CN113109416B - 一种激素的快速高通量质谱检测装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种激素的快速高通量质谱检测装置及方法。所述纸喷雾质谱检测装置包括纸基质、质谱仪、注射装置和金属夹；纸基质由多层滤纸重叠而成，且最下层的所述滤纸作为喷雾层基底，喷雾层基底的一端形成电喷雾发生端；金属夹的一端用于连接高压直流电源，另一端用于夹住纸基质，且所述纸基质的电喷雾发生端对准质谱仪的进样锥口；注射装置用于向纸基质中的所述喷雾层基底注射洗脱剂。本发明将简易、实用的多层纸喷雾装置与纸喷雾质谱法的特点相结合，取代高成本的液相色谱，基于多层纸基质的分离作用，集提取、富集、分离、电离和检测为一体，实现分析复杂基质样品中多种激素的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种激素的快速高通量质谱检测装置及方法，属于生物检测分析技术领域。
背景技术
内源性类固醇激素是自身合成的一大类激素，按药理作用可分为肾上腺皮质激素和性激素。临床上将类固醇激素水平作为多种疾病的诊断指标，包括先天性类固醇代谢紊乱(如先天性肾上腺增生、先天性发育障碍和先天性盐稳态失调等)和获得性类固醇代谢紊乱(如原发性醛固酮增多症、库欣综合征、艾迪生病、高雄激素血症及精神状态疾病)等。
类固醇激素又称甾体激素，以环戊烷多氢菲为母核，按化学结构分为雄甾烷、雌甾烷和孕甾烷。甾烷母核由A、B、C、D4个环以不同方式稠合在一起，其中雄甾烷和孕甾烷的A环大多数含有4-烯-3-酮结构，如睾酮、皮质醇、孕酮。雌甾烷的结构特点为A环芳构化，C-3位上有酚羟基，C-17位上有羟基和酮基，天然雌激素有雌酮、雌二醇和雌三醇3种。由于官能团结构的不同，各种激素的化学性质差异较大，且大多数激素体内含量极微，因此寻找一种可靠、特异的能同时适应多种激素的分析方法成为临床疾病诊断的首要任务。
目前测定人体激素水平的常用方法是免疫分析法，包括化学发光免疫分析技术、放射免疫分析技术等。但传统的免疫法存在很多缺陷：一是灵敏度低，当样本浓度很低时，需要较大的样本量进行富集、纯化；二是适用性差，待测物的抗体易与结构相似的内源性物质或代谢产物产生交叉反应，造成假阳性结果；三是分析效率低，通常一次只能测定一种物质，无法同时进行多种激素的定性和定量分析。随着质谱在临床上的广泛推广和普及，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)在临床检测领域的应用逐渐扩大，与免疫分析法相比，具有多组分、高特异性等优点，能够实现临床样本中对待测物更高准确度的定量分析。但是，现有的质谱检测过程通常使用萃取剂对目标物进行萃取，然后用洗脱溶剂将目标物从萃取剂上洗脱下来，再对洗脱溶液进行浓缩，通过液相色谱分离，最后进行质谱检测。该过程步骤繁琐、耗时较长、分析效率低。
纸喷雾电离技术是一种新型的常压电离技术，其原理是将三角形纸基质作为样品分离和电离的载体，在分析时将样品或喷雾溶剂滴加到纸基质上，在外加电源的条件下，目标分析物被离子化，随后进入检测器进行检测。纸喷雾技术不仅能够从一定程度上克服传统电离技术的缺点，而且操作简单、价格低廉、无需对产品进行复杂的预处理。但是，传统的纸喷雾只有一张纸，复杂样品的基质去除不干净，检测的灵敏度低。因此，需要发展一种新的纸喷雾质谱检测方法，实现激素等小分子的快速、高通量检测分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种激素检测的多层纸喷雾质谱检测装置及方法，将复杂样本的提取、分离、富集、电离和检测融为一体，解决传统免疫方法和液相色谱串联质谱法检测血清中痕量激素存在的诸多问题，最终实现痕量目标物的高效、快速、便捷检测。
本发明所提供的纸喷雾质谱检测装置，包括纸基质、质谱仪、注射装置和金属夹；
所述纸基质由多层滤纸重叠而成，且最下层的所述滤纸作为喷雾层基底，所述喷雾层基底的一端形成电喷雾发生端；
所述金属夹的一端用于连接高压直流电源，另一端用于夹住所述纸基质，且所述纸基质的电喷雾发生端对准所述质谱仪的进样锥口；
所述注射装置用于向所述纸基质中的所述喷雾层基底注射洗脱剂。
具体地，所述纸基质由固定夹固定。
具体地，所述喷雾层基底的一端为三角形，形成所述电喷雾发生端；
所述电喷雾发生端的夹角可为28～32度。
优选地，所述纸基质由三层所述滤纸重叠而成；
所述喷雾层基底与上面两层所述滤纸之间设有塑料薄层，所述塑料薄层上设有一通孔(以使样品经过滤纸分离能顺利进入最下面的喷雾层基底)；所述塑料薄层能够阻隔洗脱剂扩散至上面两层所述滤纸上，防止遗留在上层滤纸中的杂质进入最下面的所述喷雾层基底上，避免干扰质谱信号。通孔的设置则可以保证在不干扰喷雾的情况下，样品经过滤纸分离能顺利进入最后一层用于喷雾的纸基质。
优选地，所述金属夹为铜夹。
本发明进一步提供了激素的纸喷雾质谱检测方法，包括如下步骤：
