(未来)早产PE；n＝23
-(未来)非PE；n＝335
为了评价本实施例8中建立的分类器的预后性能，需要校正研究数据，因为该研究基于病例对照研究设计，因此与自然疾病发病率相比，具有(未来)早产PE病例过多的表现p＝0.014。到此为止，对于假定的10,000个妊娠人群，任何分类数据将被重新计算，构成：
-(未来)早产PE；n＝140
-(未来)没有PE；n＝9860
通过应用以下比例因子
-(未来)早产PE：140/23＝6.087
-(未来)没有PE；9860/335＝29.43
可以解释10,000个妊娠人群的研究结果，同时说明自然疾病的发病率。
发明人发现PIGF和DLG表现出互补的分类潜力，其在绘制两者时变得显而易见，如图6所示。
鉴于正在考虑的与临床相关的纳入/排除分类目标，可以利用这种预后互补性，如下所示：
步骤1
图5示出了使用PIGF截止值的纳入分类器的应用。此分类器会将研究-Pop1细分为“纳入”或高风险人群(Pop-HR1)，如图7所示，以及新的研究人群研究-Pop2。
使用该规则PIGF<0.005445可以实现以下分类：
Figure BDA0002716241410001101
当表示为总分类器的一部分时，此第一步将导致以下结果：
Figure BDA0002716241410001102
已建立的纳入组Pop-HR1中的PPV，符合预设的PPV标准(PPV>＝0.071)。这种单步分类器的总检出率为43％(Sn＝0.43)，即，仅应用基于PIGF的截止值，就会发现所有未来早产PE病例的43％。值得注意的是，未纳入的组(研究-Pop2)不符合PPV或NPV标准。这个单步分类器也可以绘制在ROC空间中，如图8所示。确认符合PPV标准(参见图4)。
由于人群Pop-HR1完全符合预设的PPV标准，因此PoP-HR1被视为已完全分类，因此不再考虑(已从研究中去除)。这意味着分类的下一步将仅考虑研究-Pop2。
步骤2
从研究-Pop1中去除Pop-HR1之后，DLG的附加的预后价值变得非常明显。图9举例说明了使用DLG截止值的排除分类器。该分类器会将研究-Pop2分为“排除”或低风险人群(Pop-LR1)，以及一个新的研究人群研究-Pop3。
使用规则DLG<0.1454243，可以实现以下分类：
Figure BDA0002716241410001111
添加到总分类器后，第二步的结果如下：
Figure BDA0002716241410001112
因此，已建立的排除组的Pop-LR1中的NPV，符合预设的NPV标准(NPV>＝0.9975)。
这种双步骤分类器的总检出率为43％(Sn＝0.43)，即，在应用基于PIGF的截止值时，就会发现所有未来早产PE病例的43％(步骤1；低于)。对于任何PIGF高于(或等于)PIGF截止值的受试者，将确定该受试者的值是否低于(排除)基于DLG的截止值，或高于DLG截止值(成为研究-pop3的一部分)。58％(Sp＝0.58)的(未来)非PE病例将分层进入Pop-LR1，并被认为是低风险的。值得注意的是，研究-Pop3的构成不符合PPV或NPV标准。
也可以在ROC空间中绘制此两步分类器，如图10所示。由于总分类器分别考虑了纳入分类和排除分类，因此总测试分类器对应于2个单独的(Sn-Sp)对。可以看到，生成的纳入分类和排除分类，符合预设的PPV或NPV截止值。这些未分类为高风险或低风险的受试者构成研究-Pop3。还可以在ROC空间中绘制研究-Pop3的指标。显然，此组(剩余)不符合要求。
由于人群Pop-LR1完全符合预设的NPV标准，因此Pop-LR1也被认为是完全分类的，因此不再进一步考虑(从研究中去除)。这意味着分类的下一步将仅考虑研究-Pop3。
步骤3
从研究-Pop2中去除Pop-LR1之后，发明人发现L-ERG可再次用于对研究-Pop3进行分层，以排除另外一组受试者，并将它们也归类为低风险。图11举例说明了使用L-ERG截止值的排除分类器的应用。该分类器会将研究-Pop3细分为“排除”或低风险人群(Pop-LR2)，以及新的研究人群研究-Pop4。
使用该规则L-ERG<0.266432，可以实现以下分类：
Figure BDA0002716241410001121
在新的排除组(即Pop-LR2)中，仅错过了预设的NPV标准(NPV＝0.996)，但是当将第三步与Pop-LR1结合使用时，将满足累积的排除标准。
与前面的步骤相结合，第三步产生了以下组合的纳入和排除分类：
Figure BDA0002716241410001122
