CN116008418B - 雪白睡莲花药材的hplc指纹图谱及判定含量模型的构建方法及雪白睡莲花的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药药材的质量控制技术领域，提供了一种雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱及判定含量模型的构建方法及雪白睡莲花的鉴别方法。本发明提供的构建方法包括：雪白睡莲花典型样品的选择、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的优化、相似度评价及标准指纹图谱的建立。本发明实现了同时获得雪白睡莲花药材中鞣花酸、睡莲酚和没食子酸甲酯的含量。本发明所得HPLC指纹图谱全面、且具代表性，方法简便、准确、稳定，可应用于雪白睡莲花药材的真伪及优劣鉴别。

Description

雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱及判定含量模型的构建方法 及雪白睡莲花的鉴别方法

技术领域

本发明涉及中药药材的质量控制技术领域，尤其涉及一种雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱及判定含量模型的构建方法及雪白睡莲花的鉴别方法。

背景技术

睡莲属植物为睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属多年生水生草本植物，全世界约有50个原生种及变种，广泛分布于热带、亚热带及温带地区，其中我国原产5种：雪白睡莲Nymphaea candida、白睡莲N.alba、延药睡莲N.stellata、睡莲(子午莲)N.tetragona、柔毛齿叶睡莲N.lotu。黄酮和多酚类成分是该属植物所含主要的特征性成分。睡莲属植物具有丰富的观赏价值和药用价值，其中子午莲等还是人们喜爱的食物。药理学研究表明，睡莲属植物提取物具有抗氧化、抗菌、抗炎、肝保护、降血糖等多种生物活性，黄酮和多酚类成分是其所含的主要特征性成分。

作为睡莲属植物的一种，雪白睡莲N.candida主要分布于我国新疆的伊犁、博斯腾湖和阿勒泰等地以及中亚地区，其干燥花蕾在新疆药用历史悠久，具有镇静安神、清热解毒、益心护脑等多种功效。然而，由于近年来人类对自然的开发，雪白睡莲赖以生存的水塘及湖泊环境日益缩小，野生雪白睡莲药材产量也日渐减少，已被列入国家二级濒危野生植物名录中。因此，药材市场上基本没有产于新疆的雪白睡莲花药材，成方制剂的制备及单方临床使用的药材基本依赖进口。这些市售睡莲花存在来源广泛，基源不清，不易进行真伪鉴别的缺陷。公开号为CN103513000A的中国专利对3批市售睡莲花所含的没食子酸和烟花苷定性定量研究的基础上，建立了该药材质量控制方法。公开号为CN104267114A的中国专利进一步建立了没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷和槲皮素的含量测定方法。然而这些质量控制方法仅限于常规成分的理化鉴别以及含量测定，缺乏质量控制方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱及判定含量模型的构建方法及雪白睡莲花的鉴别方法。本发明提供的构建方法得到的指纹图谱用于雪白睡莲花药材的鉴别时，更全面，结果更准确。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；

对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；

以所述雪白睡莲花典型样本的色谱图的11号峰为基准，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对各所述雪白睡莲花典型样本的色谱图进行相似度评价，得到所述雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱；

所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。

优选地，所述醇提的提取剂为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液的体积浓度为60～80％；所述醇提的提取剂和雪白睡莲花典型样本的用量比为20～30mL：0.25g。

优选地，所述醇提在水浴加热回流条件下进行；所述醇提的时间为90～120min。

优选地，所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱为Phenomenex Gemini NX-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm，填料为十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温为30～35℃；

流动相体系包括流动相A和流动相B；

所述流动相A为乙腈，所述流动相B为体积分数为0.2％的磷酸水溶液；

所述流动相体系的流速为0.8～1.2mL/min；

洗脱程序为梯度洗脱程序；

所述梯度洗脱程序为：

0min：流动相A的体积百分含量为5％、流动相B的体积百分含量为95％；

35min：流动相A的体积百分含量为15％、流动相B的体积百分含量为85％；

65min：流动相A的体积百分含量为18％、流动相B的体积百分含量为82％；

70min：流动相A的体积百分含量为20％、流动相B的体积百分含量为80％；

75min：流动相A的体积百分含量为5％、流动相B的体积百分含量为95％；

紫外检测波长为250～300nm。

优选地，所述雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱包括14个共有特征峰，其相对于11号峰参照峰鞣花酸的相对保留时间范围分别为：0.115～0.140、0.328～0.400、0.408～0.498、0.535～0.653、0.571～0.697、0.623～0.761、0.650～0.794、0.704～0.860、0.807～0.986、0.851～1.040、1.000、0.941～1.150、1.145～1.398、1.197～1.462；其中，1、2、4、7、11、13、14号峰分别为没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖。

