CN104965037A - 一种百两金皂苷b原料或其制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百两金皂苷B原料或其制剂的检测方法，该方法采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定活性成分百两金皂苷B的含量，从而使百两金皂苷B原料及其制剂的内在质量能够得到有效控制。该方法线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率、耐受性等均符合定量分析要求。利用该方法首次测定了百两金皂苷B原料及其制剂的含量，为百两金皂苷B的新药开发研究提供了新的检测方法。

Description

一种百两金皂苷B原料或其制剂的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及药品的质量控制方法，具体是指百两金皂苷B原料或其制剂的分析检测方法。

背景技术

百两金皂苷B的化学名称为西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，是存在于紫金牛科紫金牛属植物百两金、朱砂根、红毛走马胎等多种植物中的有效成分，具有细胞毒活性和抗肿瘤、抗炎等药理作用。在深入研究开发该活性成分的过程中，需要将其提取制备成含量大于90％的中药1类新药原料，并进而制备成制剂。目前未见百两金皂苷B原料药及其制剂的定量分析方法，为深入探讨本品的成药性及药理活性，我们从该药材中提取分离得到百两金皂苷B单体，并按照对照品研究技术指导原则进行了纯化及结构鉴定。本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)建立起百两金皂苷B原料或其制剂的定量分析方法，为进一步的深入研究和新药开发提供新的分析手段和参考数据。

发明内容

本发明提供一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定百两金皂苷B原料或其制剂的定量分析方法，其特征在于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为30∶70～40∶60乙腈-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000；其主要步骤包括色谱系统适用性试验、对照品和样品溶液制备、进样分析测定并计算含量。

根据前述的检测方法，其中，所述百两金皂苷B原料采用如下方法制备：将百两金粉碎，用50％～80％的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，分别用水和30％乙醇冲洗除杂，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析，以体积比为70∶30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，干燥、即得；其制剂为百两金皂苷B原料用常规工艺制备而成的胶囊或片剂。

根据前述的检测方法，其中，所述百两金皂苷B对照品是采用制备型高效液相色谱仪对百两金皂苷B原料进行分离纯化而得，其制备的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶40～70∶30的甲醇-水为流动相；在205nm波长下监测；其供试品采用制备液相使用的流动相配制成饱和溶液，取上清液进样，收集目标峰流出液，浓缩、干燥、检查纯度，即得。

根据前述的检测方法，其中，所述百两金皂苷B原料或其制剂的供试品溶液是用50％～70％的甲醇或乙醇水溶液作为溶剂提取。

根据前述的检测方法，其中，所述采用HPLC-ELSD法测定百两金皂苷B原料或其制剂含量的方法包括如下步骤和优化条件：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(35∶65)为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于4000。

对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。

供试品溶液制备取百两金皂苷B原料30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入50％乙醇适量，超声处理使溶解，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤或离心，取续滤液或上清液，即得。

测定方法分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL；供试品溶液10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

本发明所提供的百两金皂苷B原料或其制剂中百两金皂苷B含量的HPLC-ELSD检测方法具有如下优点：

(1)本发明提供的方法首次引入了百两金皂苷B原料或其制剂中有效成分百两金皂苷B的含量测定，从而使百两金皂苷B的质量控制方法更加科学合理；

(2)本发明所提供的的百两金皂苷B原料或其制剂的分析方法首次将HPLC-ELSD法用于百两金皂苷B原料或其制剂中活性成分百两金皂苷B的含量测定，具有良好的线性关系、精密度、重复性、稳定性、耐受性和回收率，测定简便快速。

