BR112020018828A2 - métodos para detecção de cromogranina através de uma espectrometria de massa - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se a métodos para detecção de cromogranina A através de espectrometria de massa. Em um outro aspecto, são providos aqui métodos para quantificação de cromogranina A através de espectrometria de massa. Em um outro aspecto, são providos aqui métodos para prognóstico de ou medição do tamanho de tumores neuroendócrinos através de espectrometria de massa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE CROMOGRANINA A ATRAVÉS DE UMA ESPECTROMETRIA DE MASSA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[0001] A presente invenção reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Nº. 62/644.210, depositado em 16 de março de 2018, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A cromogranina-A (CgA) é uma glicoproteína ácida de 50 kDa expressa nos grânulos secretores de tecido neuroendócrino. Atualmente, os níveis sanguíneos de CgA são principalmente medidos usando vários imunoensaios. No entanto, como com qualquer ensaio à base de anticorpo, limitações ocorrendo a partir de ligação não específica e uma faixa dinâmica reduzida exigindo diluição de amostra colocam obstáculos na implementação de tais testes em laboratórios de diagnóstico.

[0003] Um ensaio preciso e sensível para quantificação de cromogranina A é necessário.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] São providos aqui métodos para detecção ou determinação da quantidade de cromogranina A (CgA) em uma amostra através de espectrometria de massa, incluindo espectrometria de massa em tandem.

[0005] Em certas modalidades, os métodos providos aqui são para detecção ou determinação da quantidade de cromogranina A (CgA) compreendendo (a) purificar CgA na amostra; (b) ionizar CgA para produzir íons detectáveis através de espectrometria de massa; e (c) detectar ou determinar a quantidade dos íon(s) de CgA através de espectrometria de massa; em que a quantidade de íon(s) de CgA está relacionada à quantidade de CgA na amostra.

[0006] Em certas modalidades, os métodos providos aqui são para detecção ou determinação da quantidade de cromogranina A (CgA) compreendendo (a) submeter a amostra à extração em fase sólida; (b) digerir enzimaticamente CgA; (c) submeter a CgA à cromatografia líquida; (d) ionizar a CgA para produzir íons detectáveis através de espectrometria de massa; e (e) detectar ou determinar a quantidade de íon(s) de CgA através de espectrometria de massa; em que a quantidade de íon(s) de CgA está relacionada à quantidade de CgA na amostra.

[0007] Em certas modalidades, os métodos providos aqui compreendem espectrometria de massa com monitoramento de reação selecionada (SRM).

[0008] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui são totalmente automatizados.

[0009] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui são métodos livres de anticorpo.

[0010] Em algumas modalidades, purificação provida aqui compreende extração de soro usando extração em fase sólida (SPE). Em algumas modalidades, SPE é uma extração em fase sólida de troca aniônica. Em algumas modalidades, SPE é uma extração em fase sólida de troca aniônica de modo misto. Em algumas modalidades, amostras extraídas são concentradas.

[0011] Em algumas modalidades, purificação provida aqui compreende cromatografia líquida. Em algumas modalidades, a cromatografia líquida compreende cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Em algumas modalidades, a cromatografia líquida compreende cromatografia líquida de alta turbulência (HTLC).

[0012] Em algumas modalidades, amostras extraídas são enzimaticamente digeridas. Em algumas modalidades, amostras extraídas são enzimaticamente digeridas por tripsina.

[0013] Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização por eletropulverização (ESI). Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo positivo. Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo negativo.

[0014] Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização química à pressão atmosférica (APCI). Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo positivo. Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo negativo.

[0015] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon precursor tendo uma razão de massa-para-carga de 593,2±0,5.

[0016] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon precursor tendo uma razão de massa-para-carga de 729,6±0,5.

[0017] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de um fragmento de cromogranina A. Em algumas modalidades, o fragmento de CgA medido compreende uma sequência ELQDLALQGA (SEQ ID Nº:1). Em algumas modalidades, o fragmento de CgA medido compreende uma sequência RRPEDQELESLSAIEAELEK (SEQ ID Nº:4).

[0018] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon fragmento tendo uma razão de massa-para-carga de 516,3 ± 0,5 ou 815,5 ± 0,5 ou ambos.

[0019] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon fragmento tendo uma razão de massa-para-carga de 831,5±0,5 ou 989,5±0,5 ou ambos.

[0020] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem ainda adição de um padrão interno. Em algumas modalidades, o padrão interno é marcado isotopicamente. Em algumas modalidades, o padrão interno compreende aminoácidos marcados com C13N15. Em algumas modalidades, o padrão interno é marcado em leucina (L) ou lisina (K). Em algumas modalidades, o padrão interno compreende uma sequência ILSILRHQNLLKELQDLAL*QGAK*ERAHQQK (SEQ ID Nº:2), em que * é um aminoácido marcado com C13N15. Em algumas modalidades, o padrão interno compreende uma sequência RRPEDQELESL*SAIEAELEK* (SEQ ID Nº:5), em que * é um aminoácido marcado com C13N15.

[0021] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon precursor padrão interno tendo uma razão de massa-para-carga de 600,8 ± 0,5 e/ou íon de produto tendo uma razão de massa-para-carga de 602,4 ± 0,5, 830,6± 0,5 ou 958,7 ± 0,5.

[0022] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon precursor padrão interno tendo uma razão de massa-para-carga de 600,8 ± 0,5 e/ou íon de produto tendo uma razão de massa-para-carga de 734,6 ± 0,5, 839,5 ± 0,5 ou 997,6 ± 0,5.

[0023] Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 100 ng/mL. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 90 ng/mL. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 80 ng/mL. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 70 ng/mL. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 60 ng/mL. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 50 ng/mL.

[0024] Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menos do que ou igual a 50 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menos do que ou igual a 40 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menos do que ou igual a 35,5 ng/mL.

[0025] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem linearidade de quantificação em uma faixa entre 50 ng/mL a 50.000 ng/mL.

[0026] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem reprodutibilidade inter- e intraensaio de CV ≤15%.

[0027] Em algumas modalidades, CgA não é derivatizada antes da espectrometria de massa.

[0028] Em certas modalidades, a amostra é um fluido corporal. Em algumas modalidades, a amostra é fluido cerebrospinal (CSF). Em algumas modalidades, a amostra é plasma ou soro. Em algumas modalidades, a amostra é sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é saliva ou urina.

[0029] Em algumas modalidades, os métodos podem incluir adição de um agente à amostra em uma quantidade suficiente para desproteinar a amostra.

[0030] Em algumas modalidades, níveis elevados de cromogranina A comparado com uma faixa de referência indicam risco aumentado de tumores neuroendócrinos (NET). Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam o tamanho do tumor neuroendócrino. Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam a carga de tumor do tumor neuroendócrino. Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam a resposta a tratamento do tumor neuroendócrino. Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam o prognóstico de tumor neuroendócrino.

[0031] Como aqui usado, a menos que de outro modo declarado, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referência no plural.

Portanto, por exemplo, uma referência a "uma proteína" inclui uma pluralidade de moléculas de proteína.

[0032] Como aqui usado, o termo "purificação" ou "purificar" não se refere à remoção de todos os materiais da amostra exceto o(s) analito(s) de interesse. Ao contrário, purificação se refere a um procedimento que enriquece a quantidade de um ou mais analitos de interesse em relação a outros componentes na amostra que podem interferir com detecção do analito de interesse. As amostras são purificadas aqui através de vários meios para permitir remoção de uma ou mais substâncias de interferência, por exemplo, uma ou mais substâncias que interfeririam com a detecção de íons parentais e filhas de CgA selecionados através de espectrometria de massa.

