KR20170142673A - 종이분무이온화 및 질량분석기를 이용한 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법 - Google Patents

종이분무이온화 및 질량분석기를 이용한 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 생체 뇨 시료와 내부표준물질을 혼합한 시료액을 종이 중앙에 가수하고 건조하는 단계; (b) 건조된 종이를 질량분석기(mass spectrometry) 입구에 장착하는 단계; (c) 질량분석기 입구에 장착된 종이에 스프레이 용매를 가수하고 고전압을 이용하여 이완화 하는 단계; (d) 이온화된 물질을 질량분석기를 이용하여 검출하는 단계; 및 (e) 검출 결과를 분석하고 검량곡선으로 획득하여 에페드린류를 정량 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 직적 정량 분석 방법은 생체 뇨 시료의 전처리 없이 뇨 시료 내 에페드린류를 종이분무이온화 및 질량분석기(Paper spray ionization/mass spectrometry, PSI/MS)를 이용하여 직접 분석함으로써 매우 신속하고 정확하게 에페드린류 농도를 분석하기에, 경제적인 측면과 시간적인 측면에서 탁월한 우수성을 가진다. 이에 도핑, 제약, 식품 및 환경 등의 다양한 분야에서 약물의 빠른 검출 및 정량 분석에 널리 적용할 수 있다.

Description

종이분무이온화 및 질량분석기를 이용한 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법{Direct quantitation method of ephedrines in urine using paper spray ionization and mass spectrometry}
본 발명은 시료의 전처리 없이 생체 뇨 시료 내 에페드린류를 종이분무이온화 및 질량분석기(Paper spray ionization/mass spectrometry, PSI/MS)를 이용하여 직접 분석함으로써 매우 신속하고 정확하게 농도를 분석하는 방법에 관한 것으로, 극히 소량의 시료와 용매를 사용함에도 매우 빠른 분석 시간 내에 생체 뇨 시료 내 에페드린류(Ephedrines)을 정량 분석할 수 있는 방법이다.
도핑에서 에페드린류는 세계반도핑기구(World Anti-Doping Agency, WADA)의 금지물질목록 중 정량성 물질(Threshold substance)에 포함되어 있으며, 양/음성의 판정 기준이 되는 한계 농도(Threshold value)를 갖는다.
상기 에페드린류는 생체 뇨 시료에서 한계 농도 초과 검출 시 도핑 양성으로 판정되므로, 위양성/위음성을 피하기 위해 정확하게 농도를 분석해야 한다.
종래에는 에페드린류를 액체크로마토그래피-전기분무이온화 및 질량분석기(Liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry, LC-ESI/MS)를 이용하여 분석하고 있었다.
그러나 상기 LC-ESI/MS는 시료 분석에서 방해물질의 간섭을 최소화하기 위해 전처리가 필수적이고, 크로마토그래피를 위해 수 분 이상의 분석 시간과 다량의 유기용매(이동상)가 필요하다.
이에 Kang MI Lee 등은 Rapid Communications in Mass spectrometry, 25 (2011) 2261-2267에서 생체 뇨 시료의 전처리 기술로 희석 방법(dilution method)을 이용한 분석 방법을 발표하였다.
그러나 LC-ESI/MS를 이용한 분석 방법에서 시료 전처리를 희석방법으로 사용하더라도 최소 십 여분이 소요되었고, 분석시간 또한 최소 6분 이상이 소요되었다. 또한 전처리 단계가 많을수록 농도측정에 대한 오차가 커질 수 있다. 현재 도핑분석에서 시료 수는 매년 급증하고 있으며, 점차 빠르고 정밀·정확한 분석 결과를 요구하고 있다.
따라서 도핑분석에서 에페드린류를 신속하고 정확하게 분석 및 정량할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.