本发明还提供了一种雪白睡莲花药材的判定含量模型的构建方法，包括以下步骤：

对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；

对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；

配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的对照品包括没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖；

对所述混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，得到混合对照品溶液的色谱图；

以混合对照品溶液的色谱图对各雪白睡莲花典型样本的色谱图进行定性分析，确定各雪白睡莲花典型样本的色谱图中相关峰的化学结构；

基于所述混合对照品溶液中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量，确定雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围；

基于所述雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围，得到雪白睡莲花药材的判定含量模型；

所述雪白睡莲花药材的判定含量模型包括雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量；

所述混合对照品溶液中没食子酸的浓度为0.2796mg/mL，没食子酸甲酯的浓度为0.47mg/mL，睡莲酚的浓度为0.96mg/mL，老鹳草素的浓度为1.02mg/mL，鞣花酸的浓度为0.67mg/mL，烟花苷的浓度为0.2372mg/mL，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的浓度为1.07mg/mL；

所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。

优选地，所述雪白睡莲花药材中：没食子酸甲酯的判定含量为≥5.0mg/g，睡莲酚的判定含量为≥2.5mg/g，鞣花酸的判定含量为≥1.2mg/g。

本发明还提供了一种雪白睡莲花的鉴别方法，包括以下步骤：

将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；

对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所述待测雪白睡莲花的色谱图和上述技术方案所述的构建方法得到的雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱进行相似度评价，得到待测雪白睡莲花的相似度值；

当所述待测雪白睡莲花的相似度值≥0.90，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。

本发明还提供了另外一种雪白睡莲花的鉴别方法，包括以下步骤：

将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；

对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；

基于预定的没食子酸甲酯的标准曲线、预定的睡莲酚的标准曲线和预定的鞣花酸的标准曲线，对所述待测雪白睡莲花的色谱图进行定量计算，得到待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量；

将所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量与上述技术方案所述的构建方法得到的所述雪白睡莲花药材的判定含量模型中的没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量进行比较；

若所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量均在所述雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量内，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。

本发明提供了一种雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；以所述雪白睡莲花典型样本的色谱图的11号峰为基准，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对各所述雪白睡莲花典型样本的色谱图进行相似度评价，得到所述雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱；所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。本发明提供的构建方法以博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花作为雪白睡莲花典型样本进行指纹图谱的建立，所得指纹图谱更全面、更具代表性、准确性和稳定性；通过得到的指纹图谱对雪白睡莲花进行鉴定，结果更加准确。

本发明还提供了一种雪白睡莲花药材的判定含量模型的构建方法，包括以下步骤：对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的对照品包括没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖；对所述混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，得到混合对照品溶液的色谱图；以混合对照品溶液的色谱图对各雪白睡莲花典型样本的色谱图进行定性分析，确定各雪白睡莲花典型样本的色谱图中相关峰的化学结构；基于所述混合对照品溶液中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量，确定雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围；基于所述雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围，得到雪白睡莲花药材的判定含量模型；所述雪白睡莲花药材的判定含量模型包括雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量；所述混合对照品溶液中没食子酸的浓度为0.2796mg/mL，没食子酸甲酯的浓度为0.47mg/mL，睡莲酚的浓度为0.96mg/mL，老鹳草素的浓度为1.02mg/mL，鞣花酸的浓度为0.67mg/mL，烟花苷的浓度为0.2372mg/mL，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的浓度为1.07mg/mL；所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。本发明提供的构建方法以博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花作为雪白睡莲花典型样本进行判定含量模型的建立，所得判定含量模型更具代表性、准确性和稳定性；通过得到的判定含量模型对雪白睡莲花进行鉴定，结果更加准确。