[0033] Como aqui usado, o termo "amostra de teste" se refere a qualquer amostra que possa conter CgA. Como aqui usado, o termo "fluido corporal" significa qualquer fluido que possa ser isolado do corpo de um indivíduo. Por exemplo, "fluido corporal" pode incluir sangue, plasma, soro, bile, saliva, urina, lágrimas, perspiração e similar.

[0034] Como aqui usado, o termo "derivatização" significa reagir duas moléculas para formar uma molécula nova. Agentes de derivatização podem incluir grupos isotiocianato, grupos dinitro- fluorfenila, grupos nitrofenoxicarbonila e/ou grupos ftalaldeído e similar.

[0035] Como aqui usado, o termo "cromatografia" se refere a um processo em que uma mistura química realizada por um líquido ou gás é separada em componentes como um resultado de distribuição diferencial das entidades químicas conforme elas fluem ao redor e sobre uma fase líquida ou sólida estacionária.

[0036] Como aqui usado, o termo "cromatografia líquida" ou "LC" significa um processo de retardo seletivo de um ou mais componentes de uma solução fluida conforme o fluido passa uniformemente através de uma coluna de uma substância finamente dividida ou através de passagens capilares. O retardo resulta da distribuição dos componentes da mistura entre uma ou mais fases estacionárias e o fluido bruto (isto é, fase móvel), conforme o fluido se move em relação à(s) fase(s) estacionária(s). Exemplos de "cromatografia líquida" incluem cromatografia líquida de fase reversa (RPLC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e cromatografia líquida de alta turbulência (HTLC).

[0037] Como aqui usado, o termo "cromatografia líquida de alto desempenho" ou "HPLC" se refere à cromatografia líquida em que o grau de separação é aumentado ao forçar a fase móvel sob pressão através de uma fase estacionária, tipicamente uma coluna densamente empacotada.

[0038] Como aqui usado, o termo "cromatografia líquida de alta turbulência" ou "HTLC" se refere a uma forma de cromatografia que utiliza fluxo turbulento do material sendo ensaiado através do empacotamento da coluna como a base para realização da separação. HTLC tem sido aplicada na preparação de amostras contendo dois fármacos sem nome antes da análise através de espectrometria de massa. Vide, por exemplo, Zimmer e outros, J. Chromatogr. A 854: 23- 35 (1999); vide também, Patentes U.S. No. 5.968.367, 5.919.368,

5.795.469 e 5.772.874, que explicam mais HTLC. Pessoas de habilidade comum na técnica compreendem "fluxo turbulento". Quando o fluido flui lentamente e suavemente, o fluxo é chamado "fluxo laminar". Por exemplo, fluido que se move através de uma coluna de HPLC em taxas de fluxo baixas é laminar. Em fluxo laminar o movimento das partículas de fluido é ordenadamente com partículas se movendo geralmente em linhas retas. Em velocidades mais rápidas, a inércia da água supera as forças friccionais do fluido e fluxo turbulento resulta. Fluido não em contato com o limite irregular "ultrapassa" aquele que é deixado mais lento pela fricção ou defletido por uma superfície desigual.

Quando um fluido está fluindo turbulentamente, ele flui em turbilhões e redemoinhos (ou vórtices), com mais "arrasto" do que quando o fluxo é laminar. Muitas referências estão disponíveis para auxiliar na determinação de quando fluxo de fluido é laminar ou turbulento (por exemplo, Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction, P.S. Bernard & J.M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc., (2000); An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu & Julian Scott, Cambridge University Press (2001)).

[0039] Como aqui usado, o termo "cromatografia de gás" ou "GC" se refere à cromatografia em que a mistura de amostra é vaporizada e injetada em uma corrente de gás carreador (como nitrogênio ou hélio) se movendo através de uma coluna contendo uma fase estacionária composta de um líquido ou um sólido em partículas e é separada em seus compostos componentes de acordo com a afinidade dos compostos com a fase estacionária.

[0040] Como aqui usado, o termo "coluna de partícula grande" ou "coluna de extração" se refere a uma coluna de cromatografia contendo um diâmetro de partícula médio maior do que cerca de 35 μm. Como usado nesse contexto, o termo "cerca de" significa ±10%. Em uma modalidade preferida, a coluna contém partículas de cerca de 60 μm de diâmetro.

[0041] Como aqui usado, o termo "coluna analítica" se refere a uma coluna de cromatografia tendo placas cromatográficas suficientes para realizar uma separação de materiais em uma amostra que elui a partir da coluna suficiente para permitir uma determinação da presença ou quantidade de um analito. Tais colunas são frequentemente distinguidas de "colunas de extração", que têm o propósito geral de separação ou extração de material retido a partir de materiais não retidos a fim de obter uma amostra purificada para análise adicional. Como usado no presente contexto, o termo "cerca de" significa ±10%. Em uma modalidade preferida, a coluna analítica contém partículas de cerca de 4 μm de diâmetro.

[0042] Como aqui usado, o termo "on-line" ou "inline", por exemplo, como usado em maneira automática "on-line" ou "extração on-line", se refere a um procedimento realizado sem a necessidade de intervenção do operador. Em contraste, o termo "off-line" como aqui usado se refere a um procedimento requerendo intervenção manual de um operador. Portanto, se amostras forem submetidas à precipitação, e os sobrenadantes forem então manualmente carregados em um autoamostrador, as etapas de precipitação e carregamento são off-line das etapas subsequentes. Em várias modalidades dos métodos, uma ou mais etapas podem ser realizadas de uma maneira automática on- line.

[0043] Como aqui usado, o termo "espectrometria de massa" ou "MS" se refere a uma técnica analítica para identificar compostos através de sua massa. MS se refere a métodos de filtragem, detecção e medição de íons com base em sua razão massa-para-carga ou "m/z". Tecnologia MS geralmente inclui (1) ionizar os compostos para formar compostos carregados; e (2) detectar o peso molecular dos compostos carregados e calcular a razão massa-para-carga. Os compostos podem ser ionizados e detectados através de qualquer meio adequado. Um "espectrômetro de massa" geralmente inclui um ionizador e um detector de íons. Em geral, uma ou mais moléculas de interesse são ionizadas, e os íons são subsequentemente introduzidos em um instrumento espectrográfico de massa onde, devido a uma combinação de campos magnético e elétrico, os íons seguem um caminho no espaço que é dependente da massa ("m") e carga ("z"). Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.204.500, intitulada "Mass Spectrometry From Surfaces;"

6.107.623, intitulada "Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry;" 6.268.144, intitulada "DNA Diagnostics Based On Mass

Spectrometry;" 6,124,137, intitulada "Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes;" Wright e outros, Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76 (1999); e Merchant e Weinberger, Electrophoresis 21:1164-67 (2000).

[0044] Como aqui usado, o termo "operando em modo de íon negativo" se refere àqueles métodos de espectrometria de massa onde íons negativos são gerados e detectados. O termo "operando em modo de íon positivo", como aqui usado, se refere àqueles métodos de espectrometria de massa onde íons positivos são gerados e detectados.

[0045] Como aqui usado, o termo "ionização" ou "ionizante" se refere ao processo de geração de um íon de analito tendo uma carga elétrica líquida igual a uma ou mais unidades de elétron. Íons negativos são aqueles tendo uma carga negativa de uma ou mais unidades de elétron, enquanto íons positivos são aqueles tendo uma carga positiva líquida de uma ou mais unidades de elétron.

[0046] Como aqui usado, o termo "ionização de elétrons" ou "EI" se refere a métodos em que um analito de interesse em uma fase gasosa ou de vapor interage com um fluxo de elétrons. Impacto dos elétrons com o analito produz íons de analito, que podem então ser submetidos a uma técnica de espectrometria de massa.