Kang MI Lee et al, Rapid communications in Mass Spectrometry, 25 (2011) 2261-2267
이에 본 발명자들은 시료의 전처리 없이 생체 뇨 시료 내 에페드린류를 매우 빠른 분석 시간 내에 정확하게 분석할 수 있는 방법을 고안하던 중, 종이분무이온화 및 질량분석기(Paper spray ionization/mass spectrometry, PSI/MS)를 이용하는 경우 극히 소량의 시료와 용매를 사용함에도 매우 빠른 분석 시간 내에 생체 뇨 시료 내 에페드린류(Ephedrines)을 정량 분석할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명은 시료 전처리 없이 생체 뇨 시료 내 에페드린류를 종이분무이온화 및 질량분석기(Paper spray ionization/mass spectrometry, PSI/MS)를 이용하는 직접 분석함으로써 매우 신속하고 정확하게 에페드린류 농도를 분석하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명에서는 (a) 생체 뇨 시료와 내부표준물질을 혼합한 시료액을 종이 중앙에 가수하고 건조하는 단계; (b) 건조된 종이를 질량분석기(mass spectrometry) 입구에 장착하는 단계; (c) 질량분석기 입구에 장착된 종이에 스프레이 용매를 가수하고 고전압을 이용하여 이완화 하는 단계; (d) 이온화된 물질을 질량분석기를 이용하여 검출하는 단계; 및 (e) 검출 결과를 분석하고 검량곡선으로 획득하여 에페드린류를 정량 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 에페드린류 분석 방법은 크로마토그래피를 사용하지 않고 종이분무이온화 및 질량분석기를 이용하여, 0.8분 이내의 분석시간으로 에페드린류의 농도를 신속하게 분석할 수 있다.
또한 도핑 분야 뿐만 아니라, 제약, 식품 및 환경 등의 다양한 분야에서 약물의 빠른 검출 및 정량 분석 까지 그 응용범위를 확장할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 뇨 시료에서 에페드린류의 직접 정량을 위한 분석 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 종이분무이온화 및 질량분석기(Paper spray ionization/mass spectrometry, PSI/MS)를 이용하여 분석한 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 스펙트럼 결과이다.
도 3은 종이분무이온화 및 질량분석기(Paper spray ionization/mass spectrometry, PSI/MS)를 이용하여 분석한 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 검량곡선 결과이다.
본 발명은 (a) 생체 뇨 시료와 내부표준물질을 혼합한 시료액을 종이 중앙에 가수하고 건조하는 단계; (b) 건조된 종이를 질량분석기(mass spectrometry) 입구에 장착하는 단계; (c) 질량분석기 입구에 장착된 종이에 스프레이 용매를 가수하고 고전압을 이용하여 이완화 하는 단계; (d) 이온화된 물질을 질량분석기를 이용하여 검출하는 단계; 및 (e) 검출 결과를 분석하고 검량곡선으로 획득하여 에페드린류를 정량 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명에서의 에페드린류에는 에페드린(ephedrine, EP), 슈도에페드린(pseudoephedrine, PEP), 노르슈도에페드린(norpsedoephedrine, NPE), 메틸에페드린(methylephedrine, MEP)이 있다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 뇨 시료에서 에페드린류의 직접 정량을 위한 분석 과정을 나타낸 모식도로서, 이하 각 단계별 과정에 대하여 상세하게 설명하도록 한다.
상기 (a) 단계는, 생체 뇨 시료와 내부표준물질을 혼합한 시료액을 종이 중앙에 가수하고 건조하는 단계로서, 생체 뇨 시료는 5 ~ 100 μL를 사용할 수 있으며 더욱 바람직하게는 5 ~ 20 μL를 사용한다. 뇨 시료와 내부표준물질과 혼합하여 시료액을 준비한다. 이때 내부표준물질은 동위원소로 치환된 에페드린류와 동일 구조이거나 비슷한 구조의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 내부표준물질의 경우 에페드린은 d3-에페드린(d3-ephedrine)을, 슈도에페드린은 d3-슈도에페드린 (d3-pseudoephedrine), 노르슈도에페드린은 d3-노르에페드린 (d3-norephedrine), 메틸에페드린은 d3-에페드린(d3-ephedrine)를 내부표준물질로 사용한다.
