CN104914203A - 一种百两金药材或其提取物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百两金药材或其提取物的检测方法，该方法采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定其中活性成分百两金皂苷B的含量，从而使百两金药材或其提取物的内在质量能够得到更全面的评价。该方法线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率、耐受性等均符合定量分析要求。利用该方法首次测定了百两金药材及其提取物的百两金皂苷B含量，为考察百两金药材主要有效成分的含量提供了快速高效的分析手段，也可供新药研究开发参考。

Description

一种百两金药材或其提取物的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及中药材的质量控制，具体是百两金药材或其提取物的检测方法。

背景技术

百两金(Ardisia crispa(Thunb.)DC.A.)是紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia Sw.)常绿灌木植物，分布于四川、贵州、湖南、湖北、江西、浙江、福建、广东和广西等地。以全株入药，具有清咽利喉、散淤消肿和舒筋活血的功效，并具有清热解毒、活血舒筋、祛痰止咳和提脓生肌之功，我国民间多用于治疗咽喉痛、扁桃体炎、肾炎水肿、跌打损伤、风湿疼痛、白浊、骨结核、劳伤咳血、痈疔和毒蛇咬伤等。现代药理研究表明，本药材具有细胞毒活性和抗肿瘤作用，同时具有抗炎、抑菌、收缩子宫、抗氧化等活性作用。百两金皂苷B(ardisiacrispin B)是该药材主要活性成分之一，其化学结构式如下：

目前对该属植物的研究热点主要集中在化学成分、药理作用和临床应用等方面，也有人建立了百两金药材中岩白菜素和百两金皂苷A含量测定的方法(侯金玲等.HPLC-ESLD测定瑶药竹叶风中岩白菜素和百两金皂苷A含量的方法研究[J]广西医科大学学报2014，31(1)：50-54)，但未见百两金皂苷B的定量分析方法。由于岩白菜素和百两金皂苷A在百两金药材中的含量水平较低(前者含量在0.08％～0.30％；后者含量在0.25％～0.31％)，增加含量水平更高的百两金皂苷B的检测方法，能更好的控制该药材的内在质量。故我们从该药材中提取分离得到百两金皂苷B单体，并按照对照品研究技术指导原则进行了纯化及结构鉴定，最终建立起百两金药材或其提取物中百两金皂苷B的高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)的快速分析方法，提高了该药材或其提取物的质量控制水平。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定百两金药材或其提取物中百两金皂苷B含量的检测方法，其特征在于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶40～68∶32的甲醇-水为流动相；蒸发光散射检测器检测；理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000；其主要步骤还包括对照品和样品溶液制备、进样分析测定并计算。

根据前述的检测方法，其中，将红毛走马胎粉碎，用50％～80％的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，用水和30％乙醇冲洗除杂，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析，以体积比为70∶30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，用相应流动相溶解结晶物后注入制备型高效液相色谱仪分离纯化；色谱条件：C₁₈柱；流动相：体积比为60∶40～68∶32的甲醇-水；检测波长：205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，鉴定结构并检测纯度，即得。

根据前述的检测方法，其中，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为80℃～110℃；气体流速为1.6～2.4L·min^-1。

根据前述的检测方法，其中，所述百两金药材或其提取物的供试品溶液是用50％～70％的甲醇或乙醇水溶液提取制备，优选为50％乙醇。

5.根据前述的检测方法，其中，所述采用HPLC-ELSD法测定百两金皂苷B含量包括如下步骤及优化条件：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(65∶35)为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000。

对照品溶液制备 取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。

供试品溶液制备 取百两金药材粉末(过三号筛)0.4g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入50％乙醇50mL，密塞，称定重量，超声(功率300W，频率40kHz)处理60分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤或离心，取续滤液或上清液，即得。

测定方法 分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL；供试品溶液5～10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

本发明所提供的百两金药材或其提取物中百两金皂苷B含量的HPLC-ELSD检测方法具有如下优点：

(1)本发明提供的方法首次引入了百两金药材或其提取物中有效成分百两金皂苷B的含量测定，从而使百两金的质量控制方法更加科学合理；

(2)本发明所提供的的百两金药材或其提取物的分析方法首次将HPLC-ELSD法用于百两金药材或其提取物中活性成分百两金皂苷B的含量测定，具有良好的线性关系、精密度、重复性、稳定性、耐受性和回收率，测定简便快速。

