CN105575753A

CN105575753A - 用于质谱分析的电喷雾离子源装置、离子化方法及包含该离子源装置的质谱仪

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Publication number: CN105575753A
Application number: CN201410528504.0A
Authority: CN
Inventors: 徐伟; 张玫
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2014-10-09
Publication date: 2016-05-11

Abstract

本发明提供了一种用于质谱分析的电喷雾离子源装置，包括：吸水部件；至少一层透析膜，位于所述吸水部件上；导电部件，设置于所述透析膜；其中，所述透析膜具有至少一个尖端。本发明还提供了一种用于质谱分析的电喷雾离子化方法及一种质谱仪。本发明的电喷雾离子化方法应用于质谱分析，能够避免待测样品的复杂前处理，实现快速地对少量样品进行直接分析，同时又能有效的去除盐类等引起的基质效应的质谱离子化方式。

Description

用于质谱分析的电喷雾离子源装置、离子化方法及包含该离子源装置的质谱仪

技术领域

本发明涉及一种离子源装置及离子化方法，具体为一种用于对复杂基质中生物样本检测的离子源装置及离子化方法。

背景技术

质谱(massspectrometry,MS)是一种功能强大的分析工具，具有灵敏度高、分辨率高、分析速度快、样品用量少以及高通量等优点，因此在分析方法中愈发显示出无以伦比的优势。在质谱检测中，质量分析器是通过对离子的检测反推获得待测分子的分子量及结构信息，因此待测分子首先需要在离子源处实现离子化。

自1984年约翰芬恩(JohnFenn)发明了电喷雾电离源(ESI)以来，极大地促进了质谱技术在大分子分析领域，特别是生物大分子领域的广泛使用[J.Phys.Chem.1984,88,4451]。目前，在质谱前端串联液相色谱的方法，依然在生命科学的研究中起着极其重要的作用，例如对疾病生物标志物的探索及病理机制的研究等等。然而，质谱方法的使用中仍然存在一个瓶颈，即基质效应的干扰。

在分析化学中，基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质效应是指，基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。在ESI-MS分析中，基质效应是在非挥发性的基质成分与待测物质离子间形成带电液滴的竞争过程中产生的。非挥发性的基质成分会将待测成分紧紧包裹起来，妨碍了待测物质拆分成更小的液滴。在生物样品中，基质主要是内源性成分，包括有机物(如：糖类和胺类物质)和无机物(如：无机盐)。外源性的成分也可能在样品处理过程中被引入，从而也可能引起基质效应。

常见的消除或降低基质效应的方法大多比较耗时，例如：1)优化前处理方法；2)以稳定同位素标记的物质作为内标物；3)采用色谱分离手段。近期，报道了一系列在大气压电离方法，使得被测物质可以在环境条件下直接被电离，从而无需样品制备、预分离等前处理过程，简化了质谱分析流程。这些方法例如：解吸电喷雾电离(DESI)、实时直接分析(DART)以及纸喷雾电离(PS-MS)等。随着快速分析已成为分析领域中的新趋势，既可以用于直接分析以节约前处理时间，又可以同时去除基质效应以提高分析灵敏度，达到可定量分析生物样品的质谱离子化方法已成为人们分析工作中迫切的需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于质谱分析的电喷雾离子源装置，包括：吸水部件；至少一层透析膜，位于所述吸水部件上；导电部件，设置于所述透析膜；其中，所述透析膜具有至少一个尖端。

根据本发明的一实施方式，其中所述透析膜为多层，依次叠置于所述吸水部件上，且各层透析膜的截留分子量依次增大，距离所述吸水部件最远的透析膜的截留分子量最大。

根据本发明的另一实施方式，其中所述透析膜为两层，包括第一透析膜和第二透析膜，所述第二透析膜位于所述吸水部件上，所述第一透析膜位于所述第二透析膜上，所述第一透析膜的截留分子量大于所述第二透析膜，所述第一透析膜和所述第二透析膜均包括样品承载部和所述尖端，所述第一透析膜的样品承载部与所述第二透析膜的样品承载部重叠，所述第一透析膜的尖端与所述第二透析膜的尖端相互错开。

根据本发明的另一实施方式，其中所述透析膜的形状为三角形。

根据本发明的另一实施方式，其中所述导电部件为导电夹子。

本发明还提供了一种用于质谱分析的电喷雾离子化方法，包括：将至少一层透析膜放于吸水部件上，所述透析膜至少具有一个尖端，使所述透析膜的尖端指向质谱仪进样口；将待测样品置于所述透析膜上；静置一等待时间后通过一导电部件向所述透析膜施加高压电；向所述透析膜上添加冲洗溶剂；在高压电场及所述冲洗溶剂的作用下，所述待测样品离子化并形成喷雾。