[0047] Como aqui usado, o termo "ionização química" ou "CI" se refere a métodos em que um gás reagente (por exemplo, amônia) é submetido a impacto de elétron, e íons de analito são formados através da interação de íons de gás reagente e moléculas de analito.

[0048] Como usado aqui, o termo "bombardeamento atômico rápido" ou "FAB" se refere a métodos em que um feixe de átomos de alta energia (frequentemente Xe ou Ar) impacta uma amostra não volátil, dessorvendo e ionizando moléculas contidas na amostra. As amostras de teste são dissolvidas em uma matriz líquida viscosa tais como glicerol, tioglicerol, álcool de m-nitrobenzila, éter 18-coroa-6-coroa, éter de 2-nitrofeniloctila, sulfolano, dietanolamina e trietanolamina. A escolha de uma matriz apropriada para um composto ou amostra é um processo empírico.

[0049] Como aqui usado, o termo "ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz" ou "MALDI" se refere a métodos em que uma amostra não volátil é exposta à irradiação de laser, que dessorve e ioniza analitos na amostra através de vários caminhos de ionização, incluindo fotoionização, protonação, desprotonação e declínio de agrupamento. Para MALDI, a amostra é misturada com uma matriz de absorção de energia, que facilita dessorção de moléculas de analito.

[0050] Como aqui usado, o termo "ionização por dessorção a laser aumentada na superfície" ou "SELDI" se refere a um outro método em que uma amostra não volátil é exposta à irradiação a laser, que dessorve e ioniza analitos na amostra através de vários caminhos de ionização, incluindo fotoionização, protonação, desprotonação e declínio de agrupamento. Para SELDI, a amostra é tipicamente ligada a uma superfície que preferivelmente retém um ou mais analitos de interesse. Como em MALDI, esse processo também pode empregar um material de absorção de energia para facilitar ionização.

[0051] Como aqui usado, o termo "ionização por eletropulverização" ou "ESI" se refere a métodos em que uma solução é passada ao longo de um comprimento curto de tubo capilar, à extremidade do qual é aplicado um potencial elétrico positivo ou negativo alto. A solução que atinge a extremidade do tubo é vaporizada (nebulizada) em um jato ou spray de gotículas muito pequenas de solução em vapor solvente. Essa névoa de gotículas flui através de uma câmara de evaporação, que é aquecida levemente para evitar condensação e evaporar solvente. Conforme as gotículas ficam menores, a densidade de carga da superfície elétrica aumenta até tal momento que a repulsão natural entre cargas iguais faz com que íons bem como moléculas neutras sejam liberados.

[0052] Como aqui usado, o termo "ionização química por pressão atmosférica" ou "APCI" se refere a métodos de espectroscopia de massa que são similares a ESI; no entanto, APCI produz íons através de reações de íon-molécula que ocorrem dentro de um plasma em pressão atmosférica. O plasma é mantido através de uma descarga elétrica entre o capilar de pulverização e um contraeletrodo. Os íons são tipicamente extraídos para o analisador de massa através do uso de um conjunto de estágios de remoção diferencialmente bombeados. Um contrafluxo de gás N2 seco e preaquecido pode ser usado para melhorar a remoção de solvente. A ionização de fase gasosa em APCI pode ser mais eficaz do que ESI para análise de espécies menos polares.

[0053] O termo "Fotoionização em Pressão Atmosférica" ou "APPI" como aqui usado se refere à forma de espectroscopia de massa onde o mecanismo para a fotoionização de molécula M é absorção de fótons e ejeção de elétrons para formar o íon molecular M+. Devido ao fato da energia de fóton tipicamente estar apenas um pouco acima do potencial de ionização, o íon molecular é menos suscetível à dissociação. Em muitos casos pode ser possível analisar amostras sem a necessidade de cromatografia, dessa maneira economizando tempo e gasto significantes. Na presença de vapor de água ou solventes próticos, o íon molecular pode extrair H para forma MH+. Isso tende a ocorrer se M tiver uma afinidade alta com prótons. Isso não afeta a exatidão de quantificação porque a soma de M+ e MH+ é constante. Compostos de fármaco em solventes próticos são geralmente observados como MH+, enquanto compostos não polares tal como naftaleno ou testosterona geralmente formam M+. Robb, D.B., Covey, T.R. and Bruins, A.P. (2000): vide, por exemplo, Robb e outros, Atmospheric pressure photoionization: An ionization method for liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 72(15): 3653-3659.

[0054] Como aqui usado, o termo "plasma indutivamente acoplado"

ou "ICP" se refere a métodos em que uma amostra interage com um gás parcialmente ionizado em uma temperatura suficientemente alta de modo que a maior parte dos elementos é atomizada e ionizada.

[0055] Como aqui usado, o termo "dessorção de campo" se refere a métodos em que uma amostra de teste não volátil é posta sobre uma superfície de ionização, e um campo elétrico intenso é usado para gerar íons de analito.

[0056] Como aqui usado, o termo "dessorção" se refere à remoção de um analito de uma superfície e/ou a entrada de um analito em uma fase gasosa.

[0057] Como aqui usado, o termo "limite de quantificação" ou "LOQ" se refere ao ponto onde medições se tornam quantitativamente significantes. A resposta do analito a esse LOQ é identificável, discreta e reproduzível com uma precisão de 20% e uma exatidão de 80% a 120%.

[0058] Como aqui usado, o termo "limite de detecção" ou "LOD" é o ponto no qual o valor medido é maior do que a incerteza associada com ele. O LOD é definido arbitrariamente como 2 desvios padrão (SD) da concentração zero.

[0059] Como aqui usado, uma "quantidade" de CgA em uma amostra de fluido corporal se refere geralmente a um valor absoluto refletindo a massa de CgA detectável em volume de fluido corporal. No entanto, uma quantidade também compreende uma quantidade relativa em comparação com uma outra quantidade de CgA. Por exemplo, uma quantidade de CgA em um fluido corporal pode ser uma quantidade que é maior do que ou menor do que um nível controle ou normal de CgA normalmente presente.

[0060] O termo "cerca de" como aqui usado em referência a medições quantitativas não incluindo a medição da massa de um íon, se refere ao valor indicado mais ou menos 10%. Instrumentos de espectrometria de massa podem variar ligeiramente na determinação da massa de um dado analito. O termo "cerca de" no contexto da massa de um íon ou da razão de massa/carga de um íon se refere a +/- 0,5 de unidade de massa atômica.

[0061] O sumário da invenção descrito acima é não limitante e outros elementos e vantagens da invenção serão aparentes a partir da descrição detalhada que segue da invenção, e partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0062] A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho analítico para o ensaio de LC-MS/MS de CgA. CgA negativamente carregada se liga através de interações eletrostáticas, lipofílicas e hidrofílicas com a resina de troca aniônica de modo misto sob condições onde ela é retida enquanto outras proteínas retiradas. Após eluição, a CgA isolada é digerida com tripsina e um peptídeo representativo é quantificado através de análise LC-MS/MS.

[0063] A Figura 2 mostra três curvas de calibragem pesquisadas em três dias separados. Faixa linear foi demonstrada ser 50 a 50.000 ng/mL. CV foi menos do que 10%.

[0064] A Figura 3 mostra cromatogramas correspondendo a espécies de paciente com valores de CgA normais (parte superior) e altos (parte inferior).

[0065] A Figura 4 mostra valores médios de imunoensaio ELISA comparado com os valores obtidos através de LC-MS/MS.

[0066] A Figura 5 mostra uma comparação entre imunoensaio CisBio e ensaio de CgA LC-MS/MS (ajuste de curva Passing & Bablok, 308 amostras).

[0067] A Figura 6 mostra gráficos de área de pico para níveis de CgA normais e anormais determinados através de LC-MS/MS.