这种双步分类器的总检出率为43％(Sn＝0.43)，即在应用基于PIGF的截止值时，将发现所有未来早产PE病例的43％(步骤1；低于Pop-HR1)。
对于具有高于(或等于)PIGF截止值的任何受试者，然后确定受试者是否具有低于基于DLG的截止值的值；如果是，则这些受试者将被视为低风险(步骤2；Pop-LR1)。
对于任何PIGF血液值>＝PIGF截止值，且DLG血液值>＝DLG截止值的受试者，将确定该受试者的值是否低于基于L-ERG的截止值(排除)；PopLR2)，或高于L-ERG截止值(成为研究-pop4的一部分)。将这两个连续的排除细分步骤组合在一起时，(未来)非早产PE病例的75％(Sp＝0.75)将被分为整个低风险组。值得注意的是，研究-Pop4的构成不符合PPV或NPV标准。
也可以在ROC空间中绘制此三步分类器，如图12所示。由于总分类器分别考虑纳入分类和排除分类，因此总测试分类器对应于2个单独的(Sn-Sp)对。可以看到，生成的纳入分类和排除分类符合预设的PPV或NPV截止值。这些未分类为高风险或低风险的受试者构成研究-Pop4。还可以绘制此“阴性”测试的指标，其对应于ROC空间中的研究-pop4。显然，此组(剩余)不符合要求。
步骤4
发明人发现，s-ENG可以再次用于对研究-Pop4进行分层，以排除另一组受试者，并且也将其分类为低风险。图13举例说明了使用s-ENG截止值的排除分类器的应用。该分类器会将研究-Pop4分为“排除”或低风险人群(Pop-LR2)，以及一个剩余的研究人群。
使用该规则s-ENG<14.8293，可以达到对研究-Pop4进行以下分类：
Figure BDA0002716241410001131
在新的排除组中，即Pop-LR3，再次符合预设的NPV标准(NPV＝1)，这将确保当第4步被视为总分类器的一部分时，累积排除符合条件。
当添加到总分类器中时，第4步将产生以下纳入和排除分类：
Figure BDA0002716241410001132
有趣的是，可以观察到，在剩余人群中，妊娠后期获得早产PE的风险，实际上符合PPV阈值。当在ROC空间中绘制总的分类器时也很明显，如图14组A所示。
从图14组A中可以看出，在应用了最后一个排除分类之后，“排除”分类的总体符合NPV排除标准(按预期)，但是它也符合符合预设的PPV“纳入”标准。换句话说，由于各个分类器的这种特定顺序应用的结果，未分类为低风险的受试者(根据先前的排除分类器)为高风险。从“剩余”人群也很清楚，该人群也符合PPV标准(类似于第一纳入组Pop-HR1)。反复去除(或“排除”)或“低风险”受试者，将会导致在(未来)早产PE病例中高度丰富的剩余人群。因此，可以考虑组成一个总的高风险组：Pop-HR1+剩余(或Pop-HR2)。
这样，如图14组B所示，此“总分类器”会将原始研究的研究-pop1人群分为两组；即
-包括91％(未来)早产PE病例的高风险人群，其中任何受试者在妊娠后期有效地发展为疾病的风险>＝1/14(即PPV>＝0.071)
-包括83％的(未来)非PE病例的低风险人群，其中任何受试者有效地发展为子痫前期的风险＝<1/400或(NPV>＝0.9975)。
除了完整实施例的总的分类器(分类器A；在表20中)之外，还发现了一组4种变量的有序应用的其他总的分类器。表24中显示了它们的关键预后性能统计数据，图15中的ROC空间中对此进行了说明：
表24：早产PE的预后模型：变量，顺序分类器中的有序应用，以及本申请中阐述的早产PE实施例的实施例性预后性能指标。
Figure BDA0002716241410001141
*与L-LEU和L-ISO密切相关，并且是紧密相关的化合物，与单独地使用L-LEU和L-ISO的分类器相比，研究了L-LEU和L-ISO的求和信号是否能提供相似的预后性能。列表数据证实可以考虑L-LEU和L-ISO的总和。总的量化数据构成了(L-LEU和L-ISO的总定量离子信号)与ISTD_3_L-LEU或ISTD_6_L-ISO SIL标准的定量离子信号之比。2种可能的读数给出了相似的结果；报告的数据使用了ISTD_3_L-LEU。
这些分类器中的每一个可实现的示例性总分类也如图15所示。
总结早产PE：顺序分类器
对读者而言显而易见的是，构成有序应用任何、2、3或4种变量分类器的的以下总分类器在显示子痫前期的任何临床症状之前，将在孕妇早期，为早产PE提供高度的预后的分层：
-PIGF、DLG、L-ERG和s-ENG
-PIGF、DLG、s-ENG、1-HD
-PIGF、DLG、L-LEU、s-ENG
