CN112858459B - 基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，所述基质样品制备方法包括：将HPLC级乙腈和三氟乙酸混合，得到标准溶剂；在所述标准溶剂中加入4‑羟基‑3‑硝基苯甲腈，得到基质溶液；将待测样品制备为样品溶液；将所述样品溶液和所述基质溶液按体积比1:1混合后，得到混合溶液；将所述混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到样品靶板。本发明提供的基质适用范围广，不仅适用于小分子化合物和多肽样品的检测，而且适用于蛋白质样品的检测，此外检测时样品制备方法简便，解决了目前使用有机酸基质对低分子量分析物进行MALDI‑TOF质谱时检测受限的问题。

Description

基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分 析方法

技术领域

本发明涉及化学技术领域，特别涉及一种基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法。

背景技术

基质辅助激光解吸离子化质谱(Matrix-assisted laser desorptionionization mass spectrometry，MALDI-MS)是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的质谱分析技术。这种离子化方式产生的离子常用飞行时间(time offlight，TOF)检测器检测，因此MALDI常与TOF一起称为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。MALDI-TOF-MS技术使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革，从此迈入生物质谱技术发展新时代。该技术的特点是采用被称为“软电离”方式，一般产生稳定分子离子，因而是测定生物大分子分子量的有效方法，广泛地运用于生物化学、高分子化学、有机化学、金属有机化学、药学等领域。

MALDI-TOF-MS采用基质(Matrix)当作能量传递的媒介，将基质与被分析物溶液混合后结晶，激光照射结晶时产生气态离子，在电极电场作用下气态离子被引入飞行时间(TOF)质量分析器，不同质荷比的离子到达检测器的时间不同从而进行质荷比的测量。基质在MALDI中的作用在于辅助激光解吸电离被分析物。一般认为基质吸收激光的能量，将能量转换为热能传递给被分析物，并为被分析物提供质子作为电荷的来源。MALDI-TOF中使用基质的优点是使离子化过程更加温和，可产生大部分带单个电荷或者带2～3个电荷的离子，并且通常是质子化或去质子化的完整被分析物，而非被分析物的碎片离子。

目前大部分MALDI-TOF质谱基质为有机酸，如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)等，被广泛应用于分析多肽、蛋白质、核酸和聚合物等。由于上述有机酸基质吸收激光能量时产生碎片离子，在质谱分析的低质量范围内形成大量碎片离子峰，使MALDI-TOF质谱对低分子量分析物的检测受到限制。除此之外，有机酸基质通常适用于某一类分析物的检测，如CHCA适用于多肽样品的检测，SA适用于蛋白质样品的检测，且使用SA时样品制备方法复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，以至少解决目前使用有机酸基质对低分子量分析物进行MALDI-TOF质谱时检测受限的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基质样品制备方法，所述基质样品制备方法包括：

将HPLC级乙腈和三氟乙酸混合，得到标准溶剂；

在所述标准溶剂中加入4-羟基-3-硝基苯甲腈，得到基质溶液，其中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的结构式为：

将待测样品制备为样品溶液；

将所述样品溶液和所述基质溶液按体积比1:1混合后，得到混合溶液；

将所述混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到样品靶板。

可选的，在所述的基质样品制备方法中，所述标准溶剂中所述HPLC级乙腈和所述三氟乙酸的体积比为100:1～1000:1。

可选的，在所述的基质样品制备方法中，所述标准溶剂中所述HPLC级乙腈和所述三氟乙酸的体积比为1000:1。

可选的，在所述的基质样品制备方法中，所述基质溶液中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的浓度为25±5mg/mL。

可选的，在所述的基质样品制备方法中，所述基质溶液中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的浓度为25mg/mL。