[0068] A Figura 7 mostra um cromatograma exemplar para padrão interno de cromogranina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0069] Os níveis de CgA estão aumentados na presença de tumores de derivação neuroendócrina (NET), tornando a CgA um marcador de soro útil para monitoramento de pacientes com NETs. Níveis de circulação de CgA no soro são proporcionais à carga de tumor, provendo informação de prognóstico em resposta a tratamento. Aqui, é descrito um ensaio de LC-MS/MS novo, totalmente automatizado, livre de anticorpo, para quantificar cromogranina A de soro. Na exploração das propriedades ácidas de CgA, 100 uL de soro são extraídos usando uma placa de extração de fase sólida de troca aniônica seguido pela adição de padrão interno. A amostra extraída é então concentrada e enzimaticamente digerida usando tripsina. Um peptídeo único para CgA é então separado cromatograficamente e analisado através de SRM em um Sciex 6500+ QTrap. A razão da área de pico do analito para a área de pico padrão interna isotopicamente marcada é usada para obter a quantificação. CgA mostra linearidade através de uma faixa ampla (50-50000 ng/mL, R2≥0,99), bem como reprodutibilidade inter- e intraensaio (CV ≤15%). Um coorte de 300 amostras de paciente foi analisado para comparar valores no soro de CgA medidos através do imunoensaio Cisbio CGA-ELISA-US para o ensaio de LC-MS/MS descritos. Quando comparando medições de imunoensaio e LC-MS/MS para CgA nesse coorte, um R2 de 0,71 foi observado, mostrando uma boa correlação entre as duas plataformas de ensaio.

[0070] Em certas modalidades, os métodos providos aqui são para detecção ou determinação da quantidade de cromogranina A (CgA) compreendendo (a) purificar CgA na amostra; (b) ionizar CgA para produzir íons detectáveis através de espectrometria de massa; e (c) detectar ou determinar a quantidade do(s) íon(s) de CgA através de espectrometria de massa; em que a quantidade do(s) íon(s) de CgA está relacionada com a quantidade de CgA na amostra.

[0071] Em certas modalidades, os métodos providos aqui são para detecção ou determinação da quantidade de cromogranina A (CgA) compreendendo (a) submeter a amostra à extração em fase sólida; (b) digerir enzimaticamente a CgA; (c) submeter a CgA à cromatografia líquida; (d) ionizar CgA para produzir íons detectáveis através de espectrometria de massa; e (e) detectar ou determinar a quantidade do(s) íon(s) de CgA através de espectrometria de massa; em que a quantidade de íon(s) de CgA está relacionada com a quantidade de CgA na amostra.

[0072] Em certas modalidades, os métodos providos aqui compreendem espectrometria de massa com monitoramento de reação selecionada (SRM).

[0073] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui são totalmente automatizados.

[0074] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui são métodos livres de anticorpo.

[0075] Em algumas modalidades, purificação provida aqui compreende extração de soro usando extração em fase sólida (SPE). Em algumas modalidades, SPE é uma extração em fase sólida de troca aniônica. Em algumas modalidades, SPE é uma extração em fase sólida de troca aniônica de modo misto. Em algumas modalidades, as amostras extraídas são concentradas.

[0076] Em algumas modalidades, purificação provida aqui compreende cromatografia líquida. Em algumas modalidades, a cromatografia líquida compreende cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Em algumas modalidades, a cromatografia líquida compreende cromatografia líquida de alta turbulência (HTLC).

[0077] Em algumas modalidades, as amostras extraídas são enzimaticamente digeridas. Em algumas modalidades, as amostras extraídas são enzimaticamente digeridas por tripsina.

[0078] Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização por eletropulverização (ESI). Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo positivo. Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo negativo.

[0079] Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização química em pressão atmosférica (APCI). Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo positivo. Em algumas modalidades, a ionização compreende ionização em modo negativo.

[0080] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon precursor tendo uma razão de massa-para-carga de 593,2 ± 0,5.

[0081] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon precursor tendo uma razão de massa-para-carga de 729,6 ± 0,5.

[0082] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de um fragmento de cromogranina A. Em algumas modalidades, o fragmento de CgA medido compreende uma sequência ELQDLALQGA (SEQ ID Nº:1). Em algumas modalidades, o fragmento de CgA medido compreende uma sequência RRPEDQELESLSAIEAELEK (SEQ ID Nº:4).

[0083] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íons fragmentos tendo uma razão de massa-para-carga de 516,3 ± 0.5 ou 815,5 ± 0,5 ou ambas.

[0084] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon fragmento tendo uma razão de massa-para-carga de 831,5 ± 0,5 ou 989,5 ± 0,5 ou ambas.

[0085] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem ainda adicionar um padrão interno. Em algumas modalidades, o padrão interno é isotopicamente marcado. Em algumas modalidades, o padrão interno compreende aminoácidos marcados com C13N15. Em algumas modalidades, o padrão interno é marcado em uma leucina (L) ou lisina (K). Em algumas modalidades, o padrão interno compreende uma sequência ILSILRHQNLLKELQDLAL*QGAK*ERAHQQK (SEQ ID Nº:2), em que * é um aminoácido marcado com C13N15. Em algumas modalidades, o padrão interno compreende uma sequência RRPEDQELESL*SAIEAELEK* (SEQ ID Nº:5), em que * é um aminoácido marcado com C13N15.

[0086] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íon precursor de padrão interno tendo uma razão de massa-para-carga de 600,8 ± 0,5 e/ou íon de produto tendo uma razão de massa-para-carga de 602,4 ± 0,5, 830,6± 0,5 ou 958,7 ± 0,5.

[0087] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem medição da quantidade de íons precursor de padrão interno tendo uma razão de massa-para-carga de 600,8 ± 0,5 e/ou íon de produto tendo uma razão de massa-para-carga de 734,6 ± 0,5, 839,5 ± 0,5 ou 997,6 ± 0,5.

[0088] Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 100 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 90 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 80 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 70 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 60 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 50 ng/mL.

[0089] Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menos do que ou igual a 50 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menos do que ou igual a 40 ng/mL. Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menos do que ou igual a 35,5 ng/mL.

[0090] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem linearidade de quantificação em uma faixa entre 50 ng/mL a 50.000 ng/mL.

[0091] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui compreendem reprodutibilidade inter- e intraensaio de CV ≤15%.

[0092] Em algumas modalidades, CgA não é derivatizada antes da espectrometria de massa.

[0093] Em certas modalidades, a amostra é um fluido corporal. Em algumas modalidades, a amostra é fluido cerebrospinal (CSF). Em algumas modalidades, a amostra é plasma ou soro. Em algumas modalidades, a amostra é sangue integral. Em algumas modalidades, a amostra é saliva ou urina.

[0094] Em algumas modalidades, os métodos podem incluir adição de um agente à amostra em uma quantidade suficiente para desproteinar a amostra.

[0095] Em algumas modalidades, níveis elevados de cromogranina A comparado com uma faixa de referência indicam risco aumentado de tumores neuroendócrinos (NET). Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam o tamanho do tumor neuroendócrino. Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam a carga de tumor do tumor neuroendócrino. Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam a resposta a tratamento do tumor neuroendócrino. Em algumas modalidades, níveis quantificados de cromogranina A indicam o prognóstico de tumor neuroendócrino.