根据本发明的另一实施方式，其中所述透析膜为两层，包括第一透析膜和第二透析膜，所述第二透析膜位于所述吸水部件上，所述第一透析膜位于所述第二透析膜上，所述第一透析膜和所述第二透析膜均包括样品承载部和所述尖端，所述第一透析膜的样品承载部与所述第二透析膜的样品承载部重叠，所述第一透析膜的尖端与所述第二透析膜的尖端具有一夹角θ；使所述第一透析膜的尖端指向所述质谱仪进样口，将包括第一样品和第二样品的待测样品放置于所述第一透析膜的承载部上，所述第一样品的分子量大于第二样品，在高压电场及所述冲洗溶剂的作用下，所述第一样品在所述第一透析膜的尖端形成离子化喷雾；将所述吸水部件旋转θ角度，使所述第二透析膜的尖端指向所述质谱仪进样口，进行所述第二样品的离子化喷雾。

根据本发明的另一实施方式，其中所述待测样品为蛋白，所述方法包括：将与所述蛋白相匹配的抗体包被于所述透析膜上；将带有所述抗体的透析膜放入所述蛋白的溶液中反应，使所述蛋白与所述抗体相结合，将所述透析膜贴放于所述吸水部件上；向所述透析膜上加载破坏所述蛋白与所述抗体结合的缓冲液，待所述缓冲液滤出所述透析膜，对所述透析膜施加高压电与冲洗溶剂进行离子化喷雾。

根据本发明的另一实施方式，其中所述等待时间为10-40s。

根据本发明的另一实施方式，其中向所述透析膜施加2-4kV的高压电。

根据本发明的另一实施方式，其中所述冲洗溶剂为醇、水和甲酸的混合物。

根据本发明的另一实施方式，其中所述醇、水和甲酸的体积比为(50-70):(50-30):(0.1-0.5)。

本发明进一步提供了一种质谱仪，包括上述任一项的离子源装置。

本发明的离子源装置及方法应用于质谱分析，能够避免待测样品的复杂前处理，实现快速地对少量样品进行分析，同时又能有效的去除盐类等引起的基质效应的质谱离子化方式。

附图说明

图1为本发明一实施方式的用于质谱分析的电喷雾离子源装置的结构示意图；

图2为本发明另一实施方式的双层膜离子源装置的结构示意图；

图3为本发明一实施方式的离子化过程的示意图；

图4A至4C为本发明实施例1的离子化过程的扫描电镜；

图5A至5D依次为本发明实施例2至5的使用不同截留分子量的透析膜的质谱检测信噪比；

图6为本发明实施例6的不同外加电压下的质谱响应图；

图7为本发明实施例7至8的使用不同冲洗溶剂的质谱图；

图8为本发明实施例9的选择不同等待时间的质谱图；

图9A为本发明实施例10与对比例1的100μg·mL^-1孕酮溶液的质谱图；

图9B为本发明实施例11与对比例2的10μg·mL^-1肽段MRFA溶液的质谱图；

图9C为本发明实施例12与对比例3的10μg·mL^-1血管紧张素II溶液的质谱图；

图9D为本发明实施例13与对比例4的0.5mg·mL^-1细胞色素C溶液的质谱图；

图10A为本发明实施例14与对比例5的孕酮溶液的质谱图；

图10B为本发明实施例15与对比例6的MRFA溶液的质谱图；

图10C为本发明实施例16与对比例7的血管紧张素II溶液的质谱图；

图10D为本发明实施例17与对比例8的细胞色素C溶液的质谱图；

图11A为本发明实施例18的质谱图；

图11B为本发明对比例9的质谱图；

图12A为本发明实施例19的质谱图；

图12B为本发明对比例10的质谱图；

图13A为本发明实施例20的质谱图；

图13B为本发明对比例11的质谱图；

图14A为本发明实施例21的质谱图；

图14B为本发明对比例12的质谱图；

图15A为本发明实施例22的质谱图；

图15B为本发明对比例13的质谱图；

图16A、16B为本发明实施例23的质谱图；

图17为本发明实施例24的质谱图；

图18为本发明实施例25的质谱图；

图19为本发明实施例26的质谱图；

图20为本发明实施例27的质谱图；

图21、22为本发明实施例28的质谱图；

图23为本发明实施例29的质谱图。

具体实施方式

体现本发明特征与优点的典型实施例将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施例上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的描述及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。

如图1所示，本发明一实施方式的用于质谱分析的电喷雾离子源(MESI)装置，包括：吸水部件1；透析膜2，位于吸水部件1上；导电部件3，设置于透析膜2。

导电部件3为向透析膜2施加高压电场的导体，其可以为但不限于金属导电夹子，例如可以为铜导电夹。

透析膜2的截留分子量可以为100-500Da、1kDa、3.5kDa、8-14kDa，但不限于以上所述。

本发明的透析膜2均具有至少一尖端，即进样端，将该尖端正对质谱仪进样口，并使导电部件3、尖端、质谱仪进样口位于同一直线上，便于在质谱仪进样口实现样品的电喷雾。本发明中透析膜2的尖端可以为一锐角、直角或钝角，其角度优选为40-150°，本发明对透析膜2的具体形状没有限定，其可以为前部具有一尖端，后部呈圆弧形的不规则形状；也可以是规则的三角形，优选为等边三角形，边长可以为5-10mm，优选为7mm。