可选的，在所述的基质样品制备方法中，取所述混合溶液1±0.5μL点在靶板上，自然干燥。

可选的，在所述的基质样品制备方法中，所述待测样品为MRFA，所述将待测样品制备为样品溶液的方法包括：

将MRFA溶解于HPLC级超纯水中，得到浓度为1000±20ppm的MRFA初溶液；

在所述MRFA初溶液中加入HPLC级超纯水，得到浓度为1±0.02ppm的MRFA样品溶液。

可选的，在所述的基质样品制备方法中，所述待测样品为IgG蛋白，所述将待测样品制备为样品溶液的方法包括：

将三氟乙酸溶解于HPLC级超纯水中，得到浓度为0.1±0.05％的三氟乙酸溶液；

将IgG蛋白溶解于所述三氟乙酸溶液中，得到IgG蛋白样品溶液，所述IgG蛋白样品溶液中所述IgG蛋白的浓度为1±0.02mg/mL。

为解决上述技术问题，本发明还提供一种基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法包括：

使用质谱仪，其中脉冲激光光源的波长为355nm，重复频率为1000～2000Hz，单张质谱图激光照射次数为200～500次；

将根据如上任一项所述的基质样品制备方法制备的样品靶板送入质谱仪，等待质谱仪真空达到工作状态；

根据待测样品的分子量区间选择对应的质谱方法；

激光轰击所述样品靶板的结晶区域，产生离子，离子经过飞行时间质量分析器到达检测器，得到所述待测样品的质谱图。

可选的，在所述的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法还包括：

根据所述质谱图的质量，调整所述脉冲激光光源的参数，得到多个不同的所述待测样品的质谱图；

从多个所述质谱图中选择质量最佳的质谱图，作为所述待测样品的最终质谱结果。

本发明提供的基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，所述基质样品制备方法包括：将HPLC级乙腈和三氟乙酸混合，得到标准溶剂；在所述标准溶剂中加入4-羟基-3-硝基苯甲腈，得到基质溶液；将待测样品制备为样品溶液；将所述样品溶液和所述基质溶液按体积比1:1混合后，得到混合溶液；将所述混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到样品靶板。本发明提供的基质适用范围广，不仅适用于小分子化合物和多肽样品的检测，而且适用于蛋白质样品的检测，此外检测时样品制备方法简便，解决了目前使用有机酸基质对低分子量分析物进行MALDI-TOF质谱时检测受限的问题。

附图说明

图1为本实施例提供的基质样品制备方法的流程图；

图2为本实施例提供的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法的流程图；

图3为本实施例提供的基质与现有基质的背景峰的质谱对比图；

图4为本实施例提供的基质与现有基质在检测MRFA时的质谱对比图；

图5为本实施例提供的基质与现有基质在检测IgG蛋白时的质谱对比图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明提出的基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法作进一步详细说明。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。此外，附图所展示的结构往往是实际结构的一部分。特别的，各附图需要展示的侧重点不同，有时会采用不同的比例。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本实施例提供一种基质样品制备方法，如图1所示，所述基质样品制备方法包括：

A1，将HPLC级乙腈和三氟乙酸混合，得到标准溶剂；

A2，在所述标准溶剂中加入4-羟基-3-硝基苯甲腈，得到基质溶液，其中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的结构式为：

A3，将待测样品制备为样品溶液；

A4，将所述样品溶液和所述基质溶液按体积比1:1混合后，得到混合溶液；

A5，将所述混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到样品靶板。

需要说明的是，本发明所述的HPLC级表示化学试剂的纯度，意思为可在高效液相色谱中使用的试剂的纯度。

本实施例提供的基质样品制备方法，由于其中的基质为4-羟基-3-硝基苯甲腈，使得能够适用于各类化合物和蛋白质等，尤其适用于小分子化合物和多肽样品的检测，以及适用于蛋白质样品的检测。此外，本实施例提供的基质样品制备方法相较于现有技术中基质样品制备方法而言，制备方法简便易行，降低了基质样品的制备难度。解决了目前使用有机酸基质对低分子量分析物进行MALDI-TOF质谱时检测受限的问题。

进一步的，在本实施例中，所述标准溶剂中所述HPLC级乙腈和所述三氟乙酸的体积比为100:1～1000:1。具体的，所述标准溶剂中所述HPLC级乙腈和所述三氟乙酸的体积比为1000:1。

以及，在本实施例中，所述基质溶液中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的浓度为25±5mg/mL。具体的，所述基质溶液中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的浓度为25mg/mL。

在本实施例中，较佳的，取所述混合溶液1±0.5μL点在靶板上，自然干燥。

需要说明的是，本实施例所述的自然干燥指在常温常湿的洁净环境下干燥以得到结晶。

本实施例还提供一种基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，如图2所示，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法包括：