附图说明

图1为百两金皂苷B对照品溶液的HPLC-ELSD色谱图；

图2为百两金皂苷B原料的HPLC-ELSD色谱图；

图3为百两金皂苷B胶囊的HPLC-ELSD色谱图。

具体实施方式

1仪器、试药与样品

高效液相色谱仪(美国安捷伦1100系列)，包括在线真空脱气机(G1322A)，四元梯度泵(G1311A)，自动进样器(G1313A)，柱温箱(G1316A)，DAD检测器(G1314A)，Chemstation色谱工作站；AlltechELSD 2000型蒸发光散射检测器；制备型高效液相色谱仪(美国贝克曼库尔特BECHMAN 125P型)，包含SYSTEM GOLD 125P Solvent Module和166p Detector等；Milli-Q超纯水器(美国Milipore公司)；Microfuge 18台式离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；KQ-500DE超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司，功率300W，频率40kHz)；BP-210D型电子分析天平(德国赛多利斯，十万分之一)；过滤装置(Autoscience)及微孔滤膜(0.45μm)。色谱柱：Waters Symmetry C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；Phenomenex Gemini C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；Alltech AltimmaC₁₈(250mm×4.5mm，5μm)；制备色谱柱：BECHMANUL TRAPREP C18(21.1mm×150mm，10μm)；保护拄：phenomnex C₁₈。

百两金皂苷B自制(熔点：263-265℃，薄层色谱多个展开及显色系统均显示一个斑点，采用HPLC-ELSD峰面积归一化法计算其质量浓度大于98％，符合定量分析用中药化学对照品纯度的质量要求)；乙腈为色谱纯，水为高纯水；其余试剂均为分析纯。百两金药材购买于四川省某公司，经本发明人鉴定为百两金(Ardisia crispa(Thunb.)DC.A.)。

2百两金皂苷B对照品制备

将百两金粉碎，用50％～80％的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，用水和30％乙醇冲洗除杂，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析，以体积比为70∶30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，用相应流动相溶解结晶物使成饱和溶液，上清液注入制备型高效液相色谱仪分离纯化；色谱条件：C₁₈柱；流动相：体积比为60∶40～68∶32的甲醇-水；检测波长：205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，即得。

将制得的百两金皂苷B对照品采用高分辨质谱(HR-FAB-MS)给出精确分子量：m/z1097.5432[M+Na]，对应分子式为：C₅₃H₈₆O₂₂Na(分子量计算值为：1097.5509)；其碳、氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为西克拉敏A 3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

本发明制备的虎舌红素B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定，其质量分数均大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。

3方法优化

3.1蒸发光散射检测器参数优化

其主要参数有漂移管温度和气体流速，以5℃为递增值，考察漂移管温度在70℃～120℃条件下同一供试品溶液百两金皂苷B的峰高和噪声情况，结果显示漂移管温度为95℃时，其信噪比较佳。另一方面，以步长0.2L·min^-1，考察了气体流速从1.2～2.4L·min^-1时对响应值和噪声的影响，结果发现气体流速降低，其响应值增高，但噪声也随之增加，其信噪比在2.0L·min^-1时较佳。

3.2提取方法与溶剂优化

供试品溶液提取溶剂考察了水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、乙醇等对百两金皂苷B原料的提取效果，结果以50％和70％的甲醇或乙醇较佳，从成本和安全考虑，确定为50％乙醇提取。

3.3提取时间优化

供试品溶液提取时间考察了5min、10min、15min、20min的提取溶解效果，结果差异不大。最终确定的前处理方法是以50％乙醇为溶剂，超声处理10分钟。

4测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(35∶65)为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于4000。

对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。

供试品溶液制备取百两金皂苷B原料30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入50％乙醇适量，超声处理使溶解，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤或离心，取续滤液或上清液，即得。

测定方法分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL；供试品溶液10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

5方法学验证

5.1线性范围

分别精密吸取白两金皂苷B对照品溶液(508.8μg·mL^-1)2.5、5、7.5、10、12.5μL注入液相色谱仪，测定峰面积值，以进样量的对数(X)为横坐标，峰面积对数(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程：Y＝1.7603X+5.6231，r＝0.9995。结果显示，百两金皂苷B的进样量在1.272μg～6.360μg范围内呈良好的线性关系。

5.2仪器精密度试验

取百两金皂苷B对照品溶液，在上述色谱条件下进样10μL测定峰面积，重复进样6次，测得平均峰面积的RSD为0.6％，表明仪器精密度良好。

5.3稳定性试验

取百两金皂苷B原料供试品溶液和对照品溶液，分别在0、1、2、4、6、8h进样10μL，测定百两金皂苷B的峰面积，测得6个时间点百两金皂苷B原料供试品溶液峰面积的RSD为1.42％；百两金皂苷B对照品溶液峰面积的RSD为1.49％；表明两种溶液在8h内稳定。

