CN103389351B

CN103389351B - 液相-串联质谱同时检测9种端基炔类激素的方法

Info

Publication number: CN103389351B
Application number: CN201310315109.XA
Authority: CN
Inventors: 郭宾; 朱卫桃; 曾乐; 叶美玲; 汤领; 陈波
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: CN103389351A

Abstract

本发明公开了一种液相-串联质谱同时检测9种端基炔类激素的方法，包括通过点击反应使待测样品在电喷雾电离下能带上电荷，然后使用液相-串联质谱进行检测从而能检测到衍生好的待测物。本发明方法克服了炔类物质在电喷雾离子源中电离效率低的缺点，适用于复杂生物基质样品的批量检测；该方法所用试剂少，且催化试剂便宜，易实现。

Description

液相-串联质谱同时检测9种端基炔类激素的方法

技术领域

本发明涉及一种烃类激素的检测方法，具体涉及一种利用液相-串联质谱检测烃类激素的方法。

背景技术

在已有的方法检测当中，也有用液相-串联质谱法对炔雌醇、炔诺酮等部分物质进行检测，但尚未见有同时测定这9种物质的方法。由于点击反应方法(点击化学(click chemistry)，还可以称为链接化学，是由Scripps研究所的诺贝尔化学家获得者Sharples^[1]首次提出的快速、可靠而又选择性高的化学合成新方法。该方法以可靠、高效、高选择性地通过C-X-C杂原子连接合成一系列的化合物。)的适用性，本发明用于解决复杂生物基质中的低含量端基炔类激素的检测，本发明主要选取炔雌醇(Ethinylestradiol)、炔诺酮(Norethisterone)、左炔诺孕酮(Levonorgestrel)、醋酸炔诺酮(Norethisterone acetate)、达那唑(Danazol)、双醋炔诺醇(EtnynodiolDiacetate)、尼尔雌醇(Nilestriol)、炔雌醚(Quinestrol)、庚酸炔诺酮(Norethisterone Enanthate)这9种弱极性端基炔类激素在复杂生物基质中的定量检测。建立了样品中炔雌醇等9种物质进行同时测定的液相色谱-质谱法，考察了这9种物质在血清和尿液中的分离影响，并进行了定量方法的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时检测上述九中激素的方法，本发明方法解决了低含量端基炔类激素的检测问题，特别是复杂生物基质中低含量端基烃类激素的检测问题，并且快速、准确、高效。

本发明提供一种新型的衍生样品前处理方法，克服了炔类物质在电喷雾离子源中电离效率低的缺点，适用于复杂生物基质样品的批量检测。该方法所用试剂少，且催化试剂便宜，易实现。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种液相-串联质谱同时检测多种端基炔类激素的方法，通过点击反应使其在电喷雾电离下能带上电荷，从而能检测到衍生好的待测物；其中所述点击反应包括以下具体步骤：

1、生物基质血清中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或血清，混标，DMSO、内标炔诺酮-d6、H₂O、(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐、CuSO₄溶液、NaAsc溶液。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入EtOAc，涡旋1min，然后离心，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

2、生物基质尿液中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或尿液，混标，DMSO、内标炔诺酮-d6、H₂O、(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐、CuSO₄溶液、NaAsc溶液。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入EtOAc，涡旋1min，然后离心，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

较佳的，步骤1中每200μL纯水或血清加入混标50μL、MMSO150μL、50ng/mL的内标炔诺酮-d610μL、H₂O50μL、500μg/mL(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐20μL、20mM CuSO₄溶液10μL和5mM NaAsc溶液10μL，反应后加入的所述EtOAc为1ml，用100μL CH₃OH复溶。