附图说明

图1为百两金皂苷B对照品溶液的HPLC-ELSD色谱图；

图2为百两金药材的HPLC-ELSD色谱图；

图3为百两金提取物的HPLC-ELSD色谱图。

具体实施方式

1仪器、试药与样品

高效液相色谱仪(美国Waters 515系列)；Alltech ELSD 2000型蒸发光散射检测器；制备型高效液相色谱仪(美国贝克曼库尔特BECHMAN 125P型)，包含SYSTEM GOLD 125PSolvent Module和166p Detector等；Milli-Q超纯水器(美国Milipore公司)；Microfuge 18台式离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；KQ-500DE超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司，功率300W，频率40kHz)；BP-210D型电子分析天平(德国赛多利斯，十万分之一)；过滤装置(Autoscience)及微孔滤膜(0.45μm)。色谱柱：Alltech Altimma C₁₈(250mm×4.5mm，5μm)；Waters Symmetry C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；Phenomenex Gemini C₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；制备色谱柱：BECHMAN UL TRAPREP C18(21.1mm×150mm，10μm)；保护拄：phenomnex C₁₈。

百两金皂苷B自制(熔点：263-265℃，薄层色谱多个展开及显色系统均显示一个斑点，采用HPLC-ELSD峰面积归一化法计算其质量浓度大于98％，符合定量分析用对照品纯度的质量要求)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水；其余试剂均为分析纯。百两金药材购买于四川省某公司，经发明人鉴定为百两金(Ardisia crispa(Thunb.)DC.A.)。

2百两金皂苷B对照品制备

将红毛走马胎粉碎，用50％～80％的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，用水和30％乙醇冲洗除杂，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析，以体积比为70∶30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，用相应流动相溶解结晶物使成饱和溶液，上清液注入制备型高效液相色谱仪分离纯化；色谱条件：C₁₈柱；流动相：体积比为60∶40～68∶32的甲醇-水；检测波长：205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，即得。

将制得的百两金皂苷B对照品采用高分辨质谱(HR-FAB-MS)给出精确分子量：m/z1097.5432[M+Na]，对应分子式为：C₅₃H₈₆O₂₂Na(分子量计算值为：1097.5509)；其碳、氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

本发明制备的虎舌红素B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定，其质量分数均大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。

3方法优化

3.1蒸发光散射检测器参数优化

其主要参数有漂移管温度和气体流速，以5℃为递增值，考察漂移管温度在70℃～120℃条件下同一供试品溶液百两金皂苷B的峰高和噪声情况，结果显示漂移管温度为95℃时，其信噪比较佳。另一方面，以步长0.2L·min^-1，考察了气体流速从1.2～2.4L·min^-1时对响应值和噪声的影响，结果发现气体流速降低，其响应值增高，但噪声也随之增加，其信噪比在2.0L·min^-1时较佳。

3.2提取方法与溶剂优化

供试品溶液提取方法比较了回流与超声的提取效果，结果差异不大，故确定为更简便的超声提取法。提取溶剂考察了水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、乙醇等对百两金中百两金皂苷B的提取效果，结果以50％和70％的甲醇或乙醇较佳，从成本和安全考虑，确定为50％乙醇提取。

3.3提取时间优化

供试品溶液提取时间考察了30min、45min、60min、75min、90min的提取效果，结果15个测定结果的RSD为1.9％，总的趋势是随超声时间的延长，含量逐渐增加，但60min后差异很小。最终确定的前处理方法是以50％乙醇为溶剂，超声提取60min。

4测定方法

4.1色谱条件与系统适用性试验

固定相为十八烷基硅烷健合硅胶(Alltech Altimma C₁₈(250mm×4.5mm，5μm))；流动相为甲醇-水(65∶35)；柱温：30℃；蒸发光散射检测器的漂移管温度：95℃；气体流速：2.0L·min^-1；理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000。

