CN114414341A - 一种血液培养报阳的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血液培养报阳的检测方法，属于血液样本检测技术领域。本发明提供的血液培养报阳检测方法，包括如下步骤：将血培养瓶样品和基质液混合，采用质谱法对血培养瓶中分子量为10‑1000Da的小分子成份进行监测，运用AI聚类分析算法，对比小分子成份的变化，实现对血培养瓶报阳检测。本发明利用质谱的高灵敏度、同时能测多种分子的优势，再结合AI算法，能够大大缩短血液培养报阳时间，从而降低该感染的发病率和死亡率。

Description

一种血液培养报阳的检测方法
技术领域
本发明属于血液样本检测技术领域，尤其涉及一种血液培养报阳的检测方法。
背景技术
血液培养报阳的检测是用于检验血液样品中有无细菌存在的一种微生物学检查方法。它是通过将血液接种到培养瓶中，利用培养瓶的营养液对血液感染的微生物进行培养，然后对微生物的生产繁殖情况进行监测。如果检测有微生物，就发出报阳警报。因此，报阳率和报阳速度是血液培养报阳检测最重要的两个指标。
现有的血培养报阳的检测方法主要以下几种：1)法国bioMerieux公司生产的VITAL自动血培养(CN201280067584.3)，其检测原理是液体培养瓶内含有发荧光物质的分子，微生物生长代谢过程中会产生二氧化碳(即碳酸)使得氢离子增加，发荧光的分子接受了这些物质后改变自身结构转变为不发光的化合物，出现荧光衰减现象，一旦被测出，即提示有细菌生长。2)美国BD公司生产的BACTECV自动血培养仪，采用均质荧光增强检测技术。培养瓶底部的荧光传感器受细菌产生的代谢物质激发产生荧光，荧光强度随着细菌数量的增加而不断增强。系统根据荧光变化趋势判断有无微生物生长。3)荷兰OrganonTeknika公司生产的BacT/alert自动血培养仪的检测原理是在血培养瓶底部有一个固相感应器，感应器上有半渗透性薄膜将培养基与感应装置隔离，只有二氧化碳能通过薄膜。当培养瓶内有细菌生长，其释放的二氧化碳可渗透至感应器，经水饱和后，产生氢离子，使pH值发生改变，感应器的颜色也随之改变，颜色由原来的绿色变成黄色，这一过程由一个置于检测组件内部的光反射检测计进行连续监测。4)武汉迪艾斯科技有限公司2017年11月6日(申请公布号CN 107699480 A)申请的一种血液培养检测报阳装置，采用的二氧化碳感应装置测量血培养瓶内二氧化碳浓度变化状态，从而判断培养液中微生物生长状态。
上述全部的检测方法都是通过检测培养液中微生物代谢过程中产生的气体(二氧化碳)浓度或压力的变化，间接地判断微生物的生长状态。因此存在着以下缺点：1)灵敏度低：首先，因为二氧化碳在培养瓶一部分以气体状态存在，另一部分溶解在培养液里，所以上述检测方法只能部分采样，必然会降低检测灵敏度；其次，由于空气自身含有超过0.03％含量的二氧化碳，因此本底高，也大大影响了灵敏度；2)适用范围受限：上述检测方法只能检测那些生产代谢中产生二氧化碳的微生物，对不产二氧化碳的微生物就无法检测；3)成本高：为了探测二氧化碳的变化，需要在血培养瓶中以特殊工艺添加二氧化碳的微生物指示剂，造成血培养瓶的成本昂贵。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种灵敏度和准确率高，简单快捷，报阳时间短的血液培养检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种血液培养报阳的检测方法，包括如下步骤：将血培养瓶样品和基质液混合，采用质谱法对血培养瓶中小分子成份进行监测，运用AI聚类分析算法，对比小分子成份的变化，实现对血培养瓶报阳检测；所述小分子成份的分子量为10-1000Da。
优选的，所述血培养瓶样品为去除血细胞和分子量大于1000Da蛋白质的血清。
优选的，所述基质液包括如下原料：基质，有机溶剂，去离子超纯水和三氟乙酸。
优选的，所述基质包括有机基质或无机基质，所述有机基质包括肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸。
优选的，所述乙腈和去离子超纯水的体积比为为10：0～1：9。
优选的，所述三氟乙酸的用量为基质液重量的0.1～5％。
优选的，所述培养瓶样品和基质液按照等体积比例进行混合。
优选的，所述质谱包括飞行时间质谱和四极杆质谱。
优选的，所述质谱使用的离子源包括基质辅助解吸/电离源质谱、电喷雾质谱和电子轰击离子源。
优选的，所述AI算法包括聚类分析方法，所述聚类分析方法包括K均值，谱聚类和层次聚类。