本发明还提供了一种雪白睡莲花的鉴别方法，包括以下步骤：将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所述待测雪白睡莲花的色谱图和上述技术方案所述的构建方法得到的雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱进行相似度评价，得到待测雪白睡莲花的相似度值；当所述待测雪白睡莲花的相似度值≥0.90，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。本发明提供的鉴别方法鉴别结果更准确。

本发明还提供了另外一种雪白睡莲花的鉴别方法，包括以下步骤：将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；基于预定的没食子酸甲酯的标准曲线、预定的睡莲酚的标准曲线和预定的鞣花酸的标准曲线，对所述待测雪白睡莲花的色谱图进行定量计算，得到待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量；将所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量与上述技术方案所述的构建方法得到的所述雪白睡莲花药材的判定含量模型中的没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量进行比较；若所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量均在所述雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量内，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。本发明提供的鉴别方法操作简单。

附图说明

图1为所得雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱；

图2为混合对照品溶液的高效液相色谱图；

图3为对照谱图R。

具体实施方式

本发明提供了一种雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；

对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；

以所述雪白睡莲花典型样本的色谱图的11号峰为基准，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对各所述雪白睡莲花典型样本的色谱图进行相似度评价，得到所述雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱；

所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。

本发明对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液。

在本发明中，所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域(北屯)的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。具体如表1所示。

表1雪白睡莲花典型样本的具体信息

在本发明中，所述雪白睡莲花典型样本优选为粉末状；粉末状雪白睡莲花典型样本的粒径优选为250μm～850μm。

在本发明中，所述醇提的提取剂优选为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液的体积浓度优选为60～80％。在本发明中，所述醇提的提取剂和雪白睡莲花典型样本的用量比优选为20～30mL：0.25g。

在本发明中，所述醇提优选在水浴加热回流条件下进行；所述醇提的时间优选为90～120min。

得到提取液后，本发明对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱优选为Phenomenex Gemini NX-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；填料优选为十八烷基硅烷键合硅胶。

在本发明中，柱温优选为30～35℃；

在本发明中，流动相体系优选包括流动相A和流动相B；所述流动相A优选为乙腈，所述流动相B优选为体积分数为0.2％的磷酸水溶液。在本发明中，所述流动相体系的流速优选为0.8～1.2mL/min；

在本发明中，洗脱程序优选为梯度洗脱程序；所述梯度洗脱程序优选为：

0min：流动相A的体积百分含量为5％、流动相B的体积百分含量为95％；

35min：流动相A的体积百分含量为15％、流动相B的体积百分含量为85％；

65min：流动相A的体积百分含量为18％、流动相B的体积百分含量为82％；

70min：流动相A的体积百分含量为20％、流动相B的体积百分含量为80％；

75min：流动相A的体积百分含量为5％、流动相B的体积百分含量为95％。

在本发明中，紫外检测波长优选为250～300nm，进一步优选为266nm。

得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图后，本发明以所述雪白睡莲花典型样本的色谱图的11号峰为基准，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对各所述雪白睡莲花典型样本的色谱图进行相似度评价，得到所述雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱。

在本发明中，所述中药色谱指纹图谱相似度评价系统优选为中国药典委员会2012A版中的中药色谱指纹图谱相似度评价系统。

在本发明中，所述雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱优选包括14个共有特征峰，其相对于11号峰参照峰鞣花酸的相对保留时间范围分别为：0.115～0.140、0.328～0.400、0.408～0.498、0.535～0.653、0.571～0.697、0.623～0.761、0.650～0.794、0.704～0.860、0.807～0.986、0.851～1.040、1.000、0.941～1.150、1.145～1.398、1.197～1.462；其中，1、2、4、7、11、13、14号峰分别为没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖。

本发明还提供了一种雪白睡莲花药材的判定含量模型的构建方法，包括以下步骤：

对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；

对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；

配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的对照品包括没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖；

对所述混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，得到混合对照品溶液的色谱图；

以混合对照品溶液的色谱图对各雪白睡莲花典型样本的色谱图进行定性分析，确定各雪白睡莲花典型样本的色谱图中相关峰的化学结构；

基于所述混合对照品溶液中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量，确定雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围；

