CN109900839A - 一种同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其为HPLC方法，以C18色谱柱实施分离，并利用紫外检测器进行定量分析，以0.02mol/L乙酸铵溶液‑乙腈为流动相进行洗脱，柱温为30~40℃，流速为0.8~1.2mL/min，检测波长为275~285nm，进样量为20μL，其中，所述流动相中，乙酸铵溶液与乙腈的体积比例为40:60。本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，既能够提高检验效率、节约资源，又能够为同类药物“一测多评”提供可操作的样板，经方法学验证，该方法准确可靠、重现性好、易于操作，对雌激素类药物的飞行检查提供了高效、便捷的技术支持，为完善我国药品监督抽验管理,提高我国药品监督抽验水平以及使用新兴药品监管技术提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种药物含量检测方法，更具体的涉及一种同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法。
背景技术
雌激素(estrogen)类药物是以18个碳原子雌烃为基本结构的类固醇激素，分子结构较为复杂。目前常用的测定雌激素类药物的方法有比色法和分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、放射免疫分析法(RIA)及酶联(ELISA)技术等。随着分析技术的提高和分析仪器的发展，其中，HPLC法被广泛使用，它除了具有样品用量少、灵敏度较高、快速等优点外还具有很好的分离效能，因此它除了应用于雌激素原料药的分析外，还广泛地应用于雌激素制剂的分离与分析。
尼尔雌醇（Nilethylenol），又名戊炔雌三醇，化学名为3-(环戊基氧基)-19-去甲-17-孕甾-1,3,5(10)-三烯-20-炔-16α,17α-二醇，属于雌三醇衍生物；已烯雌酚（Diethylstilbestrol），又名丙酸己烯雌酚，化学名为(E)-4,4'–(1,2-二乙基-1,2-亚乙烯基)双苯酚，是人工合成的非甾体雌激素类药物。两者均为雌激素类处方药。临床均用于雌激素缺乏引起的绝经期或更年期综合征，其主要不良反应有突破性出血等。
在药品现场抽验检查和飞行监察时，常常对同类药物集中抽验，需要在短时间内获得同类药物的准确有效检测数据。共同作为雌激素类药物，尼尔雌醇和己烯雌酚被同时抽验的情况时常发生，但现有技术缺少一种能够同时快速准确测定雌激素类药物尼尔雌醇和已烯雌酚含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够将尼尔雌醇和己烯雌酚含量同时、快速、准确检测出来的分析方法。
本发明所提供的技术方案为：
一种同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其为HPLC方法，以C18色谱柱实施分离，并利用紫外检测器进行定量分析，以0.02mol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相进行洗脱，柱温为30~40℃，流速为0.8~1.2mL/min，检测波长为275~285nm，进样量为20μL，其中，所述流动相中，乙酸铵溶液与乙腈的体积比例为40:60。
优选的，本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其中，所述检测波长为280nm。
优选的，本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其中，所述C18色谱柱直径为4.6mm，长度为250mm。
进一步优选的，本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其中，所述C18色谱柱粒径为5μm。
进一步优选的，本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其中，所述C18色谱柱为Waters Symmetry C18柱。
优选的，本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其中，所述柱温为35℃。
优选的，本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其中，所述流速为1.0 mL/min。
优选的，本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其中，采用外标法对照品法计算尼尔雌醇或己烯雌酚的含量。
本发明技术方案可取得的技术效果为：
1、为了解决药品现场抽验和飞行检查过程中需要集中快速检测多个厂家不同批次的尼尔雌醇和己烯雌酚的技术问题，本发明通过建立和优化分离方法，达到采用同一个HPLC系统条件，同时测定雌激素类药物尼尔雌醇和已烯雌酚的目的，该方法定量准确，分离良好，测定过程中无需因品种不同而更换色谱系统，大大提高了工作效率。
2、尼尔雌醇片现行质量标准收载于《中国药典》2015年版二部，采用的含量测定检测方法为紫外-可见分光光度法，该方法灵敏度较差、准确度不高；而己烯雌酚片的含量测定中样品前处理较为繁琐，且用到三氯甲烷等剧毒试剂，不利于环境保护。本方明在方法与上述单独测定尼尔雌醇和己烯雌酚的方法相比，在准确度、节省资源、保护环境、提高检测效率方面均具有一定的优势。