较佳的，所述混标为变量。

较佳的，步骤1中，所述离心的具体条件是：10000g，5min。

较佳的，步骤2中，CuSO₄溶液为25mM，10μL；NaAsc溶液为40mM，10μL；其余同步骤1。

进一步的，本发明采用以下技术方案：

一种液相-串联质谱同时检测多种端基炔类激素的方法，包括以下具体步骤：

1、标准溶液的配制

分别准确称取表1中各底物标准品于容量瓶中，用CH₃OH超声溶解，定容，制得500μg/mL各单标储备液；各储备液置于4℃冰箱内保存，使用时用CH₃OH稀释。

同位素标准溶液的配制：准确称取炔诺酮-d6于10容量瓶中，用CH₃OH溶解，定容，制得1mg/mL同位素标准液；使用时用CH₃OH稀释。

CuSO₄溶液和NaAsc溶液均用二次蒸馏水配制成所需浓度，且现配现用。

2、液相色谱条件

Eclipse XDB-C18色谱柱，150mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相为乙腈(A)-5mM乙酸铵水溶液(B)、乙腈(A)-0.1％(体积比)氨水(B)、乙腈(A)-水(B)、乙腈(A)-0.1％(体积比)乙酸(B)或乙腈(A)-0.1％(体积比)甲酸(B)，A∶B的体积比为40∶60；梯度洗脱程序：0～6.0min，60％(体积比)A；6.01～10.0min，60％～100％A；10.01～13.0min，80％A；13.01～16.0min，80％～0％A。流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；分析时间：18min。

3、质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，负离子电离模式；离子源温度：550℃；气帘气(CUR)：20Psi；雾化气(GS1)：60Psi；辅助加热气(GS2)：65Psi；碰撞气(CAD)：10Psi；离子喷雾电压(IS)：-4500V。检测方式为多离子反应监测模式(MRM)，定性离子对、定量离子对、碰撞能量、去簇电压和碰撞室出口电压见表2所示。

表1标准品信息

表2端基炔类药物衍生产物的质谱参数

^*指定量离子

4、样品前处理

于pp管中按顺序加入下列体积份数的反应物：纯水或样品200份，混标(变量)50份，DMSO150份、50ng/mL的内标炔诺酮-d610份、H₂O50份、500μg/mL的(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐20份、20-25mM的CuSO₄溶液10份、5-40mM的NaAsc溶液10份；涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h，取出后加入1000份EtOAc，涡旋1min，然后离心，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用100份EtOAc复溶，进样。其中每个反应平行做两个样，

较佳的，所述步骤2中，流动相为乙腈(A)-5mM乙酸铵水溶液(B)。

较佳的，所述步骤4中，离心条件为10000g，5min。

本发明的优点是：本发明的方法操作过程简单，原料便宜易得，且用量少，对前处理设备要求低。该点击方法能对炔类物质一锅法反应，无需单个制备。对电喷雾离子化效率低的端基炔类物质经过点击反应，生成质荷比较大的产物，不仅提高了待测物在电喷雾质谱中的离子化效率，而且有效降低基质中杂质离子干扰，同时具有产率高、副产物少、产物易于分离，反应条件简单等优点，便于对反应产物进行定量分析。

附图说明

图1血清中硫酸铜浓度对衍生产物的影响，

图2纯标样中硫酸铜浓度对衍生产物的影响，

图3血清中抗坏血酸钠浓度对衍生产物的影响，

图4纯标样中抗坏血酸钠浓度对衍生产物的影响，

图5尿液中硫酸铜浓度对衍生产物的影响，

图6纯标样中硫酸铜浓度对衍生产物的影响，

图7尿液中抗坏血酸钠浓度对衍生产物的影响，

图8纯标中抗坏血酸钠浓度对衍生产物的影响，

图9不同提取溶剂对回收率的影响。

具体实施方式

实验仪器：

API4000Q Trap质谱仪，配有ESI离子源(美国应用生物系统公司)；1100型高效液相色谱仪(美国Agilent仪器有限公司)；Agilent Eclipse C18(150mm×4.6mm，5μm，Agilent公司)；CP2250分析天平(德国Sartorius公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；TG16G台式高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；SHZ-82B水浴恒温振荡器(金坛市文华科教实验仪器厂)；NCY-40型浓缩氮吹仪(烟台富耐立仪器科技有限公司)；KQ3200E型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

实验试剂：

本章节中用到的标准品部分见表2-1，其余标准品和试剂在表3中；空白血清购自湖南湘雅医院；分析纯氯化钠(NaCl)，乙酸铵购自天津市大茂化学试剂厂；分析纯亚铁氰化钾、乙酸锌、钨酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；分析纯石油醚、甲苯、丙酮购自天津市富宇精细化工有限公司。