基于所述雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围，得到雪白睡莲花药材的判定含量模型；

所述雪白睡莲花药材的判定含量模型包括雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量；

所述混合对照品溶液中没食子酸的浓度为0.2796mg/mL，没食子酸甲酯的浓度为0.47mg/mL，睡莲酚的浓度为0.96mg/mL，老鹳草素的浓度为1.02mg/mL，鞣花酸的浓度为0.67mg/mL，烟花苷的浓度为0.2372mg/mL，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的浓度为1.07mg/mL；

所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。

本发明对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液。在本发明中，所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花。在本发明中，所述醇提的操作和参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。

得到提取液后，本发明对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图。在本发明中，所述高效液相色谱检测的参数与上述技术方案所述的高效液相色谱检测的参数一致，在此不再赘述。

本发明配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的对照品包括没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖。在本发明中，所述混合对照品溶液中没食子酸的浓度为0.2796mg/mL，没食子酸甲酯的浓度为0.47mg/mL，睡莲酚的浓度为0.96mg/mL，老鹳草素的浓度为1.02mg/mL，鞣花酸的浓度为0.67mg/mL，烟花苷的浓度为0.2372mg/mL，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的浓度为1.07mg/mL。在本发明中，所述混合对照品溶液的溶剂优选为甲醇。

得到混合对照品溶液后，本发明对所述混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，得到混合对照品溶液的色谱图。在本发明中，所述高效液相色谱检测的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。

得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图和混合对照品溶液的色谱图后，本发明以混合对照品溶液的色谱图对各雪白睡莲花典型样本的色谱图进行定性分析，确定各雪白睡莲花典型样本的色谱图中相关峰的化学结构。

本发明对所述定性分析的操作不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的定性分析手段即可。

本发明基于所述混合对照品溶液中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量，确定雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围；基于所述雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围，得到雪白睡莲花药材的判定含量模型。

在本发明中，所述雪白睡莲花药材的判定含量模型包括雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量。

在本发明中，所述雪白睡莲花药材中：没食子酸甲酯的判定含量优选为≥5.0mg/g，睡莲酚的判定含量优选为≥2.5mg/g，鞣花酸的判定含量优选为≥1.2mg/g。

本发明还提供了一种雪白睡莲花的鉴别方法，包括以下步骤：

将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；

对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所述待测雪白睡莲花的色谱图和上述技术方案所述的构建方法得到的雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱进行相似度评价，得到待测雪白睡莲花的相似度值；

当所述待测雪白睡莲花的相似度值≥0.90，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。

本发明将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液。在本发明中，所述醇提优选与上述技术方案所述的构建方法中涉及的醇提一致，在此不再赘述。

得到待测提取液后，本发明对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图。在本发明中，所述高效液相色谱检测优选与上述技术方案所述的构建方法中涉及的高效液相色谱检测参数一致，在此不再赘述。

得到待测雪白睡莲花的色谱图后，本发明利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所述待测雪白睡莲花的色谱图和上述技术方案所述的构建方法得到的雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱进行相似度评价，得到待测雪白睡莲花的相似度值。在本发明中，所述中药色谱指纹图谱相似度评价系统和相似度评价优选与上述技术方案所述的构建方法中涉及的中药色谱指纹图谱相似度评价系统和相似度评价一致，在此不再赘述。

在本发明中，当所述待测雪白睡莲花的相似度值≥0.90，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别；当所述待测雪白睡莲花的相似度值<0.90，则判定待测雪白睡莲花不为雪白睡莲花药材级别。

本发明还提供了另外一种雪白睡莲花的鉴别方法，包括以下步骤：

将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；

对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；

基于预定的没食子酸甲酯的标准曲线、预定的睡莲酚的标准曲线和预定的鞣花酸的标准曲线，对所述待测雪白睡莲花的色谱图进行定量计算，得到待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量；

将所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量与上述技术方案所述的构建方法得到的所述雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量进行比较；

若所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量均在所述雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量内，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。

本发明将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液。在本发明中，所述醇提优选与上述技术方案所述的构建方法中涉及的醇提一致，在此不再赘述。

得到待测提取液后，本发明对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图。在本发明中，所述高效液相色谱检测优选与上述技术方案所述的构建方法中涉及的高效液相色谱检测一致，在此不再赘述。