[0096] Amostras de teste adequadas incluem qualquer amostra de teste que pode conter o analito de interesse. Em algumas modalidades preferidas, uma amostra é uma amostra biológica; isto é, uma amostra obtida a partir de qualquer fonte biológica, tal como um animal, uma cultura celular, uma cultura de órgão, etc. Em certas modalidades preferidas, as amostras são obtidas a partir de um animal mamífero, tal como um cachorro, gato, cavalo, etc. Animais mamíferos particularmente preferidos são primatas, sobretudo preferivelmente humanos masculinos ou femininos. Amostras particularmente preferidas incluem sangue, plasma, soro, cabelo, músculo, urina, saliva, lágrima, fluido cerebrospinal ou outra amostra de tecido. Outras amostras podem ser obtidas, por exemplo, de um paciente; isto é, uma pessoa viva, masculino ou feminino, se apresentando em um ambiente clínico para diagnóstico, prognóstico ou tratamento de uma doença ou condição. A amostra de teste é preferivelmente obtida de um paciente, por exemplo, soro sanguíneo. Preparação de Amostra para Espectrometria de Massa

[0097] Os métodos que podem ser usados para enriquecer em CgA em relação a outros componentes na amostra (por exemplo, proteína) incluem, por exemplo, filtragem, centrifugação, cromatografia de camada fina (TLC), eletroforese incluindo eletroforese capilar, separações por afinidade incluindo separações por imunoafinidade, métodos de extração, incluindo extração com acetato de etila e extração com metanol, e o uso de agentes caotrópicos ou qualquer combinação dos acima ou similar.

[0098] Precipitação de proteína é um método preferido de preparação de uma amostra de teste. Tais métodos de purificação de proteína são bem conhecidos na técnica, por exemplo, Polson e outros, Journal of Chromatography B 785:263-275 (2003), descreve técnicas de precipitação de proteína adequadas para uso nos métodos.

Precipitação de proteína pode ser usada para remover a maior parte da proteína da amostra deixando CgA no sobrenadante. As amostras podem ser centrifugadas para separar o sobrenadante líquido das proteínas precipitadas. O sobrenadante resultante pode então ser aplicado à cromatografia líquida e subsequente análise por espectrometria de massa. Em certas modalidades, o uso de precipitação de proteína tal como, por exemplo, precipitação de proteína acetonitrila, obvia a necessidade de cromatografia líquida de alta turbulência (HTLC) ou outra extração on-line antes da HPLC ou espectrometria de massa. De acordo com tais modalidades, o método envolve (1) realização de uma precipitação de proteína da amostra de interesse; e (2) carregamento do sobrenadante diretamente no espectrômetro de HPLC-massa sem usar extração on-line ou cromatografia líquida de alta turbulência (HTLC).

[0099] Em algumas modalidades preferidas, HPLC, sozinha ou em combinação com um ou mais métodos de purificação, pode ser usada para purificar CgA antes da espectrometria de massa. Em tais modalidades, as amostras podem ser extraídas usando um cartucho de extração de HPLC que captura o analito, então eluídas e cromatografadas em uma segunda coluna de HPLC ou em uma coluna de HPLC analítica antes da ionização. Devido ao fato das etapas envolvidas nesses procedimentos de cromatografia poderem ser ligadas de uma maneira automática, a exigência de envolvimento do operador durante a purificação do analito pode ser minimizada. Esse elemento pode resultar em economias de tempo e custos e elimina a oportunidade para erro do operador.

[0100] Acredita-se que fluxo turbulento, tal como aquele provido por colunas e métodos de HTLC, possa aumentar a taxa de transferência de massa, melhorando as características de separação. As colunas de HTLC separam componentes por meio de taxas de fluxo cromatográfico altas através de uma coluna revestida contendo partículas rígidas. Ao empregar taxas de fluxo altas (por exemplo, 3-5 mL/min), fluxo turbulento ocorre na coluna, o que causa interação quase completa entre a fase estacionária e o(s) analito(s) de interesse. Uma vantagem do uso de colunas de HTLC é que a formação macromolar associada com matrizes de fluido biológico é evitada uma vez que as espécies de peso molecular alto não são retidas sob as condições de fluxo turbulento. Métodos de HTLC que combinam separações múltiplas em um procedimento diminuem a necessidade de preparação de amostra longa e operam em velocidade significantemente maior. Tais métodos também obtêm um desempenho de separação superior à cromatografia de fluxo laminar (HPLC). HTLC permite injeção direta de amostras biológicas (plasma, urina, etc.). Injeção direta é difícil obter em formas tradicionais de cromatografia porque proteínas desnaturadas e outros restos biológicos rapidamente bloqueiam as colunas de separação. HTLC também permite volume de amostra muito baixo de menos do que 1 mL, preferivelmente menos do que 0,5 mL, preferivelmente menos do que 0,2 mL, preferivelmente 0,1 mL.

[0101] Exemplos de HTLC aplicada à preparação de amostra antes da análise através de espectrometria de massa foram descritos em outro local. Vide, por exemplo, Zimmer e outros, J. Chromatogr. A 854:23-35 (1999); vide também, Patentes U.S. Nºs. 5.968.367;

5.919.368; 5.795.469; e 5.772.874. Em certas modalidades do método, as amostras são submetidas à precipitação de proteína como acima descrito antes do carregamento na coluna de HTLC; em modalidades preferidas alternativas, as amostras podem ser carregadas diretamente na HTLC sem ser submetidas à precipitação de proteína. A coluna de extração de HTLC é preferivelmente uma coluna de partícula grande. Em várias modalidades, uma de mais etapas dos métodos pode ser realizada de uma maneira automática, on-line. Por exemplo, em uma modalidade, as etapas (i)-(v) são realizadas de uma maneira automática, on-line. Em uma outra etapa, as etapas de ionização e detecção são realizadas on-line seguindo as etapas (i)-(v).

[0102] Cromatografia líquida (LC) incluindo cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) se baseia em tecnologia de fluxo laminar, relativamente baixo. Análise de HPLC tradicional se baseia em empacotamentos de coluna em que fluxo laminar da amostra através da coluna é a base para separação do analito de interesse da amostra. O versado na técnica compreenderá que separação em tais colunas é um processo difusional. HPLC foi aplicada com sucesso à separação de compostos em amostras biológicas, mas uma quantidade significante de preparação de amostra é requerida antes da separação e análise subsequente com um espectrômetro de massa (MS), tornando essa técnica de trabalho intensivo. Ainda, a maioria dos sistemas de HPLC não utiliza o espectrômetro de massa até seu potencial integral, permitindo apenas que um sistema de HPLC seja conectado a um instrumento de MS único, resultando em exigências de tempo longo para realização de um número grande de ensaios.

[0103] Foram descritos vários métodos para uso de HPLC para limpeza de amostra antes da análise de espectrometria de massa. Vide, por exemplo, Taylor e outros, Therapeutic Drug Monitoring 22:608-12 (2000); e Salm e outros, Clin. Therapeutics 22 Supl. B:B71-B85 (2000).

[0104] Um versado na técnica pode selecionar instrumentos e colunas de HPLC que são adequados para uso com CgA. A coluna cromatográfica inclui tipicamente um meio (isto é, um material de empacotamento) para facilitar a separação de porções químicas (isto é, fracionamento). O meio pode incluir partículas minúsculas. As partículas incluem uma superfície ligada que interage com as várias porções químicas para facilitar a separação das porções químicas. Uma superfície ligada adequada é uma superfície ligada hidrofóbica tal como uma superfície ligada de alquila. Superfícies ligadas de alquila podem incluir grupos alquila ligados C-4, C-8, C-12 ou C-18, preferivelmente grupos ligados C-18. A coluna cromatográfica inclui uma porta de entrada para recebimento de uma amostra e uma porta de saída para descarregamento de um efluente que inclui a amostra fracionada. Em uma modalidade, a amostra (ou amostra prepurificada) é aplicada à coluna na porta de entrada, eluída com um solvente ou mistura de solvente e descarregada na porta de saída. Modos de solvente diferentes podem ser selecionados para eluição do(s) analito(s) de interesse. Por exemplo, cromatografia líquida pode ser realizada usando um modo de gradiente, um modo isocrático ou um modo politíptico (isto é, misturado). Durante cromatografia, a separação de materiais é realizada por variáveis tais como escolha de eluente (também conhecida como "fase móvel"), modo de eluição, condições de gradiente, temperatura, etc.