本发明中，透析膜2可以为多层，例如两层、三层或更多层，依次叠置于吸水部件1上，且各层透析膜2的截留分子量依次增大，距离吸水部件1最远的透析膜的截留分子量最大。

在本发明的一实施方式中，电喷雾离子源装置包括双层透析膜。如图2所示，离子源装置包括：吸水部件1；第二透析膜22，位于吸水部件1上；第一透析膜21，位于第二透析膜22上；第一透析膜21的截留分子量大于第二透析膜22，第一透析膜21和第二透析膜22均包括样品承载部和尖端，第一透析膜21的样品承载部位于第二透析膜22的上部，两个样品承载部相重叠，第一透析膜21的尖端与第二透析膜22的相互错开，两个尖端指向不同的方向，使得两个尖端之间具有一夹角θ，该夹角大于0°小于等于180°，优选为60°。

本发明还提供了一种电喷雾离子化方法，包括：将具有至少一个尖端的透析膜贴放于吸水部件上；将待测样品加载至所述透析膜上；静置一段时间后通过一导电部件向所述透析膜施加高压电；向所述透析膜上添加冲洗溶剂；在高压电场及所述冲洗溶剂的作用下，所述待测样品离子化并形成喷雾。其中，可先将吸水部件用水或其它溶剂润湿，再将透析膜置于吸水部件上，以使透析膜贴附于吸水部件。

图3所示为电喷雾离子化方法的一实施方式，包括：将三角形的透析膜2紧密贴放于已用纯净水润湿的吸水部件1上，使其前端的一角超出吸水部件2的边界并正对质谱仪进样口5；将待测样品溶液4滴加于透析膜2的中心位置，待测样品溶液4包括样品M、基质分子m、阴离子A^-、阳离子C⁺以及质子H⁺；将透析膜2静置一段时间，以便待测样品溶液4中的基质分子m及离子A^-、C⁺、H⁺滤过透析膜2；之后通过导电部件3向透析膜2施加高压电，并同时向透析膜2的后端加冲洗溶剂；在高压电场及冲洗溶剂的作用下，样品M向透析膜2的前端运动，在前端的一角产生样品离子并形成喷雾。

本发明的包括双层透析膜的电喷雾离子化方法的一实施方式包括，使第一透析膜21的尖端正对质谱仪进样口，并将样品M和第二样品Mˊ上样至第一透析膜21的样品承载部，分子量较大的样品M会保留在第一透析膜21的样品承载部，分子量较小的第二样品Mˊ会穿过第一透析膜21到达第二透析膜22的样品承载部并滞留于此，而基质分子m、阴离子A^-、阳离子C⁺以及质子H⁺依次穿过第一透析膜21的样品承载部、第二透析膜22的样品承载部后被吸水部件1吸收，具体如图2所示。随后，通过导电部件3给透析膜施加高压电，进行样品M的离子喷雾。最后，移除第一透析膜21，将离子源装置转动θ角，使第二透析膜22的尖端正对质谱仪进样口，通过导电部件3给第二透析膜22施加高压电，进行第二样品Mˊ的离子喷雾，从而达到了一次质谱运行检测两个不同分子量样品的目的。本发明可根据待测样品的分子量选择不同截留分子量的透析膜，且透析膜的数目不限于一层、两层，也可以为更多层。本发明中，第一透析膜和第二透析膜的尖端之间具有一夹角θ，以便于第一透析膜21的移除。

在本发明的电喷雾离子化方法的另一实施方式中，待测样品为蛋白，将与所述蛋白相匹配的抗体包被于所述透析膜上；将带有所述抗体的透析膜放入所述蛋白的溶液中反应，反应温度可以为20-40℃，使所述蛋白与所述抗体相结合，之后将所述透析膜贴放于所述吸水部件上；向所述透析膜上加载破坏所述蛋白与所述抗体结合的缓冲液，例如硫酸铵溶液，待所述缓冲液滤出所述透析膜，对所述透析膜施加高压电与冲洗溶剂进行离子化喷雾。

本发明对蛋白样品及抗体的种类没有限定，例如可以为细胞色素C及其抗体。对蛋白溶液的溶剂也没有限定，其可以为水，也可以为其它适宜的溶剂。

本发明中，吸水部件1用于承载透析膜2并吸收滤过透析膜2的小分子及离子，其可以为由吸水材料制成的部件，优选为滤纸。本发明对所用滤纸的数量没有限定，可以为单层、双层或更多层。

本发明中，等待时间可以为10-40s，优选为20-35s，进一步优选为30s。高压电场的电压可以为2-4kV，优选为3.2-4kV，进一步优选为3.5kV。所用的溶剂可以为甲醇、水和甲酸的混合物，三者的体积比优选为60:40:0.1。