得到待测雪白睡莲花的色谱图后，本发明基于预定的没食子酸甲酯的标准曲线、预定的睡莲酚的标准曲线和预定的鞣花酸的标准曲线，对所述待测雪白睡莲花的色谱图进行定量计算，得到待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量。本发明对所述预定的没食子酸甲酯的标准曲线、预定的睡莲酚的标准曲线和预定的鞣花酸的标准曲线的建立方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的标准曲线获取方式即可。

得到待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量后，本发明将所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量与上述技术方案所述的构建方法得到的所述雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量进行比较。

本发明对所述比较的操作不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的操作即可。

在本发明中，若所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量均在所述雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量内，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。反之亦然。

下面结合实施例对本发明提供的雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱及判定含量模型的构建方法及雪白睡莲花的鉴别方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱的构建

1仪器与试药

1.1仪器：Agilent-1260DAD高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，AL-204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，AB135-S电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，BS-110S(北京赛多利斯有限公司)，DZKW电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2试药：对照品没食子酸(批号：110831-201906，中国食品药品检定研究所)、没食子酸甲酯(批号：MUST-21071707，成都曼思特生物科技有限公司)、睡莲酚(纯度>98％，自制)、老鹳草素(批号：MUST-12041702，成都曼思特生物科技有限公司)、鞣花酸(批号：MUST-14031010，成都曼思特生物科技有限公司)、烟花苷(纯度98.95％，自制)、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖(批号：MUST-21092610，成都曼思特生物科技有限公司)。

样品提取溶剂为分析甲醇，流动相甲醇、乙腈为色谱醇。17批雪白睡莲花典型样本的具体信息如表1所示；其中，15批栽培种雪白睡莲花典型样本S1-S15采自乌鲁木齐市绿之园园林科技有限公司种植基地，2批野生睡莲花采自新疆伊犁河流域(S16、S17)，均经新疆药物研究所何江研究员与乌鲁木齐绿之园园林科技有限公司杨军高级工程师鉴定为雪白睡莲Nymphaea candida Presl。

2.雪白睡莲花典型样本的提取

雪白睡莲花典型样本的提取：取粉末状雪白睡莲花典型样本0.25g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，精密加入体积浓度为80％的甲醇溶液20mL，加热回流提取120min，放冷，滤过至25mL容量瓶中，加入体积浓度为80％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为提取液。

3.高效液相色谱检测的条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱为Phenomenex Gemini NX-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)，采用梯度洗脱，流动相体系为流动相A(乙腈)-流动相B(0.2％磷酸水溶液)组成，流动相体系的流速为1.0mL/min，柱温为30℃，紫外检测波长为266nm，检测器为二级管阵列检测器；时间为75min；

梯度洗脱程序为：

0min：流动相A的体积百分含量为5％、流动相B的体积百分含量为95％；

35min：流动相A的体积百分含量为15％，流动相B的体积百分含量为85％；

65min：流动相A的体积百分含量为18％、流动相B的体积百分含量为82％；

70min：流动相A的体积百分含量为20％、流动相B的体积百分含量为80％；

75min：流动相A的体积百分含量为5％、流动相B的体积百分含量为95％；

4.测定

采用3.高效液相色谱检测的条件对各提取液进行高效液相色谱检测，得到17批雪白睡莲花典型样本的色谱图。

5.相似度评价

以17批雪白睡莲花典型样本的色谱图的11号峰(鞣花酸)作为参照，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(中国药典委员会2012A版)对17批雪白睡莲花的色谱图进行相似度评价，得到雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱，如图1所示。从图1可以看出：雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱确定了14个共有峰。

以鞣花酸色谱峰为对照，比较各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，精密度、重复性和稳定性试验中相对保留时间结果均RSD<1.0％，占总峰面积百分比2％以上的共有峰面积均RSD<2.9％，表明方法学验证符合指纹图谱技术要求。

混合对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、鞣花酸和烟花苷对照品适量，加甲醇制成含没食子酸0.2796mg/mL，没食子酸甲酯0.47mg/mL，睡莲酚0.96mg/mL，老鹳草素1.02mg/mL，鞣花酸0.67mg/mL，烟花苷0.2372mg/mL和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖1.07mg/mL的混合对照品溶液。采用3.高效液相色谱检测的条件对混合对照品溶液进行检测，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图，结果如图2所示。