상기 종이는 여과지를 사용할 수 있으며, 밑변 0.5 ~ 1.5 cm, 높이 0.8 ~ 2.5cm, 꼭지점 각도 약 15 ~ 45°인 삼각형 모양으로 잘라서 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 밑변 0.8 ~ 1.2cm, 높이 1.8 ~ 2.2 cm, 꼭지점 각도 25 ~ 35°이다.
삼각형의 밑변 0.5 cm 미만, 높이 0.8cm 미만, 밑변 1.5cm 초과, 높이 2.5cm 초과인 경우 집게로 고정한 종이가 질량분석기의 입구에서 1.5 cm 이상 또는 0.1cm 이내로 위치 할 수 있기 때문에 이온들이 질량분석기로 들어가지 않을 수도 있다. 또한 삼각형 모양 종이의 꼭지점의 각도가 45°보다 클 경우 용매의 스프레이 범위가 좁아지기 때문에 질량분석기의 입구와 정확하게 일치되지 않으면 분석물질의 검출이 어려울 수 있다.
아울러, 상기 삼각형 모양의 종이 중앙에 0.5 ~ 10 μL의 시료액을 가수할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ~ 5 μL를 가수할 수 있다. 시료액이 10 μL 초과인 경우 시료가 종이위에 넓은 범위로 확산되기 때문에 낮은 재현성이 우려되므로 상기 범위 내에서 가수하는 것이 좋다.
다음으로, 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 건조한 종이를 고전압케이블을 연결한 집게를 이용하여 질량분석기(mass spectrometry) 입구에 고정하는 단계이다.
상기 (c) 단계는 질량분석기 입구에 장착된 종이에 스프레이 용매를 가수(loading)하고 고전압을 이용하여 이완화 하는 단계로서, 종이분무이온화(Paper spray ionization) 하는 단계이다.
상기 스프레이 용매는 스프레이 용매는 증류수(water), 아세토나이트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol), 및 이소프로판올 (2-propanol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매에 초산 (acetic acid) 또는 포름산(formic acid)을 혼합한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 0.1% 포름산을 포함한 아세토나이트릴를 단독으로 사용하거나, 0.1% 포름산을 포함한 증류수와 0.1% 포름산을 포함한 아세토나이트릴을 90 : 10 내지 10 : 90의 비율로 혼합한 것을 사용할 수 있다. 이는 혼합비율에 따라 종이위의 건조된 시료 내 분석물질의 용해도가 다르기 때문에 분석물질의 용해도를 고려하여 적절한 용매를 사용해야 한다.
이때 스프레이 용매의 가수양은 삼각형 모양의 종이 크기에 따라 최대 가수양이 결정될 수 있으나, 바람직하게는 10 ~ 50 μL를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 ~ 40 μL를 사용한다. 스프레이 용매의 가수양이 10 μL 미만인 경우 종이가 충분히 적셔지지 않아 이온화가 되지 않으며, 40 μL 초과인 경우 용매가 흘러넘칠 수 있기 때문에 상기 범위 내에서 사용한다.
이온화 시 전기 분무 이온화원의 조건은 양이온 모드에서 이온스프레이 전압 (spray voltage)은 3.0 ~ 5.0 kV, 모세관 온도 (capillary temperature)는 200 ~ 350℃를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이온스프레이전압 3.5 ~ 4.5 kV, 모세관온도 200 ~ 250℃를 사용한다. 이온스프레이 전압이 3.0 kV 미만인 경우 안정적으로 이온화가 되지 않으며, 5.0 kV 초과인 경우 종이가 탈 수 있기 때문에 상기 범위 내에서 사용한다.
상기 (d) 단계는 (c) 단계에서 이온화된 물질을 질량분석기(mass spectrometry)를 이용하여 검출하는 단계로서, 질량분석기로서 고분해능 질량분석기(High resolution mass spectrometry) 또는 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole mass spectrometry)를 사용할 수 있다.
