CN103513000A - 睡莲花的鉴别和含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了睡莲花的一种鉴别和含量测定方法，包括睡莲花中没食子酸和烟花苷的薄层鉴别方法和含量测定方法。步骤一、采用薄层色谱法对睡莲花中的没食子酸和烟花苷进行定性分析；步骤二、采用高效液相色谱法对睡莲花中没食子酸和烟花苷进行含量测定。本发明对睡莲花提出了质量控制，具有较强的专属性和良好的重现性，真正体现了药品的安全有效性和质量可控性。
Description
技术领域
本发明涉及睡莲花的一种鉴别和含量测定方法，属于分析化学领域。
背景技术
睡莲花为睡莲科雪白睡莲(Nymphaea candidaPresl．)的干燥花蕾，分布于我国新疆的南部地区，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准．维吾尔药分册》(1999年版)，具有降热止咳、益心护脑，安神止痛的作用，临床主要用于感冒发热，头痛咳嗽，咽痛解表等症。在维吾尔医药中用药历史长久，是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药中的主要成分。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了快速、准确的睡莲花的鉴别和含量测方法。
本发明的目的通过以下技术方案具体实现：
睡莲花的一种鉴别和含量测定方法，包括睡莲花中没食子酸和烟花苷的薄层鉴别方法和含量测定方法，具体步骤如下：
步骤一、采用薄层色谱法对睡莲花中的没食子酸和烟花苷进行定性分析
在硅胶GF254薄层板上，分别点没食子酸-甲醇溶液、睡莲花药材-甲醇溶液，在聚酰胺薄膜上，点烟花苷-甲醇溶液、睡莲花药材-甲醇溶液，以乙酸乙酯-甲酸-水按体积比为8:1:1为展开剂展开，取出，晾干，置于荧光灯下检视；
步骤二、采用高效液相色谱法对睡莲花中没食子酸和烟花苷进行含量测定
1）对照品的制备
a.精密称取对照品没食子酸和烟花苷，加甲醇制成没食子酸和烟花苷的对照品储备液，浓度分别为0.650mg/ml、0.531mg/ml；
b.分别吸取没食子酸和烟花苷对照品储备液1ml、2.5ml，加甲醇稀释，得到含烟花苷和没食子酸的混合对照品溶液，所含烟花苷的浓度为0.1328mg/ml、所含没食子酸的浓度为0.0650mg/ml；
2）供试品的制备
精密称取1g睡莲花药材粉末，置于50ml具塞锥形瓶中，加入50ml甲醇，称重，超声提取30min，放冷后，称量质量并用甲醇补足质量差，过滤，置于样品瓶中，作为供试品溶液；
3）含量测定
测定睡莲花中没食子酸和烟花苷的含量时，采用没食子酸及烟花苷标准品做对照品，绘制进样量—色谱峰面积的标准曲线，测定睡莲花的色谱峰面积，从标准曲线上读出睡莲花中没食子酸及烟花苷的含量，其中，液相色谱测定峰面积的色谱条件为：色谱柱的直径和长度为4.6mm×250mm，5μm的WondasilTM C18，检测波长为270nm，流动相为甲醇和0.1%冰乙酸混合水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为5μl，采样时间为50min，采用梯度洗脱。
优选的，所述步骤二的步骤2）中，所述过滤采用0.45μm微孔膜过滤。
进一步的，所述步骤二的步骤3）中，所述梯度洗脱具体为：流动相中0.1%冰乙酸的体积百分数随时间变化为0.01～10min，从90%线性降至75%；10～25min，从75%线性降至55%；25～35min，从55%线性降至45%；35～50min，从45%线性降至0%。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种睡莲花中的没食子酸和烟花苷的含量测定及薄层分析方法，利用超声法提取睡莲花中的有效成分，采用HPLC法测定睡莲花中的没食子酸和烟花苷的含量，通过HPLC实验对睡莲花的成分进行了研究，并结合实际分离情况，确定了睡莲花的有效成分为没食子酸和烟花苷，亦为睡莲花的深入研究及临床应用提供一定的科学依据。该方法提供了一种定性鉴别方法和高效液相测定药物中没食子酸和烟花苷含量的方法，具有较强的专属性和良好的重现性（重复性试验中，供试品中没食子酸和烟花苷含量的RSD分别为0.354%、1.92%），真正体现了药品的安全有效性和质量可控性。本发明方法检测精准，误差小（精密度试验中5次对照品的没食子酸及烟花苷峰面积RSD分别为0.76%、0.98%）。可利用本申请的方法对睡莲花的质量进行检测控制。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是在荧光灯365nm下睡莲花样品与没食子酸标准品薄层色谱图，其中，1为睡莲花样品，2为没食子酸标准品；