S1、将待测样品滴加于所述纸喷雾质谱检测装置中的纸基质上，对待测样品中的目标物进行分离和提取；
S2、采用所述金属夹夹住所述喷雾层基底，所述金属夹的另一端连接高压直流电源；
S3、采用所述注射装置向所述喷雾层基底上注射洗脱剂，同时开启所述高压直流电源，向所述纸基质施加直流高压电，则所述目标物在所述纸基质上解吸附的同时，在所述纸基质的电喷雾发生端形成电喷雾，所述电喷雾被所述质谱仪接收，实现检测。
上述的纸喷雾质谱检测方法中，步骤S1中，在1～3min内实现所述分离和提取。
上述的纸喷雾质谱检测方法中，步骤S1中，所述待测样品可为血清；
所述待测样品的用量可为10～100μL。
上述的纸喷雾质谱检测方法中，步骤S3中，施加的直流高压电的电压为3～4kV；
注射的所述洗脱剂的体积为1～10μL；
所述洗脱剂为含米诺地尔内标的甲醇溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明将简易、实用的多层纸喷雾装置与纸喷雾质谱法的特点相结合，取代高成本的液相色谱，基于多层纸基质的分离作用，集提取、富集、分离、电离和检测为一体，实现分析复杂基质样品中多种激素的目的。
2、纸基质的纤维素通道可以将蛋白质等大分子截留在上层，其亲水性可以将无机盐等水溶性分子截留，非水溶性的激素等目标物可以顺利进入最下层。纸基质和目标物之间没有化学键等相互作用，可以使目标物更容易地在洗脱剂的洗脱作用下解吸，实现痕量分析物的检测。
3、本发明检测方法无需对样品进行预处理过程，采用纸基质分离、提取后，直接进行脱附、电离、检测，具有操作简单、成本廉价、高效快速的优势。
附图说明
图1为本发明多层纸喷雾质谱检测装置使用状态示意图。
图2为本发明方法检测三种激素分子和内标分子的质谱图。
图3为本发明方法检测三种雄激素的标准曲线(图3(a)-图3(c)分别为睾酮、雄酮和雄烯二酮的标准曲线)。
图中各标记如下：
1质谱仪、2高压直流电源、3喷雾层基底、4塑料膜、5第二层滤纸、6第一层滤纸。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的激素的多层纸喷雾质谱检测装置包括纸基质、质谱仪、金属夹和注射装置。
其中，纸基质由多层滤纸重叠而成，最下面一层滤纸作为喷雾层基底，其一端为三角形，作为电喷雾发生端，其夹角可为28～32度。具体地可按照下述方法制备纸基质：将滤纸剪成三角形作为喷雾层基底，再将滤纸裁剪出两个正方形作为纸基质的第一和第二层，重叠放在喷雾层的上方，喷雾层和上述两层纸基质中间加一个塑料薄层，采用固定夹夹住这几层滤纸。
其中，金属夹的一端与高压直流电源连接，另一端夹住喷雾层基底，使喷雾层基底的电喷雾发生端对准质谱仪的进样口，优选地，金属夹为铜夹，高压直流电源的电压为3～4kV。
其中，注射装置的出口端与管道的一端连接，管道的另一端延伸至喷雾层基底上，用于将洗脱液注射至纸基质上，对纸基质上的目标物进行解吸附。
利用本发明多层纸喷雾质谱检测装置进行检测时，可按照下述步骤进行：
采用纸基质对样品进行预处理：将将标准品或血清等样本滴在纸基质(最上层)上，通过纸基质对样本中的目标物进行分离、提取，时间可为1～3min；样本的用量可为10～100μL；
将最下层的喷雾层基底用金属夹夹住，用于施加高电压，向最下层的喷雾层基底上注射洗脱剂的同时对纸基质施加正高压电，目标物在纸基质上解吸附的同时，在纸基质的尖端形成电喷雾；其中，洗脱剂的体积可为1～10μL，洗脱剂为含10ppb米诺地尔内标的甲醇溶液；向纸基质施加的电压为3～4kV；
电喷雾被质谱仪接收，进行检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
如图1所示，为本发明提供的激素的多层纸喷雾质谱检测装置的使用状态的示意图，包括纸基质、质谱仪1、高压直流电源2、注射器(图中未标)。
由下至上，纸基质由喷雾层基底3、塑料膜4、第二层滤纸5和第一层滤纸6重叠而成，按照下述方法制作纸基质：将滤纸剪成三角形作为喷雾层基底3，再将滤纸裁剪出两个正方形作为纸基质的第一层滤纸6和第二层滤纸5，重叠放在喷雾层基底3的上方，喷雾层基底3和上述两层纸基质中间加一层塑料膜4，其上设有一通孔，将这几层纸基质用固定夹(图中未示)夹住，构成样品前处理所需要的纸基质。
金属夹的一端连接高压直流电源2，另一端夹住纸基质，且纸基质的电喷雾发生端对准质谱仪1的进样锥口。
注射器用于向纸基质中的喷雾层基底3注射洗脱剂。
使用本发明装置进行检测时，将血清等样本滴在喷雾层基底上，实现目标分子在复杂基体样本的分离、提取；待该纸基材料充分干燥后，通过加入洗脱溶剂使激素从该纸基材料上洗脱下来，最后通过外加电源的作用使待测物离子化，进入质谱进行检测。
下面利用本发明方法进行如下检测(其中，检测装置采用的质谱仪为QE-Orbitrap质谱仪，美国热电公司)：