-PIGF、DLG、s-ENG、L-LEU
-PIGF、DLG、L-ISO、s-ENG
-PIGF、DLG、(L-LEU+L-ISO)、s-ENG
-PIGF、DLG、L-ERG、L-LEU
-PIGF、DLG、L-ERG、L-ISO
-PIGF、DLG、L-ERG、(L-LEU+L-ISO)
实施例9二亚油酰甘油异构体
介绍
从本文详述的实施例中，很明显，DLG是子痫前期，特别是早产子痫前期的多变量预后模型中的关键变量。
申请人发现，二酰基甘油可以以三种立体化学形式存在；即，sn-1,2-二酰基甘油、sn-2,3-二酰基甘油和sn-1,3-二酰基甘油，其中前两个是对映体。另外，从文献中发现，可以通过酰基迁移发生异构化。为了确认分析信号的预后价值是否确实是不同的二亚油酰甘油甘油异构体混合物的结果，以及不同的可能异构体之间的预后价值是否存在差异，申请人开发了一种单独的LC-MS方法，以首先解决任何可能的异构体，并使用该专用方法分析研究人群。
将手性色谱法(固定相Lux-Amylose-1；Phenomenex，柴郡，英国)与针对Met_021_063参考材料建立的MS/MS设置结合使用，经确认，表明观察到的二亚麻基甘油信号确实是3个异构体的信号总和，如图16所示。
出于本实施例的目的，不同的异构体缩写如下：DLG1(1,3-)、DLG2(2,3-)和DLG3(1,2-)。通过LC-MS方法获得的总信号二亚油酰基-甘油信号，如本申请中其他地方所述，简称为“总的DLG”。
实验
在此基础上进行了第二个实验，从而使用了不同的病例：使用与实施例1相同的SCOPE研究中的对照研究；简而言之，这项研究构成了：
-(未来)PE病例：53，其中
-(未来)早产PE病例：17
-(未来)足月PE病例：42
-(未来)非PE(对照)：574
一式两份地对样品组进行了分析，一次使用的方法与本申请中详述的方法类似(仅RPLC变体；参见，DLG是疏水性代谢物)，其次是使用手性LC-MSMS方法，质谱分析使用的代谢物设置是针对Met_021_063和手性LC方法得出的。
简而言之，手性LC方法涉及以下方面：
-流动相A：H2O:MeOH：乙酸铵缓冲液，pH4.5 92:3:5
-流动相B MeOH:ACN:IPA：乙酸铵缓冲液，pH4.5 35:35:25:5
使用(4x20)mm LuxAmylose-1保护柱和100x4.6mm 5um Lux Amylose-1分析柱，色谱于95％的B:5％等度条件下下进行运行。
定量数据是基于每种二亚油酰甘油类型的定量离子/1,3-二亚油酰基-rac-甘油-[2H5]的定量离子。
数据：
结果表明，其中一种异构体比另一种异构体更丰富，该异构体是两种对映异构体之一(即1,2-或2,3-二亚油酰基甘油)，最有可能是sn-1,2-二亚油酰甘油(DLG3)。由于分析敏感性的限制，其他2种子类型的丰度估计要低30％左右。然而，更重要的是，很明显，所有3个异构体之间以及与通过通用的LC-MS方法获得的总信号，均具有很强的相关性，如图17所示。由于DLG1和DLG2的信号接近检测极限，对于重复注射，所建立的相关不精确度较高，即％CV＝19％和％CV＝27％；而在此实验中，总的DLG和DLG3的CV百分比，分别为CV百分比＝16％和％CV＝15％。DLG1和DLG2的较低精度是找到的较低相关系数(r)的基础。
此外，每种异构体的预后价值也显示是相同的。如图18所示；“无(未来)PE”组与“(未来)早产PE”组，或“(未来)足月PE”组之间的中位数倍数变化在“总二亚油酰甘油”以及任何不同的二亚油酰甘油之间非常相似。值得注意的是，这些倍数变化，也与表实施例13.2和实施例13.3中报道的倍数变化一致。在“未来”子痫前期病例中，该特定研究中的研究样品与整个研究中报告的研究人群重叠(参见实施例1)，但使用了不同的随机“非-PE”组(某些样品可能重叠)。这进一步证明了二亚油酰甘油，作为子痫前期的更相关的预后变量的相关性。
这证实，根据本申请中其他地方阐述的分析方法分析“总二亚油酰甘油”是适当的，并将其信号用作子痫前期的预后变量。这并不排除申请人意识到1、2或3(“总的”)二亚油酰甘油异构体的任何组合，即sn-1,2-二酰基甘油、sn-2,3-二酰基甘油和sn-1,3-二酰甘油，具有子痫前期的预后潜力。
等价物
前面的描述详述了本发明的当前优选实施例。在考虑了这些描述之后，本领域技术人员可以预期在实践中进行多种修改和变化。这些修改和变化，旨在包括于所附权利要求中。