本发明对向透析膜施加高压电及向透析膜添加冲洗溶剂的先后顺序没有限定，可以先施加高压电后添加冲洗溶剂；也可以先添加冲洗溶剂后施加高压电；还可以两者同时进行。

本发明中，冲洗溶剂由能与水互溶的有机溶剂和水混合而成，使用有机溶剂的目的是防止待测物质在高比例水相溶液中析出，冲洗溶剂可加入少量挥发性酸，如甲酸，其作用在于提供质子，有利于待测物质的离子化。冲洗溶剂优选为醇、水及甲酸组成的混合绒里，例如可以为甲醇或乙醇、水与甲酸组成的混合溶剂。本发明中，冲洗溶剂的种类不限于以上描述，其也可以为乙腈、水与甲酸组成的混合溶剂。

下面，结合具体实施例对本发明的电喷雾离子源装置及离子化方法做进一步说明。本发明的盐类NaCl的浓度均指质量百分比浓度，以样品溶液的总重量为基准。所使用的孕酮溶液的溶剂为甲醇，肽段MRFA溶液、细胞色素C溶液、血管紧张素II溶液的溶剂均为水。各实施例所涉及的离子化方法及质谱测试的条件基本相同，以优化后所选最优条件为准，不同之处已在各实施例中进行说明。

其中所涉及的细胞色素C(95％,SDS-PAGE)、血管紧张素II(色谱级)、肽段甲硫氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸乙酸盐(MRFA，色谱级)、孕酮(≥99％)、尿素(99.0-100.5％)及甲酸(色谱级)购自Sigma-Aldrich(美国)；cytochromeC抗体(货号：MAB898)购自R&Dsystems(美国)；甲醇(色谱级)购自FisherScientific(美国)；纯净水购自娃哈哈集团；透析膜(截留分子量100-500Da、1kDa、3.5kDa、8-14kDa)购自上海易佰聚经贸有限公司；所有无机物和滤纸购自国药集团化学试剂北京有限公司。血液、尿液、唾液、泪液均由健康人志愿者提供，符合医学伦理学要求。

所使用的仪器有：离子阱质谱仪(HCTUltraPTMDiscoverySystem,Bruker，德国)、倒置荧光显微镜(IX70,Olympus，日本)、电子天平(AR2140,OHAUSCorp.，美国)、扫描电子显微镜(SU8010,Hitachi，日本)、旋涡混合器(MVS-1，北京金北德工贸有限公司)、离心机(Biofuge22R,HeraeusSepatech.Inc.，德国)、-80℃超低温冰箱(Forma-86C,Thermo，美国)和4℃、-20℃冰箱(BCD-206YH，青岛海尔股份有限公司)。

实施例所涉及的信噪比的计算方法为：将待测物质的峰高比上出峰时相似保留时间的基线峰高。基线峰高的获取方法为随机三小段基线取平均值。

本发明实施例中MESI-MS和nanoESI-MS的质谱条件均为：采用氮气作为干燥气，流速为10L·min^-1，温度为150℃；正离子模式时毛细管电压为-1kV；正离子模式时毛细管电压为+1kV。m/z范围根据每次测试的待测物质分子量而选定。采用MESI离子化方式需额外施加高压电，nanoESI离子化方式无外加电压。nanoESI毛细管喷针由硼硅酸盐玻璃毛细管(外径1.5mm；内径0.86mm)由微吸液管拉制器(P97Flaming/Brownmicropipettepuller,SullerInstruments，美国)制得，拉制所得毛细管喷针尖端外径约20μm。

实施例1电喷雾离子化过程检测

将100-500Da的透析膜剪成边长为7mm的等边三角形，并紧密贴放于已用纯净水润湿的双层滤纸上，使透析膜前端的一角超出滤纸边界并正对前方的质谱仪进样口。将2μL浓度为1mg·mL^-1的孕酮溶液上样于透析膜的正中，等待30s以便溶液中的小分子盐类等物质得以滤过透析膜。之后，在透析膜后端通过铜导电夹施加3.5kV的外加高压电，同时在透析膜上孕酮样品的后端加入8μL甲醇:水:甲酸＝60:40:0.1(v/v)的混合液作为冲洗溶剂，在3.5kV高压电的作用下，孕酮随冲洗溶剂移至透析膜超出滤纸边界的一角，并在质谱仪进样口形成喷雾以进行质谱检测。

图4A至4C为上述过程中的扫描电镜照片，其中图4A为孕酮样品上样前的透析膜；图4B为孕酮样品上样后的透析膜；图4C为加入冲洗溶剂后的透析膜。

通过图4A与图4B的对比，可清晰的看到，上样后样品会存在于透析膜的表面，由于透析膜与下层预先用水润湿的滤纸是紧密贴合的，因此样品中的基质，如无机盐，因其具有强亲水性，且分子量小，很容易通过透析膜的孔径，会被吸入至下层滤纸中，从而达到从样品中去除基质的目的。此时，需要对透析膜施加外加电压，再在透析膜上样品的后端加一定量的冲洗溶剂，在外加高电压的作用下，会使得样品向进样端方向移动，由于巨大电场的放电作用，继而在透析膜的尖端形成细腻的喷雾，使得分子带电从而可被质谱检测到。图4C显示的是经过冲洗溶剂冲洗后的透析膜，由图可知几乎所有的样品都被有效的冲离，仅有极微量的样品没有被冲洗溶剂冲向质谱进样口，从而表明本发明实施例的电喷雾离子化装置具有良好的定量分析潜力。