表2-1主要药品和试剂

Tab.2-1Main drugs and reagents

标准溶液的配制：

分别准确称取表3中各底物标准品5.0mg于10mL容量瓶中，用适量CH₃OH超声溶解，定容，制得500μg/mL各单标储备液。各储备液置于4℃冰箱内保存，使用时用CH₃OH稀释。

同位素标准溶液的配制：准确称取10mg炔诺酮-d6于10mL容量瓶中，用适量CH₃OH溶解，定容。使用时用CH₃OH稀释。

液相色谱条件与质谱条件

液相色谱条件：

Eclipse XDB-C18色谱柱，150mm×4.6mm(i.d.)，5μm；流动相为乙腈(A)-5mM乙酸铵水溶液(B)(40∶60，V/V)；梯度洗脱程序：0～6.0min，60％A；6.01～10.0min，60％～100％A；10.01～13.0min，80％A；13.01～16.0min，80％～0％A。流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；分析时间：18min。

质谱条件：

电喷雾离子源(ESI)，负离子电离模式；离子源温度：550℃；气帘气(CUR)：20Psi；雾化气(GS1)：60Psi；辅助加热气(GS2)：65Psi；碰撞气(CAD)：10Psi；离子喷雾电压(IS)：-4500V。检测方式为多离子反应监测模式(MRM)，定性离子对、定量离子对、碰撞能量、去簇电压和碰撞室出口电压见表2示。

样品前处理

生物基质血清中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或血清(200μL)，混标(变量，50μL)，DMSO(150μL)、内标炔诺酮-d6(50ng/mL，10μL)、H₂O(50μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500μg/mL，20μL)、CuSO₄溶液(20mM，10μL)、NaAsc溶液(5mM，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL EtOAc，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用100μL EtOAc复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

生物基质尿液中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或尿液(200μL)，混标50μL(在空白基质中分别加入0.2、1、2、5、10、25ng/mL混合标准品溶液50μL，按样品前处理方法，反应完成后，用100μL CH3OH复溶，进样分析，所有分析物的质量浓度x(ng/mL)指血清或尿液中该物质的含量，和峰面积y之间均有良好的线性关系，具体的校准曲线参数见表3-5和表3-6)，DMSO(150μL)、内标炔诺酮-d6(50ng/mL，10μL)、H₂O(50μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500μg/mL，20μL)、CuSO₄溶液(25mM，10μL)、NaAsc溶液(40mM，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL EtOAc，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用100μL EtOAc复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

结果与讨论

色谱条件的优化及色谱图

对以下流动相：5mM乙酸铵-乙腈，0.1％氨水-乙腈，水-乙腈，0.1％乙酸-乙腈，以及0.1％甲酸-乙腈进行了考察，实验结果表明5mM乙酸铵-乙腈作流动相时灵敏度略高且分离度相对较好。

质谱条件的优化

本实验中的炔类物质在电喷雾(ESI)源下不电离或电离效率低，采用带有羧基的叠氮化合物是(s)-2叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐作为衍生剂，在电喷雾(ESI)源下能电离成[M-H]^-，从而检测到目标底物端基炔类激素的衍生产物。在确定各炔类物质衍生产物的母离子后，进行子离子扫描模式以及二级质谱分析，确定定量离子和定性离子。

对碰撞能量、去簇电压、碰撞室入口电压和碰撞室出口电压等参数进行优化(表3-3)，使炔类物质衍生产物的定量离子对和定性离子对达到最佳值。同时将高效液相色谱和三重四级杆质谱联机，对离子源温度、雾化气、碰撞气、喷雾电压、辅助气、气帘气等质谱条件进行优化，使标准溶液中炔类物质的衍生产物的丰度值达到最佳状态。

生物基质样品前处理优化

直接沉淀提取点击

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：血清或尿液(200μL)，混标(5μg/mL，50μL)，沉淀剂10％亚铁氰化钾-20％乙酸锌(100μL)或10％硫酸铜-10％钨酸钠(100μL)，混合均匀，然后离心(10000g，5min)，取其上清液于另一2mL pp管中，按以下顺序添加反应物：DMSO(150μL)、H₂O(100μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500μg/mL，20μL)、CuSO₄溶液(5mM，10μL)、NaAsc溶液(5mM，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL EtOAc，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用500μL CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