B1，使用质谱仪，其中脉冲激光光源的波长为355nm，重复频率为1000～2000Hz，单张质谱图激光照射次数为200～500次；

B2，将根据本实施例提供的基质样品制备方法制备的样品靶板送入质谱仪，等待质谱仪真空达到工作状态；

B3，根据待测样品的分子量区间选择对应的质谱方法；

B4，激光轰击所述样品靶板的结晶区域，产生离子，离子经过飞行时间质量分析器到达检测器，得到所述待测样品的质谱图。

较佳的，在本实施例中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法还包括：

B5，根据所述质谱图的质量，调整所述脉冲激光光源的参数，得到多个不同的所述待测样品的质谱图；

B6，从多个所述质谱图中选择质量最佳的质谱图，作为所述待测样品的最终质谱结果。

图3给出了本实施例提供的基质(4-羟基-3-硝基苯甲腈)和现有常规基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA))的背景峰的质谱对比图。从图3中可以看出，本实施例提供的基质相对于现有常规基质而言，在0～1000m/z范围内相对强度均更低，接近于0，从而能够在质谱分析低分子量样品时避免基质带来的影响，使小分子化合物、多肽以及蛋白质样品能够被精准的检测。

以下，以两个具体实施例说明本发明提供的基质用于进行多肽质谱和蛋白质质谱的过程及结果。

【实施例一】

本实施例包括本发明提供的基质(4-羟基-3-硝基苯甲腈)和现有常规基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA))分别对MRFA(一种四肽)进行检测的样品制备方法和质谱检测结果。

在本实施例中，所述待测样品为MRFA，所述将待测样品制备为样品溶液的方法包括：

将MRFA溶解于HPLC级纯水中，得到浓度为1000±20ppm的MRFA初溶液；

在所述MRFA初溶液中加入HPLC级纯水，得到浓度为1±0.02ppm的MRFA样品溶液。

具体的：

1.本实施例提供的基质在对MRFA进行质谱检测时基质样品的制备方法：

首先，在1.5mL离心管中加入1000μL的HPLC级乙腈和1μL的三氟乙酸(TFA)，混合均匀，制备成含有0.1％TFA的标准溶剂。

然后，在上一步得到的标准溶剂中加入25mg的4-羟基-3-硝基苯甲腈(4-Hydroxy-3-nitrobenzonitrile)，制备成4-羟基-3-硝基苯甲腈的基质溶液。该基质溶液可在4℃冰箱中保存一个月。

接着，称取1mg的MRFA，并将其完全溶解在1mL的HPLC级超纯水中，制备成1000ppm的MRFA初溶液。

再接着，取上述MRFA初溶液1μL，加入1000μL的HPLC级超纯水，制备成1ppm的MRFA样品溶液。

之后，取MRFA样品溶液和4-羟基-3-硝基苯甲腈基质溶液各1μL，混合均匀，得到混合溶液。

最后，取1μL混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到MRFA的样品靶板。

2.现有常规基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)在对MRFA进行质谱检测时基质样品的制备方法：

首先，在1.5mL离心管中加入300μL的HPLC级乙腈、0.1％的三氟乙酸(TFA)和700μL的HPLC级超纯水，混合均匀，制备TA30。

然后，在TA30中加入10mg的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，制备成基质溶液。

接着，称取1mg的MRFA，并将其完全溶解在1mL的HPLC级超纯水中，制备成1000ppm的MRFA初溶液。

再接着，取上述MRFA初溶液1μL，加入1000μL的HPLC级超纯水，制备成1ppm的MRFA样品溶液。

之后，取MRFA样品溶液和CHCA基质溶液各1μL，混合均匀，得到混合溶液。

最后，取1μL混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到MRFA的样品靶板。

3.采集MRFA样品质谱数据的方法：

在本实施例中，使用Bruker autoflex speed质谱仪，其中脉冲激光光源的波长为355nm，重复频率为2000Hz，单张质谱图激光照射次数为500次。

首先，将MRFA的样品靶板送入质谱仪，等待质谱仪真空达到工作状态。

然后，选择方法LP_0-2000_Da.par，在固态样品的结晶位置，激光能量E在30％～40％范围内时点击“Start”(开始)，获取质谱图。

得到的本实施例提供的基质和现有常规基质(CHCA)对MRFA样品进行质谱的结果如图4所示，检测结果显示离子峰质荷比(m/z)为524.701Da。

从图4中可以看出，本实施例提供的基质和现有常规基质对MRFA的检测结果一致，但现有常规基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA))的质谱出现了多个强度较高值，这些强度较高值在某些情形下，很容易造成样品质谱的误判，导致样品质谱的结果错误；而本实施例提供的基质(4-羟基-3-硝基苯甲腈)的质谱中仅存在一个峰值，且该峰值即为MRFA的质谱结果。也就是说，本实施例提供的基质相较于现有常规基质，能够在检测多肽时排除基质本身的干扰，得到准确的质谱结果。