[0105] Em certas modalidades, um analito pode ser purificado através da aplicação de uma amostra a uma coluna sob condições onde o analito de interesse é reversivelmente retido pelo material de empacotamento da coluna, enquanto um ou mais outros materiais não são retidos. Nessas modalidades, uma primeira condição de fase móvel pode ser empregada, onde o analito de interesse é retido pela coluna, e a segunda condição de fase móvel pode ser subsequentemente empregada para remover material retido da coluna, uma vez que os materiais não retidos são lavados. Alternativamente, um analito pode ser purificado através da aplicação de uma amostra a uma coluna sob condições de fase móvel onde o analito de interesse elui em uma taxa diferencial em comparação com um ou mais outros materiais. Tais procedimentos podem enriquecer a quantidade de um ou mais analitos de interesse em relação a um ou mais componentes da amostra.

[0106] Em uma modalidade preferida, a HTLC pode ser seguida por

HPLC em um sistema cromatográfico de coluna hidrofóbica. Em certas modalidades preferidas, uma coluna à base de polímero TurboFlow Cyclone P® Cohesive Technologies (tamanho de partícula de 60 μm, dimensões da coluna 50 x 1,0 mm, tamanho do poro de 100Å) é usada. Em modalidades preferidas relacionadas, uma fenila ligada a éter Synergi Polar-RP®, coluna analítica da Phenomenex Inc. (tamanho de partícula de 4 μm, dimensões da coluna 150 x 2,0 mm, tamanho de poro de 80Å) com capeamento de extremidade hidrofílico é usada. Em certas modalidades preferidas, HTLC e HPLC são realizadas usando HPLC Grade Ultra Pure Water e metanol 100% como fases móveis.

[0107] Através da seleção cuidadosa de válvulas e encanamento conector, duas ou mais colunas de cromatografia podem ser conectadas conforme necessário de modo que material seja passado a partir de uma para a outra sem a necessidade de quaisquer etapas manuais. Em modalidades preferidas, a seleção de válvulas e encanamento é controlada por um computador preprogamado para realizar as etapas necessárias. Sobretudo preferivelmente, o sistema de cromatografia é também conectado de tal maneira on-line ao sistema detector, por exemplo, um sistema MS. Portanto, um operador pode pôr uma bandeja de amostras em um autoamostrador, e as operações restantes são realizadas sob controle de computador, resultando em purificação de análise de todas as amostras selecionadas.

[0108] Em certas modalidades preferidas, CgA ou fragmentos da mesma em uma amostra podem ser purificados antes da ionização. Em modalidades particularmente preferidas, a cromatografia não é cromatografia de gás. Detecção e Quantificação através de Espectrometria de Massa

[0109] Em várias modalidades, CgA ou fragmentos da mesma podem ser ionizados através de qualquer método conhecido na técnica. Espectrometria de massa é realizada usando um espectrômetro de massa, o qual inclui uma fonte de íons para ionização da amostra fracionada e criando moléculas de carga para análise adicional. Por exemplo, ionização da amostra pode ser realizada através de ionização de elétron, ionização química, ionização por eletropulverização (ESI), ionização de fótons, ionização química por pressão atmosférica (APCI), fotoionização, fotoionização por pressão atmosférica (APPI), bombardeamento atômico rápido (FAB), ionização secundária líquida (LSI), ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI), ionização de campo, dessorção de campo, ionização por termopulverização/pulverização de plasma, ionização por dessorção a laser aumentada na superfície (SELDI), plasma indutivamente acoplado (ICP) e ionização por feixe de partículas. O versado compreenderá que a escolha de método de ionização pode ser determinada com base no analito a ser medido, tipo de amostra, o tipo de detector, a escolha de modo positivo versus negativo, etc.

[0110] Em modalidades preferidas, CgA ou um fragmento da mesma é ionizado através de ionização por eletropulverização (ESI) em modo positivo ou negativo.

[0111] Após a amostra ter sido ionizada, os íons carregados positivamente ou carregados negativamente dessa maneira criados podem ser analisados para determinar uma razão de massa-para- carga. Analisadores adequados para determinação das razões de massa-para-carga incluem analisadores de quadrupolo, analisadores de aprisionamento de íons e analisadores de tempo-de-voo. Os íons podem ser detectados usando vários modos de detecção. Por exemplo, íons selecionados podem ser detectados, isto é, usando um modo de monitoramento de íon seletivo (SIM), ou alternativamente, os íons podem ser detectados usando um modo de varredura, por exemplo, monitoramento de reação múltipla (MRM) ou monitoramento de reação selecionada (SRM). Preferivelmente, a razão de massa-para-carga é determinada usando um analisador de quadrupolo. Por exemplo, em um instrumento de "quadrupolo’ ou "de aprisionamento de íons de quadrupolo", íons em um campo de radiofrequência oscilante sofrem uma força proporcional ao potencial de CD aplicado entre os eletrodos, a amplitude do sinal de RF e a razão de massa/carga. A voltagem e a amplitude podem ser selecionadas de modo que apenas íons tendo uma razão de massa/carga particular viajem o comprimento do quadrupolo, enquanto todos os outros íons são desviados. Portanto, instrumentos de quadrupolo podem agir como ambos um "filtro de massa" e como um "detector de massa" para os íons injetados no instrumento.

[0112] A resolução da técnica de MS pode ser aumentada empregando "espectrometria de massa em tandem" ou "MS/MS". Nessa técnica, um íon precursor (também chamado um íon parental) gerado a partir de uma molécula de interesse pode ser filtrado em um instrumento de MS, e o íon precursor é subsequentemente fragmentado para prover um ou mais íons de fragmento (também chamados íons filhas ou íons de produto) que são então analisados em um segundo procedimento de MS. Através da seleção cuidadosa de íons precursores, apenas íons produzidos através de certos analitos são passados para a câmara de fragmentação, onde colisões com átomos de um gás inerte produzem os íons de fragmento. Devido ao fato de ambos íons precursores e de fragmento serem produzidos de uma maneira reproduzível sob um dado conjunto de condições de ionização/fragmentação, a técnica de MS/MS pode prover uma ferramenta analítica extremamente poderosa. Por exemplo, a combinação de filtragem/fragmentação pode ser usada para eliminar substâncias de interferência, e pode ser particularmente útil em amostras complexas, tais como amostras biológicas.

[0113] O espectrômetro de massa tipicamente provê o usuário com uma varredura de íons; isto é, a abundância relativa de cada íon com uma massa/carga particular em uma dada faixa (por exemplo, 100 a

1000 amu). Os resultados de um ensaio de analito, isto é, um espectro de massa, podem ser relacionados à quantidade do analito na amostra original através de vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, dado que parâmetros de amostragem e análise são cuidadosamente controlados, a abundância relativa de um dado íon pode ser comparada com uma tabela que converte a abundância relativa em uma quantidade absoluta da molécula original. Alternativamente, padrões moleculares podem ser executados com as amostras, e uma curva padrão construída com base em íons gerados a partir desses padrões. Usando tal curva padrão, a abundância relativa de um dado íon pode ser convertida em uma quantidade absoluta da molécula original. Em certas modalidades preferidas, um padrão interno é usado para gerar uma curva padrão para cálculo da quantidade de CgA. Métodos de geração e uso de tais curvas padrão são bem conhecidos na técnica e um versado de habilidade comum é capaz de selecionar um padrão interno apropriado. Por exemplo, um isótopo de CgA pode ser usado como um padrão interno. Vários outros métodos para relacionar a quantidade de um íon com a quantidade da molécula original serão bem conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica.