实施例2至5透析膜的选择

实施例2至5的测定方法与实施例1相同，故省略了相同技术内容的说明，所涉及的样品的相关信息参见表1。

表1

	测试样品	样品分子量	样品浓度	基质	基质浓度
						实施例2	孕酮	314.1Da	100μg·mL^-1	NaCl	5％
实施例3	肽段MRFA	524.3Da	10μg·mL^-1	NaCl	5％
						实施例4	血管紧张素II	1046.2Da	10μg·mL^-1	NaCl	5％
实施例5	细胞色素C	12.3kDa	100μg·mL^-1	NaCl	5％

不同的透析膜具有不同的截留分子量，因此我们需要针对不同分子量的待测物质选择与之相适宜的透析膜。为了使实验中去除基质效应更加明显，将较高比例的盐(5％NaCl)添加至待测物质中。实施例2-5分别选取了小分子、两种不同大小的肽段以及蛋白等分子量大小不等的模型样品进行考察，结果如图5A至5D所示。由图5A可知，对于分子量<500Da的小分子(如：孕酮)，离子化过程中使用截留分子量100-500Da的透析膜和使用截留分子量1kDa的透析膜的质谱响应没有太大差异，但两者均优于截留分子量3.5kDa的透析膜。如图5B所示，对于分子量为500Da左右的小肽(如：肽段MRFA)，截留分子量1kDa的透析膜具有较高的信噪比。而对于分子量>1kDa的分子(如：血管紧张素II)而言，截留分子量3.5kDa的透析膜是更为适宜的选择(如图5C所示)。蛋白分子(如：细胞色素C)由于分子量较大，应采用截留分子量较大的透析膜，但若孔径太大则待测样品也会有损失(如图5D所示)。

实施例6外加电压的选择

实施例6以10μg·mL^-1添加了0.85％NaCl的肽段MRFA为测试样品，通过施加不同外加电压，测试质谱检测所得信噪比，具体结果参见图6，图6所示结果可知，当外加电压<2kV时，不足以使得待测物质形成喷雾，因此没有质谱响应；继而，随着外加电压的升高，质谱响应值也升高，以3.5kV为具有最大响应值；但当电压过大以后质谱响应反而随电压的升高而降低。在实验中，我们观测到，过大的外加电压(>4kV)，会在膜的尖端与质谱进样口之间形成电弧，但无法得到质谱响应。

实施例7至8冲洗溶剂的选择

实施例7、8均以10μg·mL^-1添加了0.85％NaCl的肽段MRFA为测试样品，且分别以甲醇、水和0.1％甲酸混合液以及乙腈、水和0.1％甲酸混合液为冲洗溶剂测试质谱检测所得信噪比，具体结果参见图7，其中图7的横坐标表示甲醇或乙腈与水的体积比，甲酸的含量为体积含量，以甲醇或乙腈与水的总体积为基准。

图7的结果显示，以甲醇、水、甲酸的混合液作为冲洗溶剂得出的质谱响应结果优于乙腈、水与甲酸的混合液，且三者的体积比以甲醇:水:甲酸＝60:40:0.1(v/v)为最佳。

实施例9等待时间的选择

实施例9以100μg·mL^-1添加了5％NaCl的孕酮溶液为测试样品，通过采用不同的等待时间，测试质谱响应信号，具体结果参见图8。

由图8所示结果可知，最为适宜的等待时间为30s，时间过短不能有效去除基质效应，时间过长会使得透析膜变干发生卷曲，不易在卷曲的尖端形成细腻的喷雾，从而不利于质谱检测。

实施例10至13样品中NaCl浓度对质谱响应的影响

实施例10至13分别以含不同浓度NaCl的100μg·mL^-1的孕酮溶液、10μg·mL^-1的肽段MRFA溶液、10μg·mL^-1的血管紧张素II溶液以及0.5mg·mL^-1的细胞色素C溶液为测试样品，按照实施例1的方法(MESI)测试质谱响应信号，并与传统的nanoESI离子化方式(对比例1至4)相对照，具体信噪比结果参见图9A至9D。由图可知，基质(例如无机盐)浓度会影响质谱的离子化效率，信噪比随着样品中盐浓度的提高而下降，且MESI较nanoESI具有明显的去除基质效应提高检测灵敏度的能力。

实施例14至17模拟生理条件下不同浓度样品的质谱检测

实施例14至17分别以包含0.85％NaCl的孕酮、肽段MRFA、血管紧张素II以及细胞色素C为测试样品，分别对比了小分子、肽段或者蛋白在MESI和nanoESI(对比例5至8)条件下不同浓度样品的质谱响应，其目的在于考察检测的线性度，具体结果参见10A至10D。图10A至10D显示，无论何种样品，MESI和nanoESI均可以提供很好的线性度。MESI因具有去除基质的能力，从而提高检测灵敏度，较nanoESI在相对分子量较大的样品的检测中具有更大的线性范围。