3、本发明在方法建立的过程中，最初想要采用已烯雌酚片的色谱条件，发现色谱峰出的过快，无法与溶剂峰等分开，并且该色谱条件无法准确检测到尼尔雌醇。通过发明人的大量试验摸索，最终采用乙酸盐来配比流动相，该色谱条件可以较好地分离尼尔雌醇和已烯雌酚，达到无需更换色谱系统，同时顺序完成两个品种多个样品测定的效果。
4、本发明技术方案对尼尔雌醇片和己烯雌酚片中的尼尔雌醇和己烯雌酚进行同时测定，结果显示，尼尔雌醇峰保留时间约为15 min，杂质峰保留时间分别约为4 min、5min，尼尔雌醇峰与杂质峰相互之间的分离度均大于2.0，理论板数按尼尔雌醇峰计不低于3000；已烯雌酚峰保留时间约为5 min，杂质峰保留时间约为3 min，已烯雌酚峰与杂质峰的分离度大于2.0，理论板数按已烯雌酚峰计不低于3000，在该色谱条件下，尼尔雌醇和已烯雌酚待测成分峰与溶剂及其他杂质峰分离良好；空白辅料对测定无影响。
5、本发明所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，既能够提高检验效率、节约资源，又能够为同类药物“一测多评”提供可操作的样板，经方法学验证，该方法准确可靠、重现性好、易于操作，对雌激素类药物的飞行检查提供了高效、便捷的技术支持，为完善我国药品监督抽验管理,提高我国药品监督抽验水平以及使用新兴药品监管技术提供技术支持。
附图说明
附图1尼尔雌醇系统适用性溶液HPLC图谱；
附图2己烯雌酚系统适用性溶液HPLC图谱；
附图3空白溶液HPLC图谱；
附图4尼尔雌醇对照品溶液HPLC图谱；
附图5己烯雌酚对照品溶液HPLC图谱；
附图6空白辅料溶液HPLC图谱；
其中，1.尼尔雌醇色谱峰，2.已烯雌酚色谱峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，在以下各实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂未标明来源和规格的均为市售分析纯或色谱纯。
实施例1 方法学验证
（1）试验用溶液的制备
对照品溶液的制备
精密称定尼尔雌醇对照品100mg，置于10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为10mg/ml的对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液1ml，置于100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得尼尔雌醇对照品溶液。
精密称定已烯雌酚对照品100mg，置于10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为10mg/ml的对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液1ml，置于100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得已烯雌酚对照品溶液。
供试品储备液的制备
取尼尔雌醇片20片，精密称定，研细，精密称取细粉（约相当于尼尔雌醇10mg）适量，置于10ml量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为尼尔雌醇供试品贮备液。
取己烯雌酚片品20片，精密称定，研细，精密称取细粉（约相当于已烯雌酚10mg）适量，置于10ml量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为尼尔雌醇供试品贮备液。
供试品溶液的制备
精密量取上述尼尔雌醇供试品贮备液1ml，置于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得尼尔雌醇供试品溶液。
精密量取上述已烯雌酚供试品贮备液1ml，置于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得已烯雌酚供试品溶液。
空白溶液的制备
按处方工艺分别制备了不含有尼尔雌醇、己烯雌酚的片剂样品，制备了空白溶液。
系统适用性溶液的制备
取尼尔雌醇对照品5mg，加30%过氧化氢溶液5ml，置70℃加热10分钟，即得尼尔雌醇系统适用性溶液；取已烯雌酚对照品5mg，加30%过氧化氢溶液5ml，置70℃加热10分钟，即得已烯雌酚系统适用性溶液。
（2）色谱条件
色谱柱： Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：0.02mol/l乙酸铵-乙腈（40:60，V/V）；检测波长：280nm；柱温：35℃；流速：1.0ml/min，进样量：20μl。
（3）系统适用性试验
取系统适用性溶液、空白辅料溶液适量，按上述色谱条件进样测定。结果表明，尼尔雌醇峰保留时间约为15min，杂质峰保留时间分别约为4min、5min，尼尔雌醇峰与杂质峰相互之间的分离度均大于2.0，理论板数按尼尔雌醇峰计不低于3000；已烯雌酚峰保留时间约为5min，杂质峰保留时间约为3min，已烯雌酚峰与杂质峰的分离度大于2.0，理论板数按已烯雌酚峰计不低于3000，在该色谱条件下，尼尔雌醇和已烯雌酚待测成分峰与溶剂及其他杂质峰分离良好；空白辅料对测定无影响，详见图1~图6。
（4）线性关系考察