本发明的有益效果：
现有技术虽然记载了在鉴定报阳血培养细菌中使用质谱技术具有可行性，但是现有技术所公开的是在血培养报阳后使用质谱技术，检测细菌核糖体蛋白等大分子(分子量2kDa～20kDa)物质，对细菌菌种进行判断，并非是将质谱技术应用到血培养报阳的前期阶段。而且现有技术记载的质谱技术是将检测到的细菌核糖体蛋白质谱图与预先建好的标准数据谱库进行检索比对，最后根据谱图之间的相关性得分来判断具体的细菌种类。本发明的技术构思与现有技术不同，本发明基于若血液中含有细菌，细菌将会繁殖和代谢，必然造成培养瓶的组成发生变化的原理，采用质谱仪对血培养瓶中的小分子成份(10-1000Da)进行监测。通过聚类分析等算法，将培养之前和培养之后的血培养瓶中小分子成份的质谱图进行对比分析，从而得出血液样本是否含有细菌，即实现菌血症的报阳诊断。本发明首次采用代谢组学的方法，先检测分子量大小为10-1000Da的细菌代谢产物，对细菌的代谢产物成分进行建模，然后利用统计学进行聚类分析，根据聚类效果来报阳，方法简便快捷易实施，灵敏度可达到1000个/mL，准确率达到90％以上，报阳时间比本领域其它报阳方法缩短一半以上。
附图说明
图1为本发明检测流程原理图；
图2为采用本发明方法获得的质谱图，其中A-C分别为三个靶点质谱图；
图3为采用本发明方法获得的聚类分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种血液培养报阳的检测方法，包括如下步骤：将血培养瓶样品和基质液混合，采用质谱法对血培养瓶中小分子成份进行监测，运用AI聚类分析算法，对比小分子成份的变化，实现对血培养瓶报阳检测；所述小分子成份的分子量为10-1000Da。
在本发明中，所述血培养瓶样品优选的采用如下预处理方法：分离获取血培养瓶样品中的血清，去除血清中的血细胞和大蛋白，待用。本发明对于血清中血细胞和大蛋白的去除方法没有特殊限定，可采用3kDa超滤膜超滤，也可采用与有机溶剂混合后超速离心的方式，所述有机溶剂优选的包括甲醇、乙醇、乙腈或丙酮，所述有机溶剂与血清的体积比优选为10：1，所述超速离心的条件优选为12000转/分，离心10分钟。在本发明中，所述大蛋白优选的为分子量大于1000Da的蛋白质。
在本发明中，所述基质液优选的包括如下原料：基质，有机溶剂，去离子超纯水和三氟乙酸。所述基质优选的包括有机基质或无机基质，所述有机基质优选的包括肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸，本发明对于无机基质的具体种类没有特殊限定，采用本领域常规无机基质种类均可。本发明对于基质液中各原料的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述有机溶剂和去离子超纯水的体积比优选为10：0-1：9，更优选为7：3，所述有机溶剂优选为包括乙腈，所述去离子超纯水的规格优选为电阻率>18MΩ.cm，所述三氟乙酸的用量优选为基质液重量的0.1％-5％，更优选为0.2％-3％。本发明所述基质液的制备方法优选的包括如下步骤：将基质溶于乙腈和去离子超纯水的混合液中，然后加入三氟乙酸。在本发明中，所述基质与有机溶剂和去离子超纯水混合液的质量体积比优选为1mg：10mL。
在本发明中，所述培养瓶样品和基质液优选的按照等体积比例进行混合，得待检样品，等待点样或进样。在本发明中，所述质谱优选的包括飞行时间质谱和四极杆质谱，所述质谱使用的离子源优选的包括基质辅助解吸/电离源质谱、电喷雾质谱和电子轰击离子源。当采用基质辅助解吸/电离源质谱时，优选的采用移液器点1uL上述待检样品在靶板上，每个样品优选的点10个点，待完成干燥结晶之后，送入基质辅助激光解吸/电离源质谱仪中检测。所述基质辅助激光解吸/电离源质谱仪优选的采用Nd:YAG激光器或者氮分子激光器，质量范围设置为10-1000Da，采用正离子模式采集不少于10个靶点，最后得到不少于10组质谱数据。当采用电喷雾离子源时，每次进样1uL，同样采用正离子模式进样10次，最后得到10组数据。每隔10分钟，抽取一次血液培养瓶的样品，按照上述步骤采集数据。每次采集到的质谱数据与培养之前的数据做样本聚类分析，采用AI算法，对比小分子成份(10-1000Da)的变化，如果分类准确率超过90％，则报阳。在本发明中，所述AI算法优选的包括聚类分析方法，所述聚类分析方法优选的包括K均值，谱聚类和层次聚类。本发明的血液培养报阳检测方法的流程图如图1所示。