끝으로, 상기 (e) 단계는 검출 결과를 분석하고 검량곡선으로 획득하여 에페드린류를 정량 분석하는 단계로서, 에페드린류의 농도를 분석을 위하여 내부표준법을 사용할 수 있으며, 검량곡선은 농도 대 분석물질과 내부표준물질의 양성화된 이온([M+H]+)의 시그널 (signal)비로 작성할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법으로 시료를 분석할 시, 생체 뇨 시료의 전처리 없이, 뇨 시료 속 에페드린(ephedrine, EP), 슈도에페드린(pseudoephedrine, PEP), 노르슈도에페드린(norpsedoephedrine, NPE), 메틸에페드린(methylephedrine, MEP)를 0.8분 이내로 매우 신속하고 정확하게 직접 정량 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 하나, 하기한 실시예는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아님을 이해하여만 할 것이다.
실시예 1: 직접 정량 분석
(a) 시료액의 준비와 종이에 가수 및 건조 단계
에페드린, 슈도에페드린, 메틸에페드린, 노르슈도에페드린의 분석물질을 포함하는 뇨 시료(urine) 10 μL를 각각 준비하였다.
상기 준비한 각각의 에페드린, 노르슈도에페드린, 메틸에페드린를 포함하는 뇨 시료 10 μL와 내부표준물질용액 10 μL를 혼합하여 시료액을 준비하였고, 슈도에페드린의 경우 뇨 시료 10 μL와 내부표준물질용액 90 μL를 혼합하여 시료액을 준비하였다.
이때 내부표준물질의 경우 에페드린은 농도 10 μg/mL의 d3-에페드린(d3-ephedrine)을, 슈도에페드린은 농도 10 μg/mL의 d3-슈도에페드린 (d3-pseudoephedrine), 노르슈도에페드린은 농도 10 μg/mL의 d3-노르에페드린 (d3-norephedrine), 메틸에페드린은 농도 50 μg/mL의 d3-에페드린(d3-ephedrine)을 메탄올에 녹여서 사용하였다. 내부표준물질은 동위원소로 치환된 에페드린류와 동일 구조이거나 비슷한 구조의 물질인 것을 사용한다.
그리고 종이는 Munktell Filter AB사 (Falun, Sweden)의 Grade 1F (두께 0.18 mm) 여과지를 밑변 1 cm, 높이 2 cm의 삼각형모양으로 잘라서 사용하였으며 이때 삼각형의 끝의 각도는 약 30°이였다.
상기와 같이 준비한 에페드린, 노르슈도에페드린, 메틸에페드린을 포함하는 시료액의 경우 밑변 1 cm, 높이 2 cm, 삼각형의 끝 각도 약 30°인 종이 중앙에 2 μL씩 가수한 후 건조하였고, 슈도에페드린을 포함하는 시료액의 경우 밑변 1 cm, 높이 2 cm, 삼각형의 끝 각도 약 30°인 종이 위에 1μL를 가수한 후 건조하여, 건조된 종이를 준비하였다.
(b) 질량분석기(mass spectrometry) 입구에 장착하는 단계
건조된 종이는 백금선으로 고전압케이블을 연결한 집게를 이용하여 고정시켰고, 질량분석기 입구에서 5 mm 거리에 위치하도록 하였다.
(c) 스프레이 용매를 이용한 가수와 이온화 하는 단계
고정된 종이에 아세토니트릴: 증류수를 50 : 50 (0.1% 포름산 포함)의 비율로 혼합한 스프레이 용매 20 μL를 종이 위에 떨어뜨려 적신 후 고전압을 이용하여 이온화 하였다.
이때, 사용된 질량분석기는 Thermo사의 LTQ Orbitrap (San Jose, CA, USA) 기기를 사용하고, 질량분석기의 양이온 모드에서 이온스프레이 전압(Spray voltage)이 4.0 kV, 모세관 온도가 200 ℃, 튜브렌즈(Tube lens) 100 V의 조건으로 풀스캔 모드 (full scan mode)를 사용하여 이온화 하였다.
(d) 검출 단계
상기 모든 시료액의 총 분석 시간은 0.8분 이었다.