精密量取尼尔雌醇对照品贮备溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ml，置于100 ml量瓶中，按（2）中色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，mg/ml）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得尼尔雌醇回归方程为y=9.5917×108x＋2.4822×106（r=0.9999）。结果表明，尼尔雌醇测质量浓度线性范围为0.01～0.5 mg/ml；精密量取已烯雌酚对照品贮备液溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ml，置于100ml量瓶中，按（2）中色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，mg/ml）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得已烯雌酚的回归方程为y=3.1204×109x＋7.6897×106（r=0.9999）。结果表明，已烯雌酚检测质量浓度线性范围为0.01～0.5mg/ml。
（5）精密度试验
分别精密量取尼尔雌醇对照品溶液和已烯雌酚对照品溶液适量，按（2）中色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，尼尔雌醇峰面积的RSD=0.19%（n=6）；已烯雌酚峰面积的RSD=0.22%（n=6），表明仪器精密度良好。
（6）稳定性试验
分别精密量取尼尔雌醇供试品溶液和已烯雌酚供试品溶液适量，分别于室温下放置0、1、2、4、6、8、12 h时按(2)中色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，尼尔雌醇峰面积的RSD=0.53%（n=6）；已烯雌酚峰面积的RSD=0.59%（n=6），表明尼尔雌醇供试品溶液和已烯雌酚供试品溶液在室温下放置12h内稳定性均良好。
（7）重复性试验
分别取同一批尼尔雌醇和己烯雌酚样品适量，共6份，制备供试品溶液，再按（2）中色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量。结果，尼尔雌醇的平均含量为98.66%，RSD=0.17%（n=6）；已烯雌酚的平均含量为98.57%，RSD=0.11%（n=6），均表明本方法重复性良好。
（8）加样回收率试验
分别取相当于尼尔雌醇和己烯雌酚各为100mg的已知含量的尼尔雌醇片和己烯雌酚片样品，精密称定，共9份，各置于10 ml量瓶中，分别加入低、中、高质量的尼尔雌醇、己烯雌酚对照品，按制备供试品溶液，再按（2）的色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1和表2。
表1 尼尔雌醇加样回收率试验结果( n= 9)
。
表2 已烯雌酚加样回收率试验结果( n= 9)
。
实施例2 样品含量测定
各取3批尼尔雌醇片和已烯雌酚片样品适量，分别制备供试品溶液，再实施例1中（2）中色谱条件进样测定，记录峰面积并分别计算尼尔雌醇和已烯雌酚的含量。结果尼尔雌醇片样品（批号：170103、170104、170105）中尼尔雌醇的平均含量为98.73%，RSD为0.16%；已烯雌酚片样品（批号：170201、170202、170203）中已烯雌酚的平均含量为98.62%，RSD为0.18%。详见表3。
表3 尼尔雌醇片和已烯雌酚片含量测定结果 ( n= 3)
从本实施例可以看出，本发明方法可以用于在同一系统下检测多个己烯雌酚片和尼尔雌醇片样品，无需转换色谱系统条件。该方法条件下尼尔雌醇和己烯雌酚主峰与杂质、溶剂峰分离良好，方法定量准确，解决了现有方法定量不准，操作繁琐等缺点，还无需因品种转换色谱条件，大大节省了工作时间，提高了抽样检验工作效率。
Claims (8)
1.一种同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：其为HPLC方法，以C18色谱柱实施分离，并利用紫外检测器进行定量分析，以0.02mol/L乙酸铵溶液-乙腈为流动相进行洗脱，柱温为30~40℃，流速为0.8~1.2mL/min，检测波长为275~285nm，进样量为20μL，其中，所述流动相中，乙酸铵溶液与乙腈的体积比例为40:60。
2.如权利要求1所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：所述检测波长为280nm。
3.如权利要求1所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：所述C18色谱柱直径为4.6mm，长度为250mm。
4.如权利要求3所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：所述C18色谱柱粒径为5μm。
5.如权利要求4所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：所述C18色谱柱为Waters Symmetry C18柱。
6.如权利要求1所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：所述柱温为35℃。
7.如权利要求1所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：所述流速为1.0 mL/min。
8.如权利要求1~7中任一项所述的同时测定尼尔雌醇和己烯雌酚含量的方法，其特征在于：采用外标法对照品法计算尼尔雌醇或己烯雌酚的含量。
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