[0114] Uma ou mais etapas dos métodos podem ser realizadas usando máquinas automatizadas. Em certas modalidades, uma ou mais etapas de purificação são realizadas on-line, e mais preferivelmente todas das etapas de purificação e espectrometria de massa podem ser realizadas de um amaneira on-line.

[0115] Em certas modalidades, tal como MS/MS, onde íons precursores são isolados para fragmentação adicional, dissociação de ativação por colisão é frequentemente usada para gerar os íons fragmentos para detecção adicional. Em CAD, íons precursores ganham energia através de colisões com um gás inerte, e subsequentemente fragmento através de um processo referido como

"decomposição unimolecular". Energia suficiente deve ser depositada nos íons precursores de modo que certas ligações dentro do íon podem ser quebradas devido à energia vibracional aumentada.

[0116] Em modalidades particularmente preferidas, CgA é detectada e/ou quantificada usando MS/MS como segue. As amostras são submetidas à cromatografia líquida, preferivelmente HPLC, o fluxo de solvente líquido a partir da coluna cromatográfica entra na interface do nebulizador aquecido de um analisador MS/MS e a mistura de solvente/analito é convertida em vapor na tubulação aquecida da interface. O analito é ionizado pelo ionizador selecionado. Os íons, por exemplo, íons precursores, passam através do orifício do instrumento e entram no primeiro quadrupolo. Os quadrupolos 1 e 3 (Q1 e Q3) são filtros de massa, permitindo seleção de íons (isto é, íons "precursores" e "fragmentos") com base em sua razão de massa para carga (m/z). O quadrupolo 2 (Q2) é a célula de colisão, onde íons são fragmentados. O primeiro quadrupolo do espectrômetro de massa (Q1) seleciona moléculas com as razões de massa para carga de CgA. Íons precursores com as razões de massa/carga corretas de CgA são permitidos passar para a câmara de colisão (Q2), enquanto íons indesejados com qualquer outra razão de massa/carga colidem com os lados do quadrupolo e são eliminados. Íons precursores que entram em Q2 colidem com as moléculas de gás argônio neutras e fragmento. Esse processo é chamado dissociação ativada por colisão (CAD). Os íons fragmentos gerados são passados para o quadrupolo 3 (Q3), onde os íons fragmentos de CgA são selecionados enquanto outros íons são eliminados.

[0117] Os métodos podem envolver MS/MS realizada em modo de íon positivo ou negativo. Usando métodos padrão bem conhecidos na técnica, um versado de habilidade comum é capaz de identificar um ou mais íons fragmentos de um íon precursor particular de CgA que pode ser usado para seleção em quadrupolo 3 (Q3).

[0118] Conforme íons colidem com o detector, eles produzem um pulso de elétrons que são convertidos em um sinal digital. Os dados adquiridos são retransmitidos para um computador, que representa em gráfico contagens dos íons coletados versus tempo. Os cromatogramas de massa resultantes são similares a cromatogramas gerados em métodos de HPLC tradicionais. As áreas sob os picos correspondendo a íons particulares, ou a amplitude de tais picos, são medidas e a área ou amplitude é correlacionada à quantidade do analito de interesse. Em certas modalidades, a área sob as curvas, ou amplitude dos picos, para íon(s) fragmento(s) e/ou íons precursores são medidas para determinar a quantidade de CgA. Como acima descrito, a abundância relativa de um dado íon pode ser convertida em uma quantidade absoluta do analito original, usando curvas padrão de calibragem com base em picos de um ou mais íons de um padrão molecular interno.

[0119] Os exemplos que seguem servem para ilustrar a invenção. Esses exemplos não pretendem de modo algum limitar o escopo dos métodos.

EXEMPLOS Exemplo 1: quantificação de CgA através de espectrometria de massa Sumário de reagente: Fornecedor & Reagentes Quantidade Número do Catálogo Cromogranina-A Abcam, ab85486 250 ug Cromogranina-A IS (Vide Prep New England Peptide, Padrão Interno de CgA abaixo Custom Synthesis 6 mg para a sequência) ≥95% de pureza Soro com Carvão Extraído e Biocell, 1101-00 1L Deslipidado Biocell

Sigma, A Millipore, Bicarbonato de Amônio (AmBic) 500 g FX0440-56141-500G Bicarbonato de Trietilamônio, Sigma, T7408-500mL 500 mL 1,0M Ditiotreitol Sigma, 43819-25G 25g Iodoacetamida Sigma, I1149-25G 25g Tripsina Sigma, T1426-500MG 0,5 g Ácido Fórmico, 98% Millipore, FX0440-5 0,5 L Sigma, 221228- Hidróxido de Amônio, 28-30% 500 mL 500ML-A Burdick & Jackson, Água HPLC 4L 365-4 Burdick & Jackson, Acetonitrila 4L 015-4 Fisher Scientific, Metanol 4L A454-4 Albumina de Soro Bovino Sigma, A2153-500G 500 g Película Adesiva Transparente Thermo Fisher, 100 filmes MicroAmp 4306311 Thermo Scientific Accucore C18 Themro, 17126- 1 coluna 100 x 2,1 mm, 2,6u 102130 Placa de SPE Oasis MAX 96 Waters, 186000373 1 placa poços 30mg

[0120] Espectrômetro de massa Sciex 6500+ QTrap, Thermo Fisher Aria Cohesive TLX4 com Bombas Agilent, Hamilton Microlab Star, SPEware IP8 foram usados para detectar CgA.

[0121] Soro do paciente (100 Μl) foi adicionado a 600 mL de bicarbonato de amônio 120 mM, e o volume total foi extraído usando uma placa de troca aniônica de modo misto. (Waters Oasis® MAX 30 mg). As amostras foram então lavadas duas vezes com hidróxido de amônio 3% e água, respectivamente. Em seguida, CgA foi eluída, padrão interno (IS) é adicionado e a amostra foi evaporada sob nitrogênio aquecido.

[0122] Após secagem, as amostras foram reconstituídas, reduzidas, alquiladas e digeridas tripticamente por duas horas em um sistema de micro-ondas de digestão de enzima rápida (Hudson Technology).

[0123] Pós-digestão, as amostras foram acidificadas e analisadas através de LC-MS/MS em uma UPLC Aria TLX-4 Transcend. Os peptídeos foram separados usando uma coluna de HPLC Thermo Accucore C18 C100x2,1 mm, 2,6 mícrons usando gradientes de água/acetonitrila/ácido fórmico 0,1%. O detector de MS era um Sciex 6500+ Qtrap. Quantificação de CgA era baseada nos picos cromatográficos de íons fragmentos produzidos durante MS/MS correspondendo a um peptídeo tríptico representativo e seu IS marcado pesado correspondente. O fluxo de trabalho analítico é sumarizado na Figura 1.

[0124] Monitoramento de reação múltiplo foi usado para detecção de ambos o analito e do padrão interno (IS).

[0125] Concentrações de Cromogranina A (CgA) foram determinadas usando razão de área de pico e uma curva de calibragem.

[0126] Em ensaios detectando ELQDLALQGAK (SEQ ID Nº: 1), um padrão interno de peptídeo "winged" marcado foi usado: ILSILRHQNLLKELQDLAL*QGAK*ERAHQQK (SEQ ID Nº: 2): aminoácidos marcados com *C13N15. Após digestão, o peptídeo resultante era ELQDLAL*QGAK* (SEQ ID Nº: 3).