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Claims (62)

1.一种早期预测孕妇的妊娠结果的风险的计算机实施方法，包括以下步骤：
输入计算模型：
选自表1的一组多种子痫前期特异性生物标记物的值，其包括至少一种代谢物和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子，其中所述值从妊娠早期的孕妇身上获得；
其中计算模型被配置为：
基于选自早产子痫前期、足月子痫前期和所有的子痫前期的妊娠结果，选择输入值的子集，所述输入值包括至少一种代谢物的值和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子的值；
基于输入值的子集，计算所选的妊娠结果的预测风险；和
输出孕妇的妊娠结果的预测风险。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述妊娠结果选自早产子痫前期和足月子痫前期。
3.根据权利要求1或2所述的计算机实施方法，其中所述计算模型被配置为：
基于选自早产子痫前期、足月子痫前期和所有的子痫前期的第二妊娠结果，选择输入值的第二子集，所述输入值包括至少一种代谢物的值和可选的至少一种蛋白质或临床风险因子的值；
基于输入值的第二子集，计算第二妊娠结果的预测风险；和
输出孕妇的第二妊娠结果的预测风险。
4.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实施方法，其中子痫前期特异性生物标记物的组包括表1的至少五种生物标记物和另一种代谢物生物标记物，所述生物标记物包括PIGF、DLG，所述代谢物生物标记物选自1-HD、L-ISO、NGM、2HBA、DC和CL。
5.根据权利要求4所述的计算机实施方法，其中子痫前期特异性生物标记物的组包括表1的至少五种生物标记物和至少两种代谢物生物标记物，所述生物标记物包括PIGF、DLG，所述代谢物生物标记物选自1-HD、L-ISO、NGM、2HBA、DC和CL。
6.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实施方法，其中所述或每个所选值的子集由单个代谢物生物标记物的值组成，且其中所述计算步骤包括将所述单个代谢物生物标记物的丰度值与相同代谢物生物标记物的参考丰度值进行比较。
7.根据权利要求6所述的计算机实施方法，其中所述单个代谢物生物标记物选自DLG、1-HD、L-ISO、NGM、2HBA、DC和CL。
8.根据权利要求6所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是早产PE，且所述单个生物标记物选自DLG、NGM、2HBA和CL。
9.根据权利要求6所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是足月PE，且所述单个生物标记物选自1-HD、L-ISO和DC。
10.根据权利要求6所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是所有的PE，且所述单个生物标记物选自DLG和1-HD。
11.根据权利要求1至5中的任一项所述的计算机实施方法，其中所述或每个所选值的子集包括选自表1的多种生物标记物的值，且其中所述或每个计算步骤包括以下步骤：
将所选值的子集输入到特定于所选的妊娠结果的风险分数计算中，以计算妊娠结果的风险分数；和
将计算出的风险分数与至少一个参考风险分数进行比较，以为孕妇提供妊娠结果的预测风险。
12.根据权利要求11所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是早产PE，其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自DLG、1-HD、L-ISO、L-LEU、NGM、SC、L-ERG、2-HBA、ECG、20-CL、CR、PIGF和s-ENG。
13.根据权利要求12所述的计算机实施方法，其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自DLG、1-HD、NGM、SC、2-HBA、ECG、20-CL、PIGF和s-ENG。
14.根据权利要求11所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是足月PE，且其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、CR、H-L-ARG和TR。
