CN111239312A - 一种基于化学衍生的血浆中类固醇激素的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种基于化学衍生的血浆中类固醇激素的检测方法。使用液液萃取方式对血浆进行样品前处理，萃取得到的类固醇激素使用2‑肼吡啶作为衍生化试剂与化学结构中含有羰基的类固醇激素进行席夫碱反应，反应产物使用液相色谱‑质谱联用分析，由于衍生化反应产物在电喷雾电离源中的离子化效率较原类固醇激素更高，从而实现类固醇激素的高灵敏度检测。本发明前处理方式简单，不仅可以检测以游离形式存在的类固醇激素，还可以对以与葡萄糖醛酸结合或以硫酸酯形式存在的结合型类固醇激素进行检测，并且衍生产物具有特征二级质谱，有利于定性。该方法具有灵敏度高、特异性的好的优点。

Description

一种基于化学衍生的血浆中类固醇激素的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学和医学领域，是一种基于化学衍生技术用于提高血浆中类固醇激素检测灵敏度的新方法。
背景技术
类固醇激素是一类具有环戊烷多氢菲母核结构的脂溶性小分子化合物。类固醇激素在人体内含量很低，但对人体各项生理功能起着重要的调控作用，体现在机体的生长发育，代谢调节，中枢神经系统等各个方面。近年来的研究发现类固醇激素在前腺癌、乳腺癌等癌症的发生与治疗密切相关，并且类固醇激素以及以结合形式存在的类固醇激素与神经退行性疾病如阿尔茨海默病等也具有相关性。因此通过代谢组学的研究方式分析检测人体内的类固醇激素，对于研究疾病的发生发展与治疗具有重要意义。
早期的类固醇激素检测一般是通过免疫分析方法。但由于基质干扰效应和交叉反应，致使免疫分析法检测类固醇激素的特异性低，重复性差，容易出现假阳性反应，只适合少数激素类物质的分析检测，无法对多种激素同时进行定性和定量。现阶段液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)已经成为广泛采用的类固醇激素检测技术，具有前处理较为简单，方法稳定可靠的优点。
通过固相萃取方式(不经过衍生化)进行样品前处理后，使用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)检测类固醇激素是目前常用的方法。但是由于类固醇激素在电喷雾电离源中的离子化效率较低，导致其检测灵敏度较低。衍生化方法是提高待分析物质离子化效率的一种常用方法，但通过对现有衍生化方法的文献报道进行检索，并没有一种可以同时检测游离形式存在的类固醇激素和结合形式存在的类固醇激素的方法。针对上述情况，我们提出了一种无需固相萃取预处理且可以覆盖大部分常见类固醇激素的基于化学衍生的类固醇激素的检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术不足，旨在提供一种样品前处理简单，基于化学衍生的类固醇激素的检测方法，用于检测人体血浆中类固醇激素，为了解机体生理状态、疾病的发生发展以及治疗提供有效信息。该方法具有灵敏度高、特异性好的优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
具体步骤如下，
第一步：收集血浆，保存。
所述保存，其温度为-80℃。
第二步：取第一步得到的血浆，采用液液萃取提取其中的类固醇激素。
所述血浆，其用量为150μL，所用液液萃取萃取剂为200μL乙腈与200μL乙酸乙酯混合溶液。液液萃取步骤如下：
1)向离心管中加入200μL血浆和200μL乙腈与200μL乙酸乙酯混合溶液；
2)涡旋3分钟；
3)将离心管置于低温高速离心机中14000转/分钟，温度4℃离心；
4)取上层萃取相液体于新的1.5mL离心管中。
第三步：将液液萃取得到的萃取相液体进行冷冻干燥；所述冷冻干燥时间为2-3小时。
第四步：进行衍生化反应：在冷冻干燥的离心管内，加入2-肼吡啶和甲酸的甲醇溶液，涡旋混匀，盖上瓶盖密封，使用水浴加热进行衍生化，然后蒸干甲醇。
所述2-肼吡啶浓度为0.2mg/mL，溶液为甲醇，体积为60μL。
所述甲酸体积分数为5％，溶液为甲醇，体积为60μL。
所述加热温度为55-65℃，加热时间为30-40分钟。
所述蒸干甲醇溶液温度为40-50℃，时间约为15分钟。
第五步：加溶解液涡旋溶解残渣，等待液相色谱-质谱联用进样分析。
所述溶解残渣的溶剂为20％乙腈/水溶液，体积50μL。
所述溶解残渣的涡旋时间为1分钟。
第六步，进行液相色谱-质谱联用检测分析类固醇激素。
所述液相色谱-质谱联用检测的仪器为Q Exactive HF(Thermo FisherScientific,USA)。
所述液相色谱柱为BEH C18柱(5cm×1mm,1.7μm,Waters,USA)。
所述流动相为0.1％甲酸/水溶液以及0.1％甲酸/乙腈溶液。
本发明具有如下优点：
类固醇激素在人体内含量很低，但是人体内一种重要的代谢物，其含量与人体的生理状态密切相关，能反应外界环境刺激与疾病的发生发展引起的变化。因此，类固醇激素分析是一种了解人体生理状态的重要方法。本发明使用液液萃取作为样品前处理方式，2-肼吡啶作为衍生化试剂，结合高分辨高灵敏度液相色谱-质谱联用检测仪器用于检测衍生化后的血浆中类固醇激素，一次分析可得15-25个类固醇激素的浓度信息，从而得到人体内类固醇激素水平信息，进而利用代谢通路了解人体内包括17α-羟化酶、21-羟化酶等酶的表达水平，并结合统计方法可以帮助临床诊断包括先天性肾上腺皮质增生症在内的疾病。
血浆含有的类固醇信息较为丰富可靠，适合于临床筛查。本发明具有检测范围覆盖面广(包括雄激素、雌激素、皮质激素、孕激素以及以结合形式存在的激素等)、灵敏度高、特异性好的特点。
发明效果：
本发明采用2-肼吡啶作为衍生化试剂对含有羰基的类固醇激素进行衍生化，衍生产物使用高分辨的质谱仪进行检测。与现有的文献报道的方法相比，具有以下几点显著的优势：
1、对类固醇激素的覆盖面广，能够对于以游离形式存在和以与葡萄糖醛酸结合或以硫酸酯形式存在的结合型类固醇激素进行同时检测；
2、衍生产物具有特征二级质谱，有利于定性；
3、衍生反应条件较为温和，反应时间短。
4、使用液液萃取进行样品前处理，操作简单。
附图说明
图1是本发明使用2-肼吡啶作为衍生化试剂衍生血浆中葡萄糖醛酸雄酮，硫酸脱氢表雄酮，醛固酮，睾酮，脱氢表雄酮经过液相色谱-质谱联用进行一次检测分析得到的的提取离子流色谱图(EIC)。
图2是本发明2-肼吡啶作为衍生化试剂衍生血浆中醛固酮经过液相色谱-质谱联用检测分析的二级质谱图，特征子离子m/z 95。图1与图2均为一次实验所得。
图3是本发明使用2-肼吡啶作为衍生化试剂衍生标准样品。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例
取-80℃冻融的血浆150μL，进行液液萃取。液液萃取的具体流程为：1)向离心管中加入150μL血浆和200μL乙腈与200μL乙酸乙酯混合溶液；2)涡旋3分钟；3)将离心管置于低温高速离心机中14000转/分钟，温度4℃离心；4)取上层萃取相液体于新的1.5mL离心管中。得到的萃取相液体进行冷冻干燥，然后在冷冻干燥的离心管内，加入60μL 0.2mg/mL的2-肼吡啶和体积分数为5％甲酸的甲醇溶液，涡旋混匀，盖上瓶盖密封，使用水浴60℃加热30min进行衍生化，然后45℃蒸干甲醇溶液。残渣用50μL体积分数为20％乙腈/水溶液涡旋溶解，涡旋时间为1分钟。使用液相色谱-质谱联用分析，进样体积为2μL。
由表1及图1-3可以看出，以检测葡萄糖醛酸雄酮为例，使用2-肼吡啶作为衍生化试剂质谱响应以峰面积计可增强约3000倍。
本发明使用液液萃取方式对血浆进行样品前处理，萃取得到的类固醇激素使用2-肼吡啶作为衍生化试剂与化学结构中含有羰基的类固醇激素进行席夫碱反应，反应产物使用液相色谱-质谱联用分析，由于衍生化反应产物在电喷雾电离源中的离子化效率较原类固醇激素更高，从而实现类固醇激素的高灵敏度检测。本发明前处理方式简单，不仅可以检测以游离形式存在的类固醇激素，还可以对以与葡萄糖醛酸结合或以硫酸酯形式存在的结合型类固醇激素进行检测，并且衍生产物具有特征二级质谱，有利于定性。该方法具有灵敏度高、特异性的好的优点。
表1衍生化后类固醇激素质谱信号响应强度提升倍数(以葡萄糖醛酸雄酮为例)
Figure BDA0001884721040000061