本方法的目的是将血清和尿液中的蛋白等基质沉淀后，再用点击方法。从LC-MS/MS的实验结果中看出生成的点击产物很少，几乎检测不到。可能的原因是端基炔类激素是不溶于水的，上清液中的水溶液含有端基炔类激素的量很少，或者是沉淀法将血清中添加的端基炔类激素和蛋白一起沉淀了。因此本方法不适合用来作生物基质中的点击反应。

直接提取吹干点击

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：血清或尿液(200μL)，混标(5μg/mL，50μL)，萃取剂(800μL)，萃取剂包括正丁醇、石油醚、甲苯、乙腈、乙酸乙酯、丙酮，混合均匀，然后离心(10000g，5min)，取其上清液于另一2mL pp管中，用N2吹干，然后按以下顺序添加反应物：DMSO(150μL)、H₂O(260μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500μg/mL，20μL)、CuSO₄溶液(5mM，10μL)、NaAsc溶液(5mM，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL EtOAc，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用500μL CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

本方法的目的是直接将血清中添加的端基炔类激素用有机溶剂提取出来，然后再用点击方法。从LC-MS/MS的实验结果中看出不同的有机溶剂对端基炔类激素的提取效果不同，但生成的点击产物也很少，有些几乎检测不到。可能的原因是经过多次提取，回收率明显降低，甲苯、乙腈等有机溶剂也很难吹干，因此本方法不适合用来作生物基质中的点击反应。

改变点击反应中催化剂的浓度：

(1)血清中催化剂硫酸铜浓度的变化对点击反应的影响

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：血清(200μL)，混标(5μg/mL，50μL)，DMSO(150μL)、H₂O(60μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500ppm，20μL)、CuSO₄溶液(变量，10μL)、NaAsc溶液(5mM，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL EtOAc，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用500μL CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

(2)血清中催化剂抗坏血酸钠浓度的变化对点击反应的影响

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：血清(200μL)，混标(5μg/mL，50μL)，DMSO(150μL)、H₂O(60μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500μg/mL，20μL)、CuSO₄溶液(20mM，10μL)、NaAsc溶液(变量，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL乙酸乙酯，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用500μL CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

(3)尿液中催化剂抗坏血酸钠浓度的变化对点击反应的影响

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：血清(200μL)，混标(5μg/mL，50μL)，DMSO(150μL)、H₂O(60μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500μg/mL，20μL)、CuSO₄溶液(饱和，10μL)、NaAsc溶液(变量，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL EtOAc，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用500μL CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

结果表明血清和纯标样中硫酸铜浓度的变化对反应产物的影响如图1和2所示，硫酸铜在反应体系中的浓度为20mM时，反应产物的峰面积达到最大。血清和纯标样中抗坏血酸钠浓度的变化对反应产物的影响如图3和4所示，抗坏血酸钠在反应体系中的浓度为5mM时，反应产物的峰面积达到最大。

(4)尿液中催化剂硫酸铜浓度的变化对点击反应的影响

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：血清(200μL)，混标(5μg/mL，50μL)，DMSO(150μL)、H₂O(60μL)、(S)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐(500μg/mL，20μL)、CuSO4溶液(变量，10μL)、NaAsc溶液(饱和，10μL)。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入1mL EtOAc，涡旋1min，然后离心(10000g，5min)，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用500μL CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

结果表明尿液和纯标样中硫酸铜浓度的变化对反应产物的影响如图5和6所示，硫酸铜在反应体系中的浓度为饱和时，反应产物的峰面积达到最大。尿液和纯标样中抗坏血酸钠浓度的变化对反应产物的影响如图7和8所示，抗坏血酸钠在反应体系中的浓度为40mM时，反应产物的峰面积达到最大。

综合考虑，血清中硫酸铜浓度为20mM，抗坏血酸钠浓度为5mM。尿液中硫酸铜浓度为饱和，抗坏血酸钠浓度为40mM。

3.3.5提取溶剂的选择

按样品前处理方法，反应完成后加入不同萃取剂：正己烷-乙酸乙酯(1∶1)(A)、环己烷-乙酸乙酯(1∶1)(B)、二氯甲烷(C)、石油醚(D)、乙酸乙酯(E)以及乙腈(F)对产物的提取效率。其中乙腈提取是用氯化钠诱导相分离。回收率＝样品加标峰面积/纯标样峰面积^*100％。乙腈和乙酸乙酯的提取回收率都还可以，但乙腈的基质效应比较高，因此选择乙酸乙酯为提取溶剂(如图9)。