15.根据权利要求14所述的计算机实施方法，其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU和H-L-ARG。
16.根据权利要求11所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是所有的PE，且其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、WRV、fh_pet、DLG、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、CR、EPA、L-MET、ADMA、PIGF和s-ENG。
17.根据权利要求16所述的计算机实施方法，其中所选值的子集包括多种生物标记物的值，所述生物标记物选自bp、WRV、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、EPA、PIGF和s-ENG。
18.根据前述权利要求中任一项所述的计算机实施方法，其中输入到所述计算模型中的值包括选自表1的一种或多种纳入和/或排除的生物标记物。
19.根据权利要求18所述的计算机实施方法，其中由所述计算模型所选的所述或每个输入值的子集包括表1中的至少一种纳入生物标记物的值，其中所述计算模型被配置为，基于至少一个输入值的子集来检测出所选的妊娠结果的升高的风险。
20.根据权利要求18所述的计算机实施方法，其中由所述计算模型所选的所述或每个输入值的子集包括表1中的至少一种排除生物标记物的值，其中所述计算模型被配置为，基于至少一个输入值的子集来检测所选的妊娠结果的降低的风险。
21.根据权利要求1至5中的任一项所述的计算机实施方法，其中所述方法包括向计算模型中输入风险类别的附加步骤，所述风险类别选自升高的风险和降低的风险，且其中基于所选的妊娠结果和所选的风险类别，由计算模型所选的所述或每个输入值的子集包括：(a)输入值的纳入子集，其包括一种或多种纳入生物标记物的值；和/或(b)输入值的排除子集，其包括一种或多种排除生物标记物的值。
22.根据权利要求21所述的计算机实施方法，其中输入到所述计算模型中的所述风险类别是升高的风险，且其中所述计算模型被配置为：
基于所选的妊娠结果，选择输入值的排除子集，其包括一种或多种排除生物标记物的值；
基于输入值的排除子集，确定所选的妊娠结果是否是降低的风险；
如果未确定所选的妊娠结果是降低的风险，则基于所选的妊娠结果，选择输入值的纳入子集，其包括一种或多种纳入生物标记物的值；
基于输入值的纳入子集，确定所选的妊娠结果是否是升高的风险；
输出孕妇的妊娠结果的预测风险。
23.根据权利要求21所述的计算机实施方法，其中输入到所述计算模型中的所述风险类别是降低的风险，并且其中所述计算模型被配置为：
基于所选的妊娠结果，选择输入值的纳入子集，其包括一种或多种纳入生物标记物的值；
基于输入值的纳入子集，通过确定所选的妊娠结果是否是升高的风险来计算预测风险；
如果未确定所选的妊娠结果是升高的风险，则基于所选的妊娠结果，选择输入值的排除子集，其包括一种或多种排除生物标记物的值；
基于输入值的排除子集，通过确定所选的妊娠结果是否是降低的风险来计算预测风险；以及
输出孕妇的妊娠结果的预测风险。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的计算机实施方法，其中所述一种或多种纳入生物标记物包括PIGF，并且其中所述一种或多种排除生物标记物包括DLG。
25.根据权利要求18至24中的任一项所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是早产子痫前期，并且其中所述一种或多种纳入生物标记物选自DLG、SC、L-ERG、ECG、20-CL、PIGF和s-ENG。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是足月子痫前期，并且其中一种或多种纳入生物标记物选自bp、1-HD、HVD3、L-ISO、L-LEU、CR和TR。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是所有的子痫前期，并且其中一种或多种纳入生物标记物选自bp、fh_pet、DLG、HVD3、CR、L-MET、ADMA和PIGF。