实施例18至19MESI与nanoESI对比实际质谱图

MESI可以显著提高检测灵敏度，实施例18、19分别以含0.85％NaCl的肽段MRFA和含0.85％NaCl的细胞色素C作为样品，按照实施例1的方法(MESI)进行质谱检测，结果参见图11A、12A，并与nanoESI离子化质谱检测结果(对比例9、10)相对比。由图11A至12B可知，MESI的离子化方式与nanoESI相比有明显的去除基质效应的效果，灵敏度更高，其它杂质出峰更少。

实施例20至22MESI对其它缓冲液的去除效果

实施例20至22所用的样品的相关信息见表2，具体结果参见图13A、14A至15A。

表2

	测试样品	样品浓度	基质	基质浓度
					实施例20/对比例11	肽段MRFA	10μg·mL^-1	PBS	100mM
实施例21/对比例12	肽段MRFA	10μg·mL^-1	Tris-HCl(pH 8.0)	100mM
					实施例22/对比例13	肽段MRFA	10μg·mL^-1	EDTA·2Na	100mM

实施例20-22中的不同缓冲溶液，分别为生物实验中常用的PBS、Tris-HCl和EDTA·2Na溶液，均为在质谱分析中易引起基质效应的物质。由图13A、14A和15A可知，MESI技术对除了NaCl之外的其它小分子基质，也具有良好的去除效果，可帮助待测物质获得更高的质谱响应。

实施例23负离子模式下的基质效应

上述实施例均是在质谱正离子模式下进行的，本实施例以含0.85％NaCl的10μg·mL^-1MRFA溶液为测试样品，在负离子模式下进行质谱测定，结果如图16A、16B所示。

图16A表明，负离子模式下依然可以对样本进行有效地检测，图16B是对分子离子峰进行二级质谱的碎裂，其多个碎片峰表明，母离子m/z＝523.1确系肽段MRFA的分子离子峰。

实施例24至27真实样本

实施例24至27分别以泪液、尿液、血清和唾液样本的人体真实样本为测试样品，并分别向其中添加不同的肽段和蛋白样本，进行检测，样品的具体信息参见表3，实验结果如图17至20所示。其中图18中，MESI-MS检测到m/z＝514.1为血管紧张素II(分子量1046.2)的[M+2H]²⁺峰。

表3

	测试样品	添加物	添加物浓度
				实施例24	泪液	细胞色素C	0.5mg·mL^-1
实施例25	尿液	血管紧张素II	50μg·mL^-1
				实施例26	血清	肽段MRFA	50μg·mL^-1
实施例27	唾液	孕酮	100μg·mL^-1

实施例28两层膜MESI的质谱测试

本实施例的离子源装置包含两层透析膜，第二层透析膜位于滤纸上，其截留分子量为1kDa，第一层透析膜位于第二层透析膜上，其截留分子量为3.5kDa，两层透析膜的尖端错开一定角度，将含0.85％NaCl的肽段MRFA和细胞色素C的混合物上样至第一层透析膜上。分子量较大的细胞色素C将保留在第一层透析膜上，而肽段MRFA和溶液中的小分子盐类将穿过第一层透析膜到达截留分子量为1kDa的第二层透析膜上。肽段MRFA将被第二层透析膜保留，而无机盐将继续穿过第二层透析膜，最终被下面已润湿的滤纸吸收。首先将第一层透析膜的尖端对准质谱进样口，加载电压和冲洗溶剂后，细胞色素C被检测。之后，只需稍转动MESI离子源使第二层透析膜的尖端对准质谱进样口，移除第一层透析膜，采用冲洗溶剂对第二层膜进行冲洗，MRFA即可被轻松检测到。测得的质谱图参照图21-22。在MESI技术的使用中，可灵活地将不同截留分子量的多层透析膜叠加使用，以达到一次质谱运行检测多个不同分子量待测物质的目的。

实施例29MESI技术与抗体结合使用

本实施例在采用MESI技术检测蛋白样品(细胞色素C)时，将与该蛋白相匹配的细胞色素C抗体先包被在透析膜上，再将带有抗体的透析膜放入蛋白溶液中于37℃反应15分钟，使蛋白与抗体相结合。反应结束后，用纯净水小心冲洗膜表面。将膜夹在已润湿的滤纸上，小心在透析膜上加载破坏抗原与抗体结合的缓冲液(7mol·L^-1尿素溶液)，待缓冲液从透析膜孔径中被下层滤纸吸收(该过程重复2-3次)，此时再对MESI施加高压电与冲洗溶剂，即可检测膜上的蛋白样品，具体结果如图23所示。蛋白与抗体具有结合特异性，因此MESI与抗体结合的方法，可以检测到极为痕量的蛋白样品(ng·mL^-1级别)，且经实验证明，该方法也可以得到较好的线性度，具有定量复杂基质中ng·mL^-1级蛋白的能力。这一实施实例，不仅实现了MESI提供超高检测灵敏度的功能，还可以用来测试抗体特异性，且简单快速，整个流程可在20分钟内完成。