本发明对于报阳的具体标准没有特殊限定，根据实际情况而定，设定的报阳标准越高，则表明准确度越高，在本发明具体实施例中，设定的报阳标准为：对比小分子成份的变化，如果分类准确率超过90％，则报阳。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
抽取500uL血液培养瓶中的样品(内含液体培养基和血液)，注入真空分离胶采血管中，待血液完全凝固后，3000转/分，离心10分钟，得到血清。抽取100uL上述血清，使用3kDa超滤膜去除血细胞和大蛋白，取上清液等待进样。
称取10mg肉桂酸溶于乙腈和去离子超纯水(V:V＝70：30)的混合液100mL中，去离子超纯水(电阻率>18MΩ.cm)，最后加0.11％的三氟乙酸，制得基质液。将上述上清液50uL与50uL基质液混合，得待测样品，等待点样。
采用移液器点1uL上述待测样品在靶板上，每个样品点10个点。待完成干燥结晶之后，送入基质辅助激光解吸/电离源质谱仪中检测。基质辅助激光解吸/电离源质谱仪采用Nd:YAG激光器，质量范围设置为10-1000Da，采用正离子模式采集不少于10个靶点，最后得到不少于10组质谱数据。每隔10分钟，抽取一次血液培养瓶的样品，按照上述步骤采集数据。每次采集到的质谱数据与培养之前的数据按照层次聚类的方法做样本聚类分析，如果分类准确率超过90％，则进行报阳。结果如图2和图3所示。
实施例2
抽取1000uL血液培养瓶中的样品(内含液体培养基和血液)，注入真空分离胶采血管中，待血液完全凝固后，3000转/分，离心10分钟，得到血清。抽取100uL上述血清，按照1：10的体积比加入甲醇有机溶剂，12000转/分，离心10分钟，取上清液等待进样。
称取10mg 2，5-二羟基苯甲酸溶于乙腈和去离子超纯水(V:V＝1：9)的混合液100mL中，去离子超纯水(电阻率>18MΩ.cm)，最后加5％的三氟乙酸，制得基质液。将上述上清液50uL与50uL基质液混合，得待测样品，等待点样。
采用电喷雾离子源，每次进样1uL，质量范围设置为10-1000Da，同样采用正离子模式进样10次，最后得到不少于10组质谱数据。每隔10分钟，抽取一次血液培养瓶的样品，按照上述步骤采集数据。每次采集到的质谱数据与培养之前的数据按照层次聚类的方法做样本聚类分析，如果分类准确率超过90％，则进行报阳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种血液培养报阳的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将血培养瓶样品和基质液混合，采用质谱法对血培养瓶中小分子成份进行监测运用AI聚类分析算法，对比小分子成份的变化，实现对血培养瓶报阳检测；所述小分子成份的分子量为10-1000Da。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述血培养瓶样品为去除血细胞和分子量大于1000Da蛋白质的血清。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基质液包括如下原料：基质，有机溶剂，去离子超纯水和三氟乙酸。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述基质包括有机基质或无机基质，所述有机基质包括肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂和去离子超纯水的体积比为10：0～1：9。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述三氟乙酸的用量为基质液重量的0.1％～5％。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述培养瓶样品和基质液按照等体积比例进行混合。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱包括飞行时间质谱和四极杆质谱。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱使用的离子源包括基质辅助解吸/电离源质谱、电喷雾质谱和电子轰击离子源。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述AI聚类分析算法包括K均值，谱聚类和层次聚类。
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