CN110346463A - 一种岗梅根药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 - Google Patents

一种岗梅根药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种岗梅根药HPLC‑ELSD指纹图谱的建立方法，所述建立方法包括以下步骤：(1)对照品的制备；(2)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)药材HPLC‑ELSD指纹图谱测定条件的建立及测定。上述岗梅根药材HPLC‑ELSD指纹图谱确认了17个共有峰，通过对照品，对其中10个主要色谱峰进行了明确的化学指认，其中9个为新化合物，以此建立了岗梅根药材HPLC‑ELSD特征指纹图谱。该指纹图谱的建立方法专属性强、操作简便，且具有良好的精密度、重现性和稳定性，可较全面地反映岗梅根药材化学组成的整体特征，可应用于岗梅根药材的真伪和品质鉴别，能有效地控制岗梅根药材的质量。

Description

一种岗梅根药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法
技术领域：
本发明涉及中药材的质量控制方法，具体涉及一种岗梅根药材的HPLC-ELSD指纹图谱建立方法。
背景技术：
岗梅根是冬青属植物梅叶冬青Ilex asprella(Hook.etArn.)Champ.ex Benth.的干燥根。广泛分布于广东、广西和海南等地。性凉、味苦、甘。具有清热解毒、生津止渴等功效，可用于治疗感冒发热、肺热咳嗽、咽喉肿痛等疾病。化学成分研究表明，岗梅根中主要含有三萜及其苷类、苯丙素类和甾醇类等化学成分，其中三萜皂苷类化合物是其主要和特征性成分(杜冰曌等，中国中药杂志，2017，42(1)：12-20；祁银德等，亚太传统医药，2009，5(3)：29-32；Wang L et al.Carbohydrate Research，2012，349：39-43；Lei Y，etal.Chemistry&Biodiversity，2014，11(5)：767-775.)。现代药理研究表明，岗梅根具有抗炎、抗病毒、降血脂和抗肿瘤等药理活性(杜冰曌等，中国中药杂志，2017，42(1)：12-20；祁银德等，亚太传统医药，2009，5(3)：29-32；全国中草药汇编编写组，全国中草药汇编[M](上册).北京：人民卫生出版社1996；辛晓芳等，时珍国医国药，2015，26(1)：196-198；Kashiwada Y，et al.Journal of Natural Products，1993，56(12)：2077-2082；Zhou M，gtal.Planta Medica，2012，78(15)：1702-1705.)。
岗梅根是一种岭南地区习用的中草药，也是凉茶中常用的主要成分之一，应用极其广泛。如双梅喉片、梅翁退热片、山地岗感冒颗粒、金梅感冒片、广东凉茶颗粒和王老吉等。岗梅根的来源复杂，与同属植物容易混淆(周红等，中国药学杂志，2015，17(50)：1500-1504)，造成其市售药材品种的品质参差不齐。广东省中药材标准2009版(第一册)也仅对其进行简单的植物性状、粉末以及对照药材的薄层鉴别，尚无含量测定项和指纹图谱项，缺乏有效的质量控制方法，无法为其安全使用提供有效保障。缘于岗梅根药材的物质基础不明确，限制了其质量控制方法地建立。因此，本发明在本课题组对化学成分进行深入研究的基础之上(Wang L，et αl.Carbohydrate Research，2012，349：39-43.蔡艳等，中草药，2010，41(9)：1426-1429)，对岗梅根的特征指纹图谱进行研究，以期通过特征指纹图谱来对药材质量进行控制，为临床用药的安全、有效提供准确可靠的依据。
发明内容
本发明提供一种岗梅根药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法。具体包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取对照品岗梅皂苷A、岗梅皂苷B、岗梅皂苷C、岗梅皂苷D、岗梅皂苷E、岗梅皂苷F、岗梅皂苷G、岗梅皂苷H、岗梅皂苷I和岗梅皂苷J适量，分别用30～90％甲醇溶解各稀释成浓度为0.01～0.1mg/mL的溶液，滤过，即得；
其中岗梅皂苷A、岗梅皂苷B、岗梅皂苷C、岗梅皂苷D、岗梅皂苷E、岗梅皂苷F、岗梅皂苷G、岗梅皂苷H、岗梅皂苷I和岗梅皂苷J为如下结构式的化合物：
(2)供试品溶液的制备