以混合对照品溶液中的7个色谱峰为基准，标识了雪白睡莲花药材HPLC指纹图谱中的7个共有峰。

设定样品S16的图谱作为参照，采用中位数法自动匹配自动生成对照图谱，即雪白睡莲花药材标准指纹图谱，结果如图3所示。通过将各批次雪白睡莲花典型样本的色谱图与标准指纹图谱比较，得各批次雪白睡莲花典型样本的相似度，结果如表2所示。

表217批次雪白睡莲花典型样本的相似度

从表2可以看出：以鞣花酸(11号峰)为参照峰，选择了各批次雪白睡莲花典型样本的色谱图重复稳定出现的14个峰为共有峰，经计算机辅助相似度评价软件计算后，该17批次雪白睡莲花典型样本相对对照指纹图谱的相似度均在0.9以上。17批次雪白睡莲花典型样本的14个共有峰相对保留时间基本一致，相对峰面积差别较小。

实施例2没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量测定

1仪器与试药，同实施例1。

2.雪白睡莲花典型样本的提取，同实施例1。

3.高效液相色谱含量测定的条件，同实施例1。

4.没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量测定

4.1线性关系考察

分别精密移取没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL于10mL量瓶中，用甲醇定容。按上述高效液相色谱含量测定的条件分别测定稀释品及母液峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)绘制标准曲线，得到：没食子酸甲酯的回归方程为Y＝17662X-36.967，r＝0.9998，线性范围4.7～470.0μg/mL，睡莲酚的回归方程为Y＝15063X+76.725，r＝0.9998，线性范围9.6～960.0μg/mL；鞣花酸的回归方程为Y＝94443X-144.38，r＝0.9999，线性范围6.7～670.0μg/mL。

4.2精密度试验

4.2.1日内精密度试验：取同一供试品溶液(批号：20210706-1)连续进样6次，测定峰面积，计算没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸峰面积的RSD分别为0.42％、1.83％、0.47％；表明该方法日内精密度良好。

4.2.2日间精密度试验：取同一供试品溶液续进样6天，测定峰面积，计算没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的RSD分别为1.29％、1.08％、1.38％；表明该方法日间精密度良好。

4.3稳定性试验

取同一供试品溶液，于0、2、4、8、12、24h时测定，计算没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的RSD分别为0.94％、1.46％、0.52％；表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

4.4.重复性试验

取睡莲花粉末，按“实施例1”项下制备供试品溶液，在同样色谱条件下测定，平行操作6份，测得没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的RSD分别为1.63％、1.78％、1.58％；表明该方法重复性良好。

4.5加样回收率试验

精密称取各成分含量已知的本品0.125g，分别精密加入对照品溶液(0.47mg/mL没食子酸甲酯对照品溶液1.0mL，0.96mg/mL睡莲酚对照品溶液0.5mL和0.67mg/mL鞣花酸对照品溶液0.4mL)按“实施例1”项下方法制备供试品溶液，在已确定的色谱条件下进样，计算加样回收率。结果没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸平均加样回收率分别为97.44％、103.2％、101.0％，RSD分别为1.50％、0.81％、0.82％。

4.6含量测定

精密称取17批雪白睡莲花典型样本粉末各0.25g，按“实施例1”项下所述方法制备，精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，并计算17批雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量，结果如表3所示。

表317批雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量

进而确定雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的质量含量在6.34mg/g～12.40mg/g之间，即≥5.0mg/g；睡莲酚的质量含量在3.19mg/g～5.64mg/g之间，即≥2.5mg/g；鞣花酸的质量含量在1.36mg/g～2.55mg/g之间，即≥1.2mg/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；

对所述提取液进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；

以所述雪白睡莲花典型样本的色谱图中鞣花酸的色谱峰作为参照峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对各所述雪白睡莲花典型样本的色谱图进行相似度评价，得到所述雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱；

所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花；

配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的对照品包括没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖；

所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱为PhenomenexGeminiNX-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm，填料为十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温为30~35℃；