图2是在荧光灯365nm下睡莲花样品与烟花苷标准品薄层色谱图，其中，1、2为睡莲花样品，3为烟花苷标准品；
图3是混合标准品中没食子酸对照品的紫外光谱图；
图4是混合标准品中烟花苷对照品的紫外光谱图；
图5是睡莲花中没食子酸的紫外光谱图；
图6是睡莲花中烟花苷的紫外光谱图；
图7是混合对照品高效液相色谱图，其中，a为没食子酸对照品高效液相色谱图；b为烟花苷高效液相色谱图；
图8是睡莲花供试样品溶液高效液相色谱图；
图9是没食子酸对照品线性考察图；
图10是烟花苷对照品线性考察图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
1.睡莲花薄层鉴别方法为：取睡莲花粉末1g，加甲醇溶液50ml,超声提取30min,放冷，滤过，将滤液浓缩至约2ml,作为供试品溶液，另精密称取没食子酸，烟花苷，标准品分别置于10ml容量瓶，作为对照品溶液。分别吸取没食子酸、供试品溶液各5μl,点于硅胶GF254薄层板上，吸取烟花苷、供试品溶液，点于聚酰胺薄膜，以体积比例为8：1: 1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，喷以1%的三氯化铝乙醇溶液，晾干，置于荧光灯下检视。参见荧光灯365nm下睡莲花样品与没食子酸标准品薄层色谱图（附图1），1为睡莲花样品，2为没食子酸标准品，1和2在对应位置处出现荧光点，说明可用于鉴别睡莲花中没食子酸。参见荧光灯365nm下睡莲花样品与烟花苷标准品薄层色谱图（附图2），其中，1、2为睡莲花样品，3为烟花苷标准品，1、2和3在相同位置均出现荧光点，说明可用于鉴别睡莲花样品中烟花苷。
2.睡莲花中没食子酸和烟花苷的含量测定方法
2.1药材、仪器与试剂
药材来源：睡莲花药材采自新疆奇康哈博维药有限公司，经新疆医科大学中医学院药用植物讲师徐海燕教师鉴定为睡莲科雪白睡莲(Nymphaea candidaPresl．)的干燥花蕾。粉碎过20目筛备用。
高效液相色谱仪LC-6AD、CBM-20A色谱工作站、SPD-20A型紫外检测器， SIL-20A型自动进样器、CTO-10ASvp型柱温箱(日本岛津公司)；安捷伦液相：G1322A在线脱气机，G1312A四元泵，G1367C自动进样器，G1316A柱温控制器，G1315B二极管阵列检测器（DAD）。XS105型电子天平(德国，梅特勒-托利多)、超声清洗器（KQ5200DE型 昆山市超声仪器有限公司）。
甲醇（色谱纯,飞世尔实验器材有限公司），其他均为分析纯，水为饮用纯净水（娃哈哈集团有限公司）,烟花苷标准品由新疆药物研究所赵军博士提供（含量〉97%）,没食子酸标准品（成都曼思特生物科技有限公司，含量〉98%）
2.2方法与结果
没食子酸和烟花苷对照品适量，加甲醇制成一定浓度的溶液，在200～400nm波长范围扫描，测得没食子酸的最大吸收波长λmax为270nm，烟花苷的最大吸收波长为265nm，参见附图3、4、5、6。
2.2.2色谱条件
色谱柱：直径和长度为4.6mm×250mm,5μm的Wondasil C18，流动相：甲醇和0.1%冰乙酸混合水溶液。采用梯度洗脱，流动相中B的体积百分数随时间变化为：0.01～10min，从90%线性降至75%；10～25min，从75%线性降至55%；25～35min，从55%线性降至45%；35～50min，从45%线性降至0%。柱温：30℃；流速：1mL/min，检测波长：270nm,进样量：5μl,采样时间：50min。
2.2.3对照品溶液的制备
精密称取标准品没食子酸6.50mg，烟花苷5.31mg,分别置于10ml容量瓶中加甲醇溶解定容，制成的没食子酸和烟花苷溶液的浓度分别为0.650mg/ml、0.531mg/ml。分别吸取没食子酸和烟花苷对照品储备液1ml、2.5ml，置于同一个10ml容量瓶中用甲醇稀释定容，得到混合对照品中烟花苷的浓度为0.1328mg/ml，没食子酸的溶度为0.0650mg/ml。
2.2.4供试品制备
精密称取1g睡莲花药材粉末，置于50ml具塞锥形瓶中，加入50ml甲醇，称重，超声处理30min,放冷后再称量质量并用甲醇补足质量差，过滤，取滤液用0.45μm微孔膜过滤，置于样品瓶中，作为供试样品溶液。
2.2.5线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液1,3,5,7,9μL，然后进样分析，以对照品的进样量(X，μg)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行性线性拟合，绘制标准曲线，得没食子酸线性回归方程为Y=3177785.34X-34770.85(r=0.999 1)，烟花苷线性回归方程为Y=2027945.39X-17934.95(r=0.999 5)，结果表明，没食子酸及烟花苷进样量分别在0.065～0.535μg，0.133～1.195μg范围内，峰面积与进样量呈现良好的线性关系。参见附图7、8、9、10。