28.根据权利要求86至27中任一项所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是早产子痫前期，并且其中一种或多种排除生物标记物选自DLG、1-HD、NGM、SC、L-ERG、CR和s-ENG。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是足月子痫前期，并且其中一种或多种排除生物标记物选自bp、1-HD和HVD3。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的计算机实施方法，其中所选的妊娠结果是所有的子痫前期，并且其中一个或多个排除生物标记物选自bp、1-HD、HVD3和s-ENG。
31.根据权利要求22所述的计算机实施方法，其中如果基于输入值的纳入子集，未确定所选的妊娠结果是升高的风险，则所述计算模型被配置为，基于所选的妊娠结果来选择第二输入值的纳入或排除子集。
32.根据权利要求23所述的计算机实施方法，其中如果基于输入值的排除子集，未确定所所选的妊娠结果是降低的风险，则所述计算模型被配置为，基于所选的妊娠结果来选择第二输入值的纳入或排除子集。
33.一种预测孕妇早产子痫前期风险的方法，包括以下步骤：
(a)确定代谢物和蛋白质的变量组的水平，其包括DLG和选自PIGF和s-ENG的蛋白质，其中代谢物和蛋白质水平是从妊娠早期的孕妇的生物样品中测得的；
(b)基于包括PIGF蛋白的的变量组的第一子集的水平提供分数，并将所述分数与阈值分数进行比较，以检测第一纳入预后信号的存在；或者
(c)基于包括DLG或s-ENG的的变量组的第二子集的水平提供分数，并将所述分数与阈值分数进行比较，以检测第一排除预后信号的存在；和
(d)基于纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算早产子痫前期的预测风险。
34.根据权利要求33所述的方法，其包括步骤(b)和步骤(c)。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中：
当检测到第一纳入预后信号，且未检测到第一排除预后信号时，则确定孕妇发生早产子痫前期的风险升高，或者
当检测到第一排除预后信号，且未检测到第一纳入预后信号时，则确定孕妇发生早产子痫前期的风险降低。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中变量组包括DLG、PIGF、s-ENG、L-ERG和1-HD。
37.根据权利要求36所述的方法，其中变量组还包括L-LEU、L-ISO、2-HBA、ECG、SC、DC、CL和NGM中的至少五种。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中变量的第一子集包括PIGF，且变量的第二子集包括DLG。
39.根据权利要求38所述的方法，其中变量的第二子集包括：DLG，和s-ENG、L-ERG、L-LEU、L-ISO或(L-ISO+L-LEU)中的任意两种。
40.根据权利要求33至39中的任一项所述的方法，其中变量的第一子集和/或变量的第二子集各自包括多种变量，包括至少一种代谢物和至少一种蛋白质。
41.根据权利要求40所述的方法，其中变量的第一子集包括DLG和PIGF，或DLG和s-ENG。
42.根据权利要求40所述的方法，其中变量的第一子集包括：
PIGF、s-ENG、DLG和2-HBA；
PIGF和DLG；
DLG和s-ENG；或者
PIGF、s-ENG、DLG，以及ECG、L-ERG、SC、20-CL中的任何一种或两种。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中变量的第二子集包括DLG和s-ENG，或s-ENG和1-HD。
44.根据权利要求43所述的方法，其中变量的第二子集包括：
DLG和s-ENG；
s-ENG和1-HD；
s-ENG、DLG和1-HD；或者
s-ENG、DLG，以及1-HD、CL、L-ERG、SC、NGM中的任何一种、两种或三种。
45.根据权利要求33至44中的任一项所述的方法，其中当未检测到第一纳入预后信号的存在，且未检测到第一排除预后信号的存在时，所述方法包括附加步骤：根据变量组的第三或第四子集的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第二纳入或第二排除预后信号的存在；并根据第二纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算早产子痫前期的预测风险。