【实施例二】

本实施例包括本发明提供的基质(4-羟基-3-硝基苯甲腈)和现有常规基质(5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA))分别对IgG蛋白进行检测的样品制备方法和质谱检测结果。

在本实施例中，所述待测样品为IgG蛋白，所述将待测样品制备为样品溶液的方法包括：

将三氟乙酸溶解于HPLC级超纯水中，得到浓度为0.1±0.05％的三氟乙酸溶液；

将IgG蛋白溶解于所述三氟乙酸溶液中，得到IgG蛋白样品溶液，所述IgG蛋白样品溶液中所述IgG蛋白的浓度为1±0.02mg/mL。

具体的：

1.本实施例提供的基质在对述IgG蛋白进行质谱检测时基质样品的制备方法：

首先，在1.5mL离心管中加入1000μL的HPLC级乙腈和1μL的三氟乙酸(TFA)，混合均匀，制备成含有0.1％TFA的标准溶剂。

然后，在上一步得到的标准溶剂中加入25mg的4-羟基-3-硝基苯甲腈(4-Hydroxy-3-nitrobenzonitrile)，制备成4-羟基-3-硝基苯甲腈的基质溶液。该基质溶液可在4℃冰箱中保存一个月。

接着，将三氟乙酸(TFA)溶解于HPLC级超纯水中，得到浓度为0.1％的TFA溶液。

再接着，称取1mg的IgG蛋白，将其完全溶解于1mL的TFA溶液中，制备成IgG蛋白浓度为1mg/mL的IgG蛋白样品溶液。

之后，取IgG蛋白样品溶液和4-羟基-3-硝基苯甲腈基质溶液各1μL，混合均匀，得到混合溶液。

最后，取1μL混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到IgG蛋白的样品靶板。

2.现有常规基质5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)在对MRFA进行质谱检测时基质样品的制备方法：

首先，在1mL的HPLC级乙醇溶液中加入5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)，制备成饱和溶液，为基质溶液I。

然后，在1.5mL离心管中加入300μL的HPLC级乙腈、0.1％的三氟乙酸(TFA)和700μL的HPLC级超纯水，混合均匀，制备TA30。

之后，在1mL的TA30中加入SA，制备成饱和溶液，为基质溶液II。

接着，将三氟乙酸(TFA)溶解于HPLC级超纯水中，得到浓度为0.1％的TFA溶液。

再接着，称取1mg的IgG蛋白，将其完全溶解于1mL的TFA溶液中，制备成IgG蛋白浓度为1mg/mL的IgG蛋白样品溶液。

然后，取IgG蛋白样品溶液和基质溶液II各1μL，混合均匀，得到混合溶液。

之后，取1μL基质溶液I点在样品靶板上，形成基质薄层。

最后，取1μL混合溶液点在基质薄层上，自然干燥，得到IgG蛋白的样品靶板。

3.采集MRFA样品质谱数据的方法：

在本实施例中，使用Bruker autoflex speed质谱仪，其中脉冲激光光源的波长为355nm，重复频率为2000Hz，单张质谱图激光照射次数为500次。

首先，将IgG蛋白的样品靶板放入质谱仪，等待质谱仪真空达到工作状态。

然后，选择方法LP_30-210_kDa.par，在固态样品的结晶位置，激光能量E在60％～70％范围内时点击“Start”(开始)，获取质谱图。

得到的本实施例提供的基质和现有常规基质(SA)对IgG蛋白样品进行质谱的结果如图5所示，检测结果显示带单个电荷的IgG离子峰质荷比(m/z)为150kDa。

从图5中可以看出，本实施例提供的基质和现有常规基质对IgG蛋白的检测结果一致，但现有常规基质(5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA))的质谱中出现了一个与单个电荷的IgG离子峰相对强度接近的值，因此很容易造成样品质谱的误判，导致样品质谱的结果错误；而本实施例提供的基质(4-羟基-3-硝基苯甲腈)质谱中多个峰值之间的差异较大，很容易区分单个电荷的IgG离子峰相对强度。也就是说，本实施例提供的基质相较于现有常规基质，能够在检测蛋白质时排除基质本身的干扰，得到准确的质谱结果。