Claims (8)

1.一种基于化学衍生的血浆中类固醇激素的检测方法，其特征在于：使用2-肼吡啶作为衍生化试剂进行衍生化，液相色谱-质谱联用检测衍生化后的类固醇激素，包括以下步骤：
第一步，取血浆，保存；
第二步，取第一步的血浆，采用液液萃取方式提取其中的类固醇激素；
第三步，液液萃取得到的萃取相进行冷冻干燥；
第四步，在冷冻干燥后的离心管内，加入2-肼吡啶和甲酸的甲醇溶液，涡旋混匀，盖上瓶盖密封，使用水浴加热进行衍生化，然后蒸干甲醇；
第五步，加溶解液涡旋溶解残渣，等待液相色谱-质谱联用进行检测；
第六步，进行液相色谱-质谱联用检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，第一步中所述血浆的保存温度为-80℃。
3.根据权利要求1或2所述一种基于化学衍生的血浆中类固醇激素的检测方法，其特征在于，第二步中，以所用血浆体积为150μL为基准，取150μL血浆于离心管中，向其中加入200μL乙腈与200μL乙酸乙酯混合溶液，涡旋3-4分钟，置于低温高速离心机中13000-14000转/分钟，温度4-5℃离心，取上层液体于另一离心管中，作为萃取相备用。
4.根据权利要求1所述一种基于化学衍生的血浆中类固醇激素的检测方法，其特征在于，第四步中，所用2-肼吡啶的甲醇溶液浓度为0.2-0.3mg/mL，甲酸的甲醇溶液的体积分数为5-5.5％；以所用血浆体积为150μL为基准，加入的溶液体积为50-60μL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，第四步中，水浴加热进行衍生化反应的温度为55-65℃，加热时间为30-40分钟，蒸干甲醇的温度为40-50℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，以所用血浆体积为150μL为基准，第五步中，溶解残渣所用溶液为50-60μL体积浓度19-20％乙腈的水溶液，涡旋时间为1-2分钟。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，第五步中，液相色谱-质谱联用进样分析的体积为2-3μL。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，第三步中，冷冻干燥时间为2-3小时。
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