[0127] Em ensaios detectando RRPEDQELESLSAIEAELEK (SEQ ID Nº: 4), um padrão interno de peptídeo "winged" marcado foi usado:

EGSANRRPEDQELESL*SAIEAELEK*VAHQL (SEQ ID Nº: 5); aminoácidos marcados *C13N15. Após digestão, o peptídeo resultante era RRPEDQELESL*SAIEAELEK* (SEQ ID Nº: 6). Tabela 1: fragmento de CgA usado para quantificar níveis de CgA na amostra e íons precursores e de produto (razões m/z massa para carga) Analito Íon Precursor Íon de Produto (m/z) (m/z) CgA: ELQDLALQGAK 593,2 516,3, 815,5 CgA IS: ELQDLAL*QGAK* 600,8 602,4, 830,6, 958,7 Tabela 2: fragmento de CgA usado para quantificar níveis de CgA na amostra e íons precursores e de produto (razões m/z massa-para- carga) Analito Íon Precursor Íon de Produto (m/z) (m/z) CgA: 729,6 831,5, 989,5

RRPEDQELESLSAIEAELEK CgA: 734,6 839,5, 997,6 RRPEDQELESL*SAIEAELEK*

Tabela 3: os valores obtidos foram comparados com os valores quantificados através de imunoensaio ELISA. Vide também Figura 4. #ID da Resultado Resultado Resultado Média LCMS Amostra Mayo ARUP Dawn (Mayo, ARUP, Dawn) Faixas de <93 0-95 N/A N/A N/A Ref.

Unidades ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 1 1654 2286 3070 1753 1402 2 872 2172 1724 1192 2084 3 1286 1603 1680 1142 1774 4 793 1151 1220 791 730 5 499 1077 1285 715 827 6 588 639 657 471 4021 7 42 479 482 251 237 8 207 302 297 202 589 9 277 284 285 212 677 10 156 212 187 139 412 11 114 181 182 119 94 12 120 145 136 101 342 13 82 120 130 83 115 14 64 105 101 68 50 15 63 96 101 65 62 16 57 88 86 58 <50 17 62 80 80 56 <50 18 47 74 76 49 <50 19 41 60 60 40 <50 20 <20 36 45 40 <50

[0128] Amostras de 308 pacientes foram analisadas para comparar valores de CgA no soro medidos através do imunoensaio Cisbio CGA- ELISA-US (Codolet, França) com valores do ensaio de LC-MS/MS da requerente.

[0129] Após transformação logarítmica natural das medições, uma distribuição normal foi vista nos 308 pacientes. Um teste t em pares foi realizado nesses dados e a concordância entre os ensaios foi medida pelo coeficiente de correlação Pearson e ajuste de curva Passing & Bablok. Todas as análises foram realizadas em Analyse-it v2.30.

[0130] O ensaio foi validado. Características de desempenho são apresentadas na Tabela 4: Características Valores Precisão intraensaio 5,2-15,7% Precisão interensaio 7,4-10,1% Recuperação de CgA adicionada às 90-110% amostras dos pacientes Sensibilidade analítica 35,5 ng/mL (Limite de Quantificação) Sensibilidade Analítica 50 ng/mL (Limite de Quantificação) Linearidade 50-50.000 ng/mL Faixa de Referência <140 ng/mL (n=160)

[0131] Resultados típicos para amostras de paciente com concentrações baixas e altas de CgA em circulação são mostrados na Figura 3.

[0132] Os níveis de CgA medidos do LC-MS/MS eram em média comparáveis ao ensaio CisBio, embora houvesse dispersão substancial (correlação de Pearson 0,76) (Figura 5).

[0133] Conclusão: foi desenvolvido e validado pela requerente um ensaio doe LC-MS/MS totalmente automatizado para CgA do soro.

[0134] Os teores dos artigos, patentes e pedidos de patente, e todos os outros documentos e informação eletronicamente disponível mencionados ou citados aqui, são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade até o mesmo ponto como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada ser incorporada a título de referência. As Requerentes se reservam o direito de incorporar fisicamente ao presente pedido quaisquer e todos os materiais e informação de quaisquer tais artigos, patentes, pedidos de patente ou outros documentos físicos e eletrônicos.

[0135] Os métodos descritos aqui ilustrativamente podem ser praticados adequadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui revelados. Portanto, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc., devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Ainda, os termos e expressões empregados aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção no uso de tais termos e expressão excluir quaisquer equivalentes dos elementos mostrados e descritos ou suas partes. É reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Portanto, deve ser compreendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente revelada através de modalidades preferidas e elementos opcionais, modificação e variação da invenção aqui concretizadas na mesma aqui reveladas podem ser feitas por aqueles versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas estar dentro do escopo da invenção.

[0136] A invenção foi descrita de modo amplo e genérico aqui. Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéricos se encaixando na descrição genérica também faz parte dos métodos. Isso inclui a descrição genérica dos métodos com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer matéria-objeto do gênero, sem importar se ou não o material excisado é especificamente aqui mencionado.

[0137] Outras modalidades estão nas reivindicações que seguem. Ainda, onde elementos ou aspectos dos métodos são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção é também desta maneira descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para determinação da quantidade de cromogranina A (CgA) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) purificar CgA na amostra; (b) ionizar CgA para produzir um ou mais íons de CgA detectáveis através de espectrometria de massa; (c) determinar a quantidade do(s) íon(s) da etapa (b) através de espectrometria de massa, em que a quantidade de íons está relacionada à quantidade de CgA na amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita purificação compreende extração através de extração em fase sólida (SPE).

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a SPE é uma extração em fase sólida por troca iônica.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a SPE é uma extração em fase sólida por troca aniônica de modo misto.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as amostras extraídas são enzimaticamente digeridas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a digestão compreende digestão com tripsina.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita purificação compreende cromatografia líquida.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita cromatografia líquida compreende cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita cromatografia líquida compreende cromatografia líquida de alta turbulência (HTLC).

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita ionização compreende ionização por eletropulverização (ESI).

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar um padrão interno.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito padrão interno é isotopicamente marcado.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é soro.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é fluido cerebrospinal (CSF).

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende medir a quantidade de íon precursor tendo uma razão de massa-para-carga de 729,6 ± 0,5.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende medir a quantidade de um fragmento de CgA.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o fragmento de CgA medido compreende uma sequência RRPEDQELESLSAIEAELEK (SEQ ID Nº: 4).

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende medir a quantidade de íon de fragmento tendo uma razão de massa-para-carga de 831,5 ± 0,5 ou 989,5 ± 0,5.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar um padrão interno.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o padrão interno é isotopicamente marcado.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o padrão interno compreende um aminoácido marcado com C13N15.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o padrão interno é marcado em uma leucina (L) ou lisina (K).

23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o padrão interno compreende uma sequência EGSANRRPEDQELESL*SAIEAELEK*VAHQL (SEQ ID Nº: 5), em que L* e K* são, cada um, um aminoácido marcado com C13N15.

24. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende medir a quantidade de íon precursor de padrão interno tendo uma razão de massa-para-carga de 734,6 ± 0,5 ou íon de produto tendo uma razão de massa-para-carga de 839,5 ± 0,5 ou 997,6 ± 0,5.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o limite de quantificação dos métodos é menos do que ou igual a 50 ng/mL.

26. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o limite de detecção dos métodos é menos do que ou igual a 35,5 ng/mL.

27. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma linearidade de quantificação em uma faixa entre 50 ng/mL a 50.000 ng/mL.

28. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma reprodutibilidade inter- e intraensaio de CV ≤ 15%.

29. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espectrometria de massa é espectrometria de massa por monitoramento de reação selecionada (SRM).

30. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é totalmente automatizado.

31. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é livre de anticorpo.