46.根据权利要求45所述的方法，其中：
当检测到第二排除预后信号的存在时，确定孕妇发生早产子痫前期的风险降低；或者
当检测到第二纳入预后信号的存在时，确定孕妇发生早产子痫前期的风险升高。
47.根据权利要求45所述的方法，其中：
当未检测到第二排除预后信号的存在时，该方法包括附加步骤：根据变量的第五或第六子集的水平提供分数，并将该分数与阈值分数进行比较，以检测第三纳入或第三排除预后信号的存在。
48.根据权利要求47所述的方法，其中当检测到所述第三排除预后信号的存在时，确定所述孕妇发生子痫前期的风险降低，或者其中当未检测到所述第三排除预后信号的存在时，则确定孕妇发生早产子痫前期的风险升高。
49.预测孕妇足月子痫前期的风险的方法，其包括以下步骤：
(a)确定代谢物变量组的水平，其包括HVD3或1-HD，其中代谢物水平从妊娠早期的孕妇的生物样品中测得；
(b)基于(i)包括HVD3或1-HD的变量组的第一子集的水平和(ii)从妊娠早期的孕妇获得的血压测量值提供分数，并将分数与阈值分数进行比较，以检测第一纳入预后信号的存在；或者
(c)基于(i)包括HVD3或1-HD的变量组的第二子集的水平和(ii)从妊娠早期的孕妇获得的血压测量值提供分数，并将分数与阈值分数进行比较，以检测第一排除预后信号的存在；以及
(d)基于纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算足月子痫前期的预测风险。
50.根据权利要求49的方法，包括步骤(b)和步骤(c)。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中：
当检测到第一纳入预后信号，且未检测到第一排除预后信号时，确定孕妇发生足月子痫前期的风险升高，或者
当检测到第一排除预后信号，且未检测到第一纳入预后信号时，确定孕妇发生足月子痫前期的风险降低。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中代谢物变量组包括1-HD和HVD3。
53.根据权利要求52所述的方法，其中变量组还包括TR、L-LEU、L-ISO、CR、DHA、NGM和BV中的至少一种或多种。
54.根据权利要求49至53中的任一项所述的方法，其中变量的第一子集和/或变量的第二子集各自包括多种代谢物变量。
55.根据权利要求54所述的方法，其中变量的第一子集包括：
HVD3和(TR、1-HD或L-ISO或L-LEU)；
HVD3和(L-ISO或L-LEU)和(TR或CR)；
1-HD和(TR、L-ISO或DHA)；
1-HD、NGM和H-L-ARG；或
HVD3、1-HD和(NGM、TR或BV)。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中变量的第二子集包括
HVD3和(TR、1-HD、WRV或H-L-ARG)；
1-HD和(CR或20-CL)；或
HVD3、H-L-ARG和(CR或TR)。
57.根据权利要求49至56中任一项所述的方法，其中当未检测到第一纳入预后信号的存在，且未检测到第一排除预后信号的存在时，该方法包括附加步骤：根据变量组的第三或第四子集的水平和可选的临床风险因子测量值提供分数，然后将分数与阈值分数进行比较，以检测第二纳入或第二排除预后信号的存在，并基于第二纳入和排除预后信号的存在或不存在，来计算足月子痫前期的预测风险。
58.根据权利要求57所述的方法，其中：
当检测到第二排除预后信号的存在时，确定该孕妇发生足月子痫前期的风险降低；或者
当检测到第二纳入预后信号的存在时，确定该孕妇发生足月子痫前期的风险升高。
59.根据权利要求57所述的方法，其中当未检测到第二排除预后信号的存在时，所述方法包括附加步骤：基于变量的第五或第六子集的水平提供分数，并将分数与阈值分数进行比较，以检测第三纳入或第三排除预后信号的存在。
60.根据权利要求59所述的方法，其中当检测到第三排除预后信号的存在时，确定孕妇发生子痫前期的风险降低，或者其中当未检测第三排除预后信号的存在时，确定孕妇发生子痫前期的风险升高。
61.一种计算机程序，其包括用于使计算机执行根据权利要求1至60中任一项所述的方法的程序指令。
62.根据权利要求61所述的计算机程序，其嵌入在记录介质、载波信号或只读存储器上。
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