对比例1至4

对比例1至4分别以含不同浓度NaCl的100μg·mL^-1的孕酮溶液、10μg·mL^-1的MRFA溶液、10μg·mL^-1的血管紧张素II溶液以及0.5mg·mL^-1的细胞色素C溶液为测试样品，并以现有的nanoESI方法测试质谱响应信号，具体结果参见图9A至9D。

对比例5至8

对比例5至8通过模拟生理条件，分别以包含0.85％NaCl的孕酮、肽段MRFA、血管紧张素II以及细胞色素C溶液为测试样品，并以现有的nanoESI测试质谱响应信号，通过改变样品浓度，获得如图10A至10D所示的结果。

对比例9至10

对比例9至10分别以含0.85％NaCl的肽段MRFA和含0.85％NaCl的细胞色素C作为样品，通过现有的nanoESI进行质谱测试，具体结果参见图11B、12B。

对比例11至13

对比例11至13分别以现有的nanoESI测试质谱响应信号，所用的样品的相关信息见表2，且该测试在质谱正离子模式下进行，具体结果参见图13B、14B和15B。

复杂基质对生物样本在质谱检测中的信号有很大程度的影响，尤以非挥发性盐最为突出，如磷酸盐(PBS)、氯化钠(NaCl)等。本发明实施例主要以NaCl为例考察本发明的电喷雾离子化方法对上述问题的改善情况。结果表明：本发明的电喷雾离子化方法能够避免待测样品的复杂前处理，实现快速地对少量样品进行分析，同时又能有效的去除盐类等引起的基质效应的质谱离子化方式。

为了使实验中去除小分子效应更加明显，本发明实施例2至5将较高比例的盐(5％NaCl)添加至不同分子量的测试样品中进行质谱检测，结果表明本发明的电喷雾离子源对透析膜没有选择性，可结合测试样品的分子量及样品的损耗选择适宜的透析膜。

本发明实施例6以肽段MRFA为测试样品通过改变所施加的高压电的电压进行了一系列质谱测试，结果表明外加电压在2.5-4kV间质谱响应较高，3.5kV时达到最佳。本发明还以其它物质为测试样品进行相同的测定，其结果与实施例6相同，故省去相关描述，因此，本发明的电喷雾离子化方法的外加电压优选为2.5-4kV，最优选为3.5kV。

本发明实施例7至8分别以肽段MRFA为测试样品通过改变冲洗溶剂的种类及比例进行了一系列质谱测试，结果表明以甲醇、水和甲酸的混合液充当冲洗溶剂测得的质谱响应效果较好，尤其是当甲醇和水的体积比介于(50-70):(50-30)之间时效果更好，以两者的体积比为60:40时最佳。本发明还以其它物质为测试样品进行相同的测定，其结果与实施例7相同，故省去相关描述，因此，本发明的电喷雾离子化方法的冲洗溶剂优选为甲醇、水和甲酸的混合液，三者的体积比优选为(50-70):(50-30):(0.1-0.5)，进一步优选为60:40:0.1。

本发明实施例10至13分别以孕酮溶液、MRFA溶液、血管紧张素II溶液以及细胞色素C溶液为测试样品，以现有的nanoESI以及本发明的离子化方法进行了质谱响应测试，结果显示随着测试样品中盐类物质NaCl比例的增加，nanoESI的质谱响应逐渐降低，其与本发明的质谱响应差距也逐渐增大，当测试样品中NaCl的含量高达5％时，nanoESI的质谱响应已经很微弱，而本发明的质谱响应仍保持在较高状态。由此表明，结合了生物膜技术的本发明实施例的离子源可以显著改善盐引起的离子抑制，而使得样品的离子化效率被提高，这种去基质效应在分析大分子时尤为明显，尤其在含盐比例高的样品中，信噪比可提升10-20倍。

本发明实施例14至17分别以包含0.85％NaCl的孕酮溶液、MRFA溶液、血管紧张素II溶液以及细胞色素C溶液为测试样品，比较不同样品浓度下测试质谱响应信号。对比例5至8以对应的相同条件下通过nanoESI测试质谱响应信号。从图10A至10D可以看出，模拟生理条件下两种离子化方式均具有样品浓度与质谱响应之间良好的线性关系。其中，含NaCl的样品，无论是小分子、多肽亦或蛋白样本在本发明的喷雾质谱检测中较现有的nanoESI的响应值高约1个数量级，且对于肽段和蛋白样本，本发明的电喷雾离子化方式使得质谱检测具有更宽的线性范围。

从图11A至12B所反映的实施例18至19与对比例9至10的对比结果可以看出，通过本发明的离子化装置进行质谱测试能够有效去除缓冲液及盐溶液的基质效应，以提高测试样品的灵敏度。

本发明将透析中所需的单向膜技术应用到质谱的离子化方式上，实现了一种快速的、可定性、定量分析检测多肽、蛋白等生物分子的膜喷雾质谱离子源。且本发明的方法在质谱正负离子模式下均可正常工作，进一步方便了质谱分析的进行。