需要说明的是，本实施例中所给出的两个具体实施例仅为说明本实施例提供的基质相较于现有常规基质在进行质谱时的优势。在不违背本发明主旨前提下的其他改进(如各组分的占比等)也应当属于本发明的保护范围。

综上所述，本实施例提供的基质样品制备方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，所述基质样品制备方法包括：将HPLC级乙腈和三氟乙酸混合，得到标准溶剂；在所述标准溶剂中加入4-羟基-3-硝基苯甲腈，得到基质溶液；将待测样品制备为样品溶液；将所述样品溶液和所述基质溶液按体积比1:1混合后，得到混合溶液；将所述混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到样品靶板。本发明提供的基质适用范围广，不仅适用于小分子化合物和多肽样品的检测，而且适用于蛋白质样品的检测，此外检测时样品制备方法简便，解决了目前使用有机酸基质对低分子量分析物进行MALDI-TOF质谱时检测受限的问题。

上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。

Claims (10)

1.一种基质样品制备方法，其特征在于，所述基质样品制备方法包括：

将HPLC级乙腈和三氟乙酸混合，得到标准溶剂；

在所述标准溶剂中加入4-羟基-3-硝基苯甲腈，得到基质溶液，其中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的结构式为：

将待测样品制备为样品溶液；

将所述样品溶液和所述基质溶液按体积比1:1混合后，得到混合溶液；

将所述混合溶液点在靶板上，自然干燥，得到样品靶板。

2.根据权利要求1所述的基质样品制备方法，其特征在于，所述标准溶剂中所述HPLC级乙腈和所述三氟乙酸的体积比为100:1～1000:1。

3.根据权利要求2所述的基质样品制备方法，其特征在于，所述标准溶剂中所述HPLC级乙腈和所述三氟乙酸的体积比为1000:1。

4.根据权利要求1所述的基质样品制备方法，其特征在于，所述基质溶液中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的浓度为25±5mg/mL。

5.根据权利要求4所述的基质样品制备方法，其特征在于，所述基质溶液中所述4-羟基-3-硝基苯甲腈的浓度为25mg/mL。

6.根据权利要求1所述的基质样品制备方法，其特征在于，取所述混合溶液1±0.5μL点在靶板上，自然干燥。

7.根据权利要求1所述的基质样品制备方法，其特征在于，所述待测样品为MRFA，所述将待测样品制备为样品溶液的方法包括：

将MRFA溶解于HPLC级超纯水中，得到浓度为1000±20ppm的MRFA初溶液；

在所述MRFA初溶液中加入HPLC级超纯水，得到浓度为1±0.02ppm的MRFA样品溶液。

8.根据权利要求1所述的基质样品制备方法，其特征在于，所述待测样品为IgG蛋白，所述将待测样品制备为样品溶液的方法包括：

将三氟乙酸溶解于HPLC级超纯水中，得到浓度为0.1±0.05％的三氟乙酸溶液；

将IgG蛋白溶解于所述三氟乙酸溶液中，得到IgG蛋白样品溶液，所述IgG蛋白样品溶液中所述IgG蛋白的浓度为1±0.02mg/mL。

9.一种基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，其特征在于，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法包括：

使用质谱仪，其中脉冲激光光源的波长为355nm，重复频率为1000～2000Hz，单张质谱图激光照射次数为200～500次；

将根据权利要求1～8任一项所述的基质样品制备方法制备的样品靶板送入质谱仪，等待质谱仪真空达到工作状态；

根据待测样品的分子量区间选择对应的质谱方法；

激光轰击所述样品靶板的结晶区域，产生离子，离子经过飞行时间质量分析器到达检测器，得到所述待测样品的质谱图。

10.根据权利要求9所述的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法，其特征在于，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法还包括：

根据所述质谱图的质量，调整所述脉冲激光光源的参数，得到多个不同的所述待测样品的质谱图；

从多个所述质谱图中选择质量最佳的质谱图，作为所述待测样品的最终质谱结果。

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