对含有不同浓度(0.02～2μg/L)睾酮、雄烯二酮和雄酮以及相同浓度(10μg/L)米诺地尔(用作内标)样品溶液进行纸喷雾质谱检测，通过一级和二级质谱图鉴定最终的待测物为睾酮、雄烯二酮、雄酮和内标物，如图2所示的质谱图，其中，质谱的检测条件为：毛细管温度350℃，透镜电压：50V，分辨率35000，AGC目标106，最大进样时间10ms，微扫描1。
以睾酮、雄烯二酮和雄酮的浓度之比为横坐标，以检测到的睾酮、雄烯二酮和雄酮和内标的强度之比为纵坐标，得到如图3所示的标准曲线，可以看出，三种雄激素通过对照内标的二级质谱子离子峰强度都能得到良好的定量效果，且线性范围在0.02～2μg/L，证明本发明方法适合用于多种激素的同时定量分析。
进一步地，采用血清加标回收实验证明了本发明方法的可靠性，按照本发明检测方法对加标血清样品中的睾酮、雄烯二酮和雄酮进行纸喷雾质谱检测，得到的结果如表1所示。
表1加标回收实验
| 目标物 | 加入量(μg/L) | 检测量(μg/L) | 回收率/％ | RSD/％(n＝5) |
| 睾酮 | 0.15 | 0.16±0.008 | 104.8 | 5.6 |
| 0.45 | 0.48±0.015 | 106.7 | 3.4 | |
| 0.90 | 0.87±0.054 | 97.1 | 6.0 | |
| 1.50 | 1.38±0.063 | 92.1 | 4.2 | |
| 雄酮 | 0.15 | 0.16±0.010 | 103.8 | 6.6 |
| 0.45 | 0.45±0.015 | 98.8 | 3.3 | |
| 0.90 | 0.87±0.045 | 96.6 | 5.0 | |
| 1.50 | 1.46±0.078 | 97.5 | 5.2 | |
| 雄烯二酮 | 0.15 | 0.15±0.005 | 97.4 | 3.1 |
| 0.45 | 0.44±0.038 | 97.8 | 8.5 | |
| 0.90 | 0.94±0.060 | 103.9 | 6.7 | |
| 1.50 | 1.54±0.075 | 102.4 | 5.0 |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种激素的纸喷雾质谱检测方法，包括如下步骤：
S1、将待测样品滴加于纸喷雾质谱检测装置中的纸基质上，对待测样品中的目标物进行分离和提取；
所述纸喷雾质谱检测装置包括所述纸基质、质谱仪、注射装置和金属夹；
所述纸基质由多层滤纸重叠而成，且最下层的所述滤纸作为喷雾层基底，所述喷雾层基底的一端形成电喷雾发生端；
所述金属夹的一端用于连接高压直流电源，另一端用于夹住所述纸基质，且所述纸基质的电喷雾发生端对准所述质谱仪的进样锥口；
所述注射装置用于向所述纸基质中的所述喷雾层基底注射洗脱剂；
所述待测样品为血清；
S2、采用所述金属夹夹住所述喷雾层基底，所述金属夹的另一端连接高压直流电源；
S3、采用所述注射装置向所述喷雾层基底上注射洗脱剂，同时开启所述高压直流电源，向所述纸基质施加直流高压电，则所述目标物在所述纸基质上解吸附的同时，在所述纸基质的电喷雾发生端形成电喷雾，所述电喷雾被所述质谱仪接收，实现检测。
2.根据权利要求1所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：所述纸基质由固定夹固定。
3.根据权利要求1或2所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：所述喷雾层基底的一端为三角形。
4.根据权利要求3所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：所述电喷雾发生端的夹角为28～32度。
5.根据权利要求4所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：所述纸基质由三层所述滤纸重叠而成；
所述喷雾层基底与上面两层所述滤纸之间设有塑料薄层，所述塑料薄层上设有一通孔。
6.根据权利要求5所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：所述金属夹为铜夹。
7.根据权利要求6所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：步骤S1中，在1～3min内实现所述分离和提取。
8.根据权利要求7所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：步骤S1中，所述待测样品的用量为10～100μL。
9.根据权利要求8所述的纸喷雾质谱检测方法，其特征在于：步骤S3中，施加的直流高压电的电压为3～4kV；
注射的所述洗脱剂的体积为1～10μL；
所述洗脱剂为含米诺地尔内标的甲醇溶液。
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