(e) 검량곡선 및 분석 결과 단계
상기 분석 결과를 농도 대 분석물질과 내부표준물질의 시그널 (signal) 비로 작성하여 검량곡선으로 획득하여 뇨 시료 내 에퍼드린류를 정량 분석하였다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 뇨 시료에서 에페드린류의 직접 정량을 위한 분석 과정을 나타낸 것이다.
분석 결과, 종이분무이온화 및 질량분석기를 이용한 생체 뇨 시료의 분석에서 20 μL의 스프레이 용매를 종이 위에 떨어뜨려 이온화 하였을 경우, 분석물질은 0.1분 부터 0.7분까지 검출되었다. 총 분석시간은 0.8분으로 하였다. 이는 도 1의 5단계의 결과를 통해 확인할 수 있다. 아울러, 스프레이 용매의 가수양과 물의 비율이 증가할수록 분석물질이 검출되는 시간은 증가되었다.
도 2를 살펴보면, 분석 물질인 에페드린, 슈도에페드린, 노르슈도에페드린, 메틸에페드린과 그의 내부표준물질들은 종이분무이온화 및 질량분석기를 이용하여 모두 양성화된 이온([M+H]+)으로 검출되었음을 확인할 수 있다.
또한 고분해능 질량분석기를 이용한 결과, 모든 물질들의 질량오차(mass error)는 5 ppm(parts per million) 미만으로 나타났다. 에페드린류에 대한 한계 농도, 화학식, 분자량, 검출된 이온 및 질량오차는 하기 표 1에 나타내었다.
에페드린류 한계 농도 (μg/mL) 화학식 (Formula) 분자량
(mass)		 검출된 이온 [M+H]+, (m/z) 질량 오차
(, ppm)
에페드린 10 C10H15NO 165.1154 166.1225 4.15
슈도에페드린 150 C10H15NO 165.1154 166.1229 1.74
노르슈도에페드린 5 C9H13NO 151.0997 152.1071 2.89
메틸에페드린 10 C11H17NO 179.1310 180.1389 0.34
이때 에페드린류의 검정범위는 세계반도핑기구에서 제시한 기준에 따라 한계 농도의 50 - 200%를 포함할 수 있는 농도로 결정되었으며, 에페드린은 5 - 25 μg/mL, 슈도에페드린 50 - 500μg/mL, 노르슈도에페드린 1 - 20μg/mL, 메틸에페드린 5 - 25μg/mL이었다. 도 3은 에페드린류의 검량곡선과 직선성의 상관계수(R2)를 나타낸 것으로 모든 검량곡선은 정량 범위 내에서 직선성(R2 0.9928)을 나타내었다.
실험예 1: 유효성 검증
본 발명에 따른 분석 방법의 유효성을 검증하기 위해, 세 개의 다른 농도에서 일내 5회 반복 처리 및 3일간 반복 처리하여 본 발명의 분석 방법에 따라 분석하였다. 반복 처리하여 분석한 결과에 대한 정확도(accuracy, %)와 정밀도(precision)는 표 2에 나타내었다.
에페드린류 농도
(μg/mL) 		일내 5회 반복처리 (n=5) 3일간 반복처리 (n=3)
정밀도 (precision) 정확도 (accuracy %) 정밀도 (precision) 정확도 (accuracy %)
에페드린 5 3.83 97.2 ± 3.72 7.81 96.8 ± 7.56
10 5.23 107.5 ± 5.62 8.31 95.9 ± 7.97
20 3.09 101.5 ± 3.13 7.75 101.7 ± 7.88
슈도에페드린 50 12.40 95.5 ± 11.85 5.40 93.9± 5.07
100 5.19 104.6 ± 5.43 2.81 100.4 ± 2.82
300 8.24 99.7 ± 8.22 4.89 103.3 ± 5.05
노르슈도에페드린 2 9.47 105.5 ± 10.0 5.98 107.3 ± 6.42
5 7.30 98.2 ± 7.17 8.39 98.9 ± 8.30
15 3.49 110.0 ± 3.84 6.99 101.8 ± 7.12
메틸에페드린 5 6.44 100.2 ± 6.45 11.67 94.1 ± 10.99
10 9.97 95.6 ± 9.53 4.96 96.2 ± 4.77
20 7.07 98.8 ± 6.98 6.66 98.1 ± 6.54
상기 표 2를 살펴보면, 정확도는 100 ± 15% 이내, 정밀도 15% 이내의 기준을 만족하였는바, 본 발명에 따른 분석방법에 대한 유효성이 검증되었다.