基质效应影响

本研究采用提取后添加法^[98]来评价不同来源的复杂生物样品基质的基质效应。该方法是考察相同浓度的峰面积的比值：A代表纯标样经过点击方法提取，B代表不同的生物样品点击提取后添加A，则基质效应(ME)＝B/A*100％。具体步骤是由纯水代表不同生物基质按样品处理方法5ng/mL的混合标准溶液50μL，得到由甲醇复溶的衍生产物，进样分析，做三个平行样。同时用不同生物基质按样品处理方法，提取后加入由纯水5ng/mL的混合标准溶液50μL制得的衍生产物甲醇溶液，进样分析，每个浓度做三个平行样。用后者与前者的峰面积之比来评价基质效应，所得结果见表3-4。

表3-4生物样品血清和尿液中基质效应考察

a)M(％)指响应信号的百分比。

结果表明，血清中左炔诺孕酮有抑制影响，炔诺酮和双醋炔诺酮在血清和尿液测定中响应信号增强。因此，需要采用空白基质中点击反应来制定标准曲线，该体系采用基质加标的方法来消除基质效应的影响以及对方法学的考察。

线性关系及检出限

在空白基质中分别加入0.2、1、2、5、10、25ng/mL混合标准品溶液50μL，按样品前处理方法，反应完成后，用100μL复溶，进样分析，所有分析物的质量浓度x(ng/mL)指血清或尿液中该物质的含量，和峰面积y之间均有良好的线性关系，具体的校准曲线参数见表3-5。

表3-5血清中标准曲线的线性参数

方法的回收率和精密度

采用在空白样品中添加标准溶液的方法对血清和尿液进行添加回收率实验，3个血清或尿液浓度添加水平分别为低(1ng/mL)、中(5ng/mL)、高(25ng/mL)各50μL，按“样品处理项”规定处理样品进样，每个浓度水平进行5次重复实验，平均加标回收率和精密度数据见表3-7。

表3-7端基炔类物质的回收率和精密度

小结

本文建立了HPLC-MS/MS法测定9种端基炔类激素。通过前处理阶段引入点击反应，使得目标物的电离效率极大提高，而且有效降低基质中杂质离子干扰。通过优化色谱和质谱条件，流动相中加入乙酸铵试剂优化了端基炔类激素在C18色谱柱上的保留行为，该方法简单、专属性强、灵敏度高在低浓度生物基质中具有良好的线性和精密度。

Claims

1.一种液相-串联质谱同时检测多种端基炔类激素的前处理方法，包括：通过点击反应使待测样品在电喷雾电离下能带上电荷，从而能检测到衍生好的待测物；其中所述点击反应包括以下具体步骤：

1)、生物基质血清中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或血清，混标，DMSO、内标炔诺酮-d6、H₂O、(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐、CuSO₄溶液、NaAsc溶液，涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h，取出后加入EtOAc，涡旋1min，然后离心，取上层清液，置于氮吹仪中吹干，用CH₃OH复溶，进样，其中每个反应平行做两个样；或

2)、生物基质尿液中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或尿液，混标，DMSO、内标炔诺酮-d6、H₂O、(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐、CuSO₄溶液、NaAsc溶液，涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h，取出后加入EtOAc，涡旋1min，然后离心，取上层清液，置于氮吹仪中吹干，用CH₃OH复溶，进样，其中每个反应平行做两个样。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中每200μL纯水或血清加入混标50μL、DMSO 150μL、50ng/mL的内标炔诺酮-d6 10μL、H₂O 50μL、500μg/mL(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐20μL、20mM CuSO₄溶液10μL和5mM NaAsc溶液10μL，反应后加入的所述EtOAc为1ml，用100μL CH₃OH复溶。

3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中，所述离心的具体条件是：10000g，5min。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中每200μL纯水或血清加入混标50μL、DMSO 150μL、50ng/mL的内标炔诺酮-d6 10μL、H₂O 50μL、500μg/mL(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐20μL、CuSO₄溶液10μL和NaAsc溶液10μL，反应后加入的所述EtOAc为1ml，用100μL CH₃OH复溶，CuSO₄溶液为25mM，NaAsc溶液为40mM。