4.2对照品溶液的制备

精密称取百两金皂苷B对照品16.21mg，于50mL量瓶中，加50％甲醇适量，超声(功率300W，频率40kHz)使溶解，相同溶剂稀释至刻度，摇匀，即得，。

4.3供试品溶液的制备

取百两金药材粉末(过三号筛)0.4g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入50％乙醇50mL，密塞，称定重量，超声(功率300W，频率40kHz)处理60分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

4.4测定方法

分别精密吸取百两金皂苷B对照品溶液5μL、20μL；百两金供试品溶液5～10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

5方法学验证

5.1线性范围

分别精密吸取白两金皂苷B对照品溶液(0.324mg·mL^-1)2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μL注入液相色谱仪，测定峰面积值，以进样量的对数(X)为横坐标，峰面积对数(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程：Y＝1.5441X+11.912，r＝0.9998。结果显示，百两金皂苷B的进样量在0.81μg～6.48μg范围内呈良好的线性关系。

5.2仪器精密度试验

取百两金皂苷B对照品溶液，在上述色谱条件下进样10μL测定峰面积，重复进样6次，测得平均峰面积为943761，RSD为0.81％，表明仪器精密度良好。

5.3稳定性试验

取同一百两金供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、8h进样10μL，测定百两金皂苷B的峰面积，测得平均峰面积的RSD为1.32％，表明供试品溶液在8h内稳定。

5.4重复性试验

取同一批百两金药材粉末，平行操作6份，按照4项下的测定方法制备样品溶液并测定，用外标两点法对数方程计算含量，结果平均含量为58.7mg·g^-1，RSD为1.1％，表明重复性良好。

5.5加样回收率试验

减量称取已知含量的百两金药材粉末0.1g，精密称定，置25mL量瓶中，平行操作6份，分别以样品百两金皂苷B质量的1∶1比例精密加入对照品溶液(610.2μg·mL^-1)10.0mL，用50乙醇稀释至刻度，按照4项下的方法操作，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n＝6)

5.6耐用性考察

耐用性试验考察了三根不同品牌和长度的C₁₈柱对样品的测定，均获得满意的效果；其柱温在25℃～35℃范围变化，测定结果均良好；流动相中甲醇∶水的比例变化在60∶40～68∶32范围内调整，除保留时间变化外，其余不影响测定结果，说明本方法耐用性良好。

6样品测定

取不同批号百两金药材粉末0.4g，精密称定，各平行操作三份；另取不同浓度乙醇提取的百两金干燥浸膏粉0.05g、提取精制样品0.03g，精密称定，各平行操作三份；均分别按照4项下的方法测定并计算百两金皂苷B的质量分数，结果见表2。

表2 百两金药材或其提取物*中百两金皂苷B的测定结果(n＝3)

*备注：提取精制样品指醇提浸膏粉经过大孔吸附树脂和/或硅胶柱纯化处理。

Claims (5)

1.一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定百两金药材或其提取物中百两金皂苷B含量的检测方法，其特征在于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶40～68∶32的甲醇-水为流动相；蒸发光散射检测器检测；理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000；其主要步骤还包括对照品和样品溶液制备、进样分析测定并计算。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述百两金皂苷B对照品采用如下方法自制：将红毛走马胎粉碎，用50％～80％的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，用水和30％乙醇冲洗除杂，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析，以体积比为70∶30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，用相应流动相溶解结晶后注入制备型高效液相色谱仪分离纯化；色谱条件：C₁₈柱；流动相：体积比为60∶40～68∶32的甲醇-水；检测波长：205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，鉴定结构并检测纯度，即得。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为80℃～110℃；气体流速为1.6～2.4L·min^-1。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述百两金药材或其提取物的供试品溶液是用50％～70％的甲醇或乙醇水溶液提取制备。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述采用HPLC-ELSD法测定百两金皂苷B含量包括如下步骤及优化条件：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为65∶35的甲醇-水为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000。

对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.3mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。

供试品溶液制备取百两金药材粉末(过三号筛)0.4g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入50％乙醇50mL，密塞，称定重量，超声(功率300W，频率40kHz)处理60分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤或离心，取续滤液或上清液，即得；

测定方法分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL；供试品溶液5～10μL；注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。