실시예 2: 미지 시료 분석
실시예 1에서 준비한 뇨 시료 대신 WADA의 숙련도검사(proficiency test)에서 사용되는 미지 시료(blind sample)를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
에페드린류 미지 시료의 농도
(μg/mL, WADA 제공) 		측정 농도
(μg/mL)		 정확도
(accuracy, %)
에페드린 12.6 13.4 ± 0.35 106.1 ± 2.79
11.6 11.7 ± 0.53 101.2 ± 4.58
슈도에페드린 215 188 ± 7.8 87.5 ± 3.63
노르슈도에페드린 7.6 8.0 ± 0.50 104.7 ± 6.58
8.2 8.2 ± 0.13 99.8 ± 1.58
메틸에페드린 11.3 11.2 ± 0.42 99.2 ± 3.69
상기 표 3을 살펴보면, 측정농도는 미지시료의 농도와 대비하여 87.5 ~ 106.1%의 정확도를 나타내었다.
따라서 본 발명에 따른 분석 방법은 생체 뇨 시료 중 에페드린류를 신속하고 정확하게 직접 분석함으로써, 도핑, 제약, 식품 및 환경 등의 다양한 분야에서 약물의 빠른 검출 및 정량 분석할 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 생체 뇨 시료와 내부표준물질을 혼합한 시료액을 종이 중앙에 가수(loading)하고 건조하는 단계;
    (b) 건조된 종이를 질량분석기(mass spectrometry) 입구에 장착하는 단계;
    (c) 질량분석기 입구에 장착된 종이에 스프레이 용매를 가수(loading)하고 고전압을 이용하여 이완화 하는 단계;
    (d) 이온화된 물질을 질량분석기를 이용하여 검출하는 단계; 및
    (e) 검출 결과를 분석하고 검량곡선으로 획득하여 에페드린류를 정량 분석하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 종이는 밑변 0.5 ~ 1.5 cm, 높이 0.8 ~ 2.5 cm, 꼭지점 각도 약 15 ~ 45°인 삼각형 모양인 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가수는 종이 중앙에 0.5 ~ 10 μL의 시료액을 가수하는 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 장착은 고전압케이블을 연결한 집게를 이용하여 고정하는 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 스프레이 용매는 증류수(water), 아세토나이트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol), 및 이소프로판올 (2-propanol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매에 초산 (acetic acid) 또는 포름산 (formic acid)을 혼합한 것은 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 스프레이 용매의 가수양은 10 ~ 50 μL인 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 이온화 조건은 전기분무 이온화원의 양이온 모드에서 이온스프레이 전압(spray voltage) 3.0 ~ 5.0 kV, 모세관 온도(capillary temperature) 200 ~ 350℃인 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 질량분석기는 고분해능 질량분석기 (High resolution mass spectrometry) 또는 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole mass spectrometry)인 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 (e) 단계는 에페드린류의 농도 분석을 위해 내부 표준법을 이용하는 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 에페드린류는 에페드린(ephedrine, EP), 슈도에페드린(pseudoephedrine, PEP), 노르슈도에페드린(norpsedoephedrine, NPE), 메틸에페드린(methylephedrine, MEP)인 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 내부표준물질의 경우 에페드린은 d3-에페드린(d3-ephedrine)을, 슈도에페드린은 d3-슈도에페드린 (d3-pseudoephedrine), 노르슈도에페드린은 d3-노르에페드린 (d3-norephedrine), 메틸에페드린은 d3-에페드린(d3-ephedrine)을 내부표준물질로 사용하는 것을 특징으로 하는 생체 뇨 시료 내 에페드린류의 직접 정량 분석 방법.
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