本发明的电喷雾离子化(MESI)方法可显著提高对复杂生物样品中待测物质的分析灵敏度，采用MESI技术，样品中的基质可以通过选择适宜截留分子量的透析膜而选择性的去除，从而使得干扰质谱检测的基质效应得以尽可能的消除或者降低。MESI在使用上具有很高的灵活度，除了常规的使用方式，MESI结合多层膜的使用，可实现在一次质谱检测中同时分析多种待测物质；或者MESI配合抗体的使用，可对分析灵敏度有极大的提高，如实施例29所示，与传统nanoESI方法(对比例10及图12B)相比，采用MESI技术可将检测灵敏度提高500倍。

此外，在生命科学领域中，抗体特异性也是十分重要的问题，在这一实施方法中，也可作为检测抗体特异性的方法，例如将某待测抗体包被在透析膜上，再将透析膜置于已知蛋白的溶液中反应15分钟。因抗原抗体结合具有特异性，因而MESI-MS技术可快速的对抗体特异性做出判断。质谱在分析上较常规生物学手段具有更高灵敏度，因此采用MESI-MS判断抗体特异性，较常规生物学手段要更加快速而灵敏。常规生物学实验中抗原抗体结合时间通常为2小时至过夜，常规的生物学方法判断抗体特异性方法如蛋白免疫印迹法即蛋白质印迹杂交法，其灵敏度远低于质谱方法)。

除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims

1.一种用于质谱分析的电喷雾离子源装置，包括：

吸水部件；

至少一层透析膜，位于所述吸水部件上；

导电部件，设置于所述透析膜；

其中，所述透析膜具有至少一个尖端。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述透析膜为多层，依次叠置于所述吸水部件上，且各层透析膜的截留分子量依次增大，距离所述吸水部件最远的透析膜的截留分子量最大。

3.根据权利要求2所述的装置，其中所述透析膜为两层，包括第一透析膜和第二透析膜，所述第二透析膜位于所述吸水部件上，所述第一透析膜位于所述第二透析膜上，所述第一透析膜的截留分子量大于所述第二透析膜，所述第一透析膜和所述第二透析膜均包括样品承载部和所述尖端，所述第一透析膜的样品承载部与所述第二透析膜的样品承载部重叠，所述第一透析膜的尖端与所述第二透析膜的尖端相互错开。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，其中所述透析膜的形状为三角形。

5.根据权利要求4所述的装置，其中所述导电部件为导电夹子。

6.一种用于质谱分析的电喷雾离子化方法，包括：

将至少一层透析膜放于吸水部件上，所述透析膜至少具有一个尖端，使所述透析膜的尖端指向质谱仪进样口；

将待测样品置于所述透析膜上；

静置一等待时间后通过一导电部件向所述透析膜施加高压电；

向所述透析膜上添加冲洗溶剂；

在高压电场及所述冲洗溶剂的作用下，所述待测样品离子化并形成喷雾。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述透析膜为多层，依次叠置于所述吸水部件上，且各层透析膜的截留分子量依次增大，距离所述吸水部件最远的透析膜的截留分子量最大。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述透析膜为两层，包括第一透析膜和第二透析膜，所述第二透析膜位于所述吸水部件上，所述第一透析膜位于所述第二透析膜上，所述第一透析膜和所述第二透析膜均包括样品承载部和所述尖端，所述第一透析膜的样品承载部与所述第二透析膜的样品承载部重叠，所述第一透析膜的尖端与所述第二透析膜的尖端具有一夹角θ；使所述第一透析膜的尖端指向所述质谱仪进样口，将包括第一样品和第二样品的待测样品放置于所述第一透析膜的承载部上，所述第一样品的分子量大于所述第二样品，在高压电场及所述冲洗溶剂的作用下，所述第一样品在所述第一透析膜的尖端形成离子化喷雾；将所述吸水部件旋转θ角度，使所述第二透析膜的尖端指向所述质谱仪进样口，进行所述第二样品的离子化喷雾。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述待测样品为蛋白，所述方法包括：

将与所述蛋白相匹配的抗体包被于所述透析膜上；

将带有所述抗体的透析膜放入所述蛋白的溶液中反应，使所述蛋白与所述抗体相结合，并将所述透析膜贴放于所述吸水部件上；

向所述透析膜上加载破坏所述蛋白与所述抗体结合的缓冲液，待所述缓冲液滤出所述透析膜，对所述透析膜施加高压电与冲洗溶剂，进行离子化喷雾。

10.根据权利要求6至9任一项所述的方法，其中所述等待时间为10-40s。

11.根据权利要求6至9任一项所述的方法，其中向所述透析膜施加2-4kV的高压电。

12.根据权利要求6至9任一项所述的方法，其中所述冲洗溶剂为醇、水和甲酸的混合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述醇、水和甲酸的体积比为(50-70):(50-30):(0.1-0.5)。

14.一种质谱仪，包括权利要求1至5中任一项的离子源装置。