精密称取岗梅根药材细粉，置具塞锥形瓶，精密加入60～80％甲醇，浸泡，超声处理，放至室温，微孔滤膜滤过，然后用60～80％甲醇定容，摇匀，即得。
(3)采用HPLC-ELSD色谱法测定
将步骤(2)的供试品溶液进样分析，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
柱温：20～50℃；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸体积百分比为0.01～0.5％的甲酸、乙酸或三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脱；
检测器：蒸发光散射检测器。
其中步骤(3)中所述的梯度洗脱，洗脱程序按如下体积浓度配置进行：
0分钟时，流动相A的体积百分比为20％、流动相B体积百分比为80％；
10分钟时，流动相A的体积百分比为26％、流动相B体积百分比为74％；
26分钟时，流动相A的体积百分比为26％、流动相B体积百分比为74％；
34分钟时，流动相A的体积百分比为31％、流动相B体积百分比为69％；
46分钟时，流动相A的体积百分比为33％、流动相B体积百分比为67％；
58分钟时，流动相A的体积百分比为38％、流动相B体积百分比为62％；
66分钟时，流动相A的体积百分比为38％、流动相B体积百分比为62％；
68分钟时，流动相A的体积百分比为45％、流动相B体积百分比为55％；
75分钟时，流动相A的体积百分比为50％、流动相B体积百分比为50％；
80分钟时，流动相A的体积百分比为50％、流动相B体积百分比为50％。
其中步骤(3)中的色谱条件还包括：流速：0.8～1.2mL/min；进样量：10～30μL；蒸发光散射检测器的漂移管温度：90～110℃；气体流速：2.0～3.0L/min；增益值：1～4。
进一步的，步骤(3)中所述的流速为1mL/min，进样量为20μL，蒸发光散射检测器的漂移管温度为100℃，气体流速为2.5L/min，增益值为1。
进一步的，步骤(3)中所述的色谱柱为Waters XBridge C18，其规格为4.6mm×250mm，5.0μm。步骤(3)中所述柱温为35℃。
进一步的，步骤(3)中所述流动相B为0.1％三氟乙酸-水溶液或0.4％甲酸-水溶液或0.6％乙酸-水溶液。
本发明更优选进行共有峰指认，所述指纹图谱中有17个共有峰，5号峰岗梅皂苷B为参照峰，图谱总长度为80分钟，其中选自以下一种或多种共有峰进行指认：4号峰为岗梅皂苷A、5号峰为岗梅皂苷B、6号峰为岗梅皂苷C、7号峰为岗梅皂苷J、8号峰为岗梅皂苷D、9号峰为岗梅皂苷E、10号峰为岗梅皂苷F、11号峰为岗梅皂苷G、12号峰为岗梅皂苷H和14号峰为岗梅皂苷I。
优选对以下共有峰进行指认：4号峰为岗梅皂苷A、5号峰为岗梅皂苷B、6号峰为岗梅皂苷C、7号峰为岗梅皂苷J、8号峰为岗梅皂苷D、9号峰为岗梅皂苷E、10号峰为岗梅皂苷F、11号峰为岗梅皂苷G、12号峰为岗梅皂苷H和14号峰为岗梅皂苷I。
本发明的岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的建立方法，应用于岗梅根药材的真伪鉴别、基源鉴别和质量控制。
本发明进一步优选在步骤(1)对照品溶液的制备之前，还包括对照品的制备。
所述对照品的制备包括如下步骤：
取干燥的岗梅根，粉碎，加入10～20倍体积的30～95％乙醇渗漉/回流提取三次，合并提取液并减压浓缩得粗提物。粗提物经D101大孔树脂柱层析，乙醇-水系统(0∶100～95∶5)梯度洗脱，收集30～75％乙醇部位。30～75％乙醇部位回收至干，经硅胶柱层析(200-300目)，氯仿-甲醇系统(90∶10～50∶50)梯度洗脱，得18个主流分(Fr.1～Fr.18)。Frs.7、9和11经反复ODS柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析分离纯化，得到10个化合物。采用波谱学的方法鉴定了这些化合物的结构(见下图)，分别为岗梅皂苷A、岗梅皂苷B、岗梅皂苷C、岗梅皂苷D、岗梅皂苷E、岗梅皂苷F、岗梅皂苷G、岗梅皂苷H、岗梅皂苷I和岗梅皂苷J，其中岗梅皂苷A-岗梅皂苷I等9个化合物为新化合物。
岗梅皂苷A～岗梅皂苷J的化学结构式
本发明进一步优选供试品溶液的制备过程为：
精密称取岗梅根药材细粉，置50mL具塞锥形瓶，精密加入60～80％甲醇，浸泡20～30min，超声处理40～80min，放至室温，微孔滤膜滤过，然后用60～80％甲醇定容，摇匀，即得。
上述岗梅根药材HPLC-ELSD指纹图谱建立方法得到的HPLC-ELSD指纹图谱中有17个共