5.4重复性试验

取同一批百两金皂苷B原料，平行操作6份，按照4项下的测定方法制备供试品溶液并测定，用外标两点法对数方程计算含量，结果含量分别为93.82％、93.47％、93.56％、94.79％、91.9％、92.01％，其平均含量为93.26％，RSD为1.19％，表明重复性良好。

5.5加样回收率试验

减半量称取已知含量的百两金皂苷B原料，置100mL量瓶中，平行操作6份，分别以样品百两金皂苷B质量的1∶1比例精密加入对照品溶液(1.421mg·mL^-1)10mL，补充适量50％乙醇，超声处理10分钟，放冷，用50％乙醇定容至刻度，摇匀，离心，取上清液测定，计算回收率，结果见表1。

表1加样回收试验结果(n＝6)

5.6耐用性考察

耐用性试验考察了三根不同品牌和长度的C₁₈柱对样品的测定，均获得满意的效果；其柱温在25℃～35℃范围变化，测定结果均良好；流动相中乙腈∶水的比例变化在40∶60～30∶70范围内调整，除保留时间变化外，其余不影响测定结果，说明本方法耐用性良好。

6.百两金皂苷B原料测定

6.1测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(35∶65)为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000。

对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。

供试品溶液制备取百两金皂苷B原料30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入50％乙醇适量，超声处理使溶解，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

测定方法分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL；供试品溶液10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

本品按干燥品计算，含百两金皂苷B(C₅₃H₈₇O₂₂)不得少于90％。

6.2测定结果

百两金皂苷B原料的测定结果见表2。

表2百两金皂苷B原料中百两金皂苷B的测定结果(n＝3)

7.百两金皂苷B制剂测定

7.1.样品信息

百两金皂苷B胶囊及片剂样品为研制过程中的制剂处方筛选样品，辅料包括玉米淀粉、微晶纤维素、乳糖、硬脂酸镁等常规辅料。规格为每粒或每片含百两金皂苷B 100mg。

7.2.测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(35∶65)为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000。

对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。

供试品溶液制备

1)百两金皂苷B胶囊取装量差异项下的内容物，混合均匀，取适量(约相当于百两金皂苷B 30mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50％乙醇适量，超声处理使溶解，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2)百两金皂苷B片剂取重量差异项下的片剂，研细，取适量(约相当于百两金皂苷B30mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入50％乙醇适量，超声处理使溶解，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

测定方法分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL；供试品溶液10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

本品含百两金皂苷B(C₅₃H₈₇O₂₂)应为标示量的90.0％～110.0％。

7.3测定结果

样品测定结果见表3。

表3百两金皂苷B制剂中百两金皂苷B的测定结果(n＝3)

Claims (5)

1.一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定百两金皂苷B原料或其制剂的定量分析方法，其特征在于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为30∶70～40∶60的乙腈-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于4000；其主要步骤包括色谱系统适用性试验、对照品和样品溶液制备、进样分析测定并计算含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述百两金皂苷B原料采用如下方法制备：将百两金粉碎，用50％～80％的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，分别用水和30％乙醇冲洗除杂，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析，以体积比为70∶30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，干燥、即得；其制剂为采用常规方法制备的胶囊或片剂。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述百两金皂苷B对照品是采用制备型高效液相色谱仪对百两金皂苷B原料进行分离纯化而得，其制备的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶40～70∶30的甲醇-水为流动相；在205nm波长下监测；其供试品采用制备液相使用的流动相配制成饱和溶液，取上清液进样，收集目标峰流出液，浓缩、干燥、检查纯度，即得。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述百两金皂苷B原料或其制剂的供试品溶液是用50％～70％的甲醇或乙醇水溶液作为溶剂提取。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述采用HPLC-ELSD法测定百两金皂苷B原料或其制剂含量的方法包括如下步骤和优化条件：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(35∶65)为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于4000。

对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。

供试品溶液制备取百两金皂苷B原料30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入50％乙醇适量，超声处理使溶解，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤或离心，取续滤液或上清液，即得。

测定方法分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL；供试品溶液10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。