流动相体系包括流动相A和流动相B；

所述流动相A为乙腈，所述流动相B为体积分数为0.2%的磷酸水溶液；

所述流动相体系的流速为0.8~1.2mL/min；

洗脱程序为梯度洗脱程序；

所述梯度洗脱程序为：

0min：流动相A的体积百分含量为5%、流动相B的体积百分含量为95%；

35min：流动相A的体积百分含量为15%、流动相B的体积百分含量为85%；

65min：流动相A的体积百分含量为18%、流动相B的体积百分含量为82%；

70min：流动相A的体积百分含量为20%、流动相B的体积百分含量为80%；

75min：流动相A的体积百分含量为5%、流动相B的体积百分含量为95%；

紫外检测波长为266nm。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述醇提的提取剂为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液的体积浓度为60~80%；所述醇提的提取剂和雪白睡莲花典型样本的用量比为20~30mL：0.25g。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述醇提在水浴加热回流条件下进行；所述醇提的时间为90~120min。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱包括14个共有特征峰，其相对于11号峰参照峰鞣花酸的相对保留时间范围分别为：0.115~0.140、0.328~0.400、0.408~0.498、0.535~0.653、0.571~0.697、0.623~0.761、0.650~0.794、0.704~0.860、0.807~0.986、0.851~1.040、1.000、0.941~1.150、1.145~1.398、1.197~1.462；其中，1、2、4、7、11、13、14号峰分别为没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖。

5.一种雪白睡莲花药材的判定含量模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

对各雪白睡莲花典型样本分别进行醇提，得到提取液；

对所述提取液按照权利要求1所述的构建方法中的高效液相色谱检测的参数进行高效液相色谱检测，得到各雪白睡莲花典型样本的色谱图；

配制混合对照品溶液，所述混合对照品溶液的对照品包括没食子酸、没食子酸甲酯、睡莲酚、老鹳草素、鞣花酸、烟花苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖；

对所述混合对照品溶液按照权利要求1所述的构建方法中的高效液相色谱检测的参数进行高效液相色谱检测，得到混合对照品溶液的色谱图；

以混合对照品溶液的色谱图对各雪白睡莲花典型样本的色谱图进行定性分析，确定各雪白睡莲花典型样本的色谱图中相关峰的化学结构；

基于所述混合对照品溶液中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量，确定雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围；

基于所述雪白睡莲花典型样本中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量范围，得到雪白睡莲花药材的判定含量模型；

所述雪白睡莲花药材的判定含量模型包括雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量；

所述混合对照品溶液中没食子酸的浓度为0.2796mg/mL，没食子酸甲酯的浓度为0.47mg/mL，睡莲酚的浓度为0.96mg/mL，老鹳草素的浓度为1.02mg/mL，鞣花酸的浓度为0.67mg/mL，烟花苷的浓度为0.2372mg/mL，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的浓度为1.07mg/mL；

所述雪白睡莲花典型样本包括博斯腾湖的12种栽培种雪白睡莲花、额尔齐斯河河流域的3种栽培种雪白睡莲花以及伊犁河流域的2种野生雪白睡莲花；

所述雪白睡莲花药材中：没食子酸甲酯的判定含量为≥5.0mg/g，睡莲酚的判定含量为≥2.5mg/g，鞣花酸的判定含量为≥1.2mg/g。

6.一种雪白睡莲花的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；

对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所述待测雪白睡莲花的色谱图和权利要求1~4任一项所述的构建方法得到的雪白睡莲花药材的HPLC指纹图谱进行相似度评价，得到待测雪白睡莲花的相似度值；

当所述待测雪白睡莲花的相似度值≥0.90，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。

7.一种雪白睡莲花的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待测雪白睡莲花进行醇提，得到待测提取液；

对所述待测提取液进行高效液相色谱检测，得到待测雪白睡莲花的色谱图；

基于预定的没食子酸甲酯的标准曲线、预定的睡莲酚的标准曲线和预定的鞣花酸的标准曲线，对所述待测雪白睡莲花的色谱图进行定量计算，得到待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量；

将所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量与权利要求5所述的构建方法得到的所述雪白睡莲花药材的判定含量模型中的没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量进行比较；

若所述待测雪白睡莲花中没食子酸甲酯、睡莲酚和鞣花酸的含量均在所述雪白睡莲花药材中没食子酸甲酯的判定含量、睡莲酚的判定含量和鞣花酸的判定含量内，则判定待测雪白睡莲花为雪白睡莲花药材级别。