2.2.6精密度试验
精密吸取混合对照品溶液5μL，连续进样5次，结果没食子酸及烟花苷峰面积RSD分别为0.76%、0.98%，表明仪器精密度较好。
2.2.7稳定性试验
取同一睡莲花供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样5 μL测定，结果没食子酸标准品峰面积RSD为2.37%，烟花苷标准品峰面积RSD为2.29%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.2.8重复性试验 称取睡莲花样品5份，按“2.2.4”项下方法配制成供试液，并在上述色谱条件下进样5μL进行测定。结果供试品中没食子酸及烟花苷含量的RSD为0.354%、1.92%，表明该实验方法的重复性较好。
2.2.9加样回收率试验
分别称取6份已知含量睡莲花药材粉末0.5g，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加入已知没食子酸及烟花苷量的对照品，按“2.2.4”项下方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下进样5 μL测定，结果计算得到睡莲花中没食子酸平均回收率为102.71%，RSD为1.97%，烟花苷平均回收率为102.08%，RSD为0.457%。见表1。
2.3.0 样品含量测定
分别精密吸取供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下进行测定，记录峰面积，计算样品中的没食子酸和烟花苷的含量，见表2。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，但对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种睡莲花的鉴别和含量测定方法，睡莲花中没食子酸和烟花苷的薄层鉴别方法和含量测定方法，具体步骤如下：
步骤一、采用薄层色谱法对睡莲花中的没食子酸和烟花苷进行定性分析
在硅胶GF254薄层板上，分别点没食子酸-甲醇溶液、睡莲花药材-甲醇溶液，在聚酰胺薄膜上，点烟花苷-甲醇溶液、睡莲花药材-甲醇溶液，以乙酸乙酯-甲酸-水按体积比为8:1:1为展开剂展开，取出，晾干，置于荧光灯下检视；
步骤二、采用高效液相色谱法对睡莲花中没食子酸和烟花苷进行含量测定
1）对照品的制备
a、精密称取对照品没食子酸和烟花苷，加甲醇制成没食子酸和烟花苷的对照品储备液，浓度分别为0.650mg/ml、0.531mg/ml；
b、分别吸取没食子酸和烟花苷对照品储备液各1ml、2.5ml，加甲醇稀释，得到含烟花苷和没食子酸的对照品混合溶液，所含烟花苷的浓度为0.1328mg/ml、所含没食子酸的浓度为0.0650mg/ml；
2）供试品的制备
精密称取1g睡莲花药材粉末，置于50ml具塞锥形瓶中，加入50ml甲醇，称重，超声提取30min，放冷后，称量质量并用甲醇补足质量差，过滤，置于样品瓶中，作为供试品溶液；
3）含量测定
测定睡莲花中没食子酸和烟花苷的含量时，采用没食子酸及烟花苷标准品做对照品，绘制进样量—色谱峰面积的标准曲线，测定睡莲花的色谱峰面积，从标准曲线上读出睡莲花中没食子酸及烟花苷的含量，其中，液相色谱测定峰面积的色谱条件为：色谱柱的直径和长度为4.6mm×250mm，5μm的WondasilTM C18，检测波长为270nm，流动相为甲醇和0.1%冰乙酸混合水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为5μl，采样时间为50min，采用梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的睡莲花的鉴别和含量测定方法，其特征在于：所述步骤二的步骤2中，所述过滤采用0.45μm微孔膜过滤。
3.根据权利要求1所述的睡莲花的鉴别和含量测定方法，其特征在于：所述步骤二的步骤3）中，所述梯度洗脱具体为：流动相中0.1%冰乙酸的体积百分数随时间变化为0.01～10min，从90%线性降至75%；10～25min，从75%线性降至55%；25～35min，从55%线性降至45%；35～50min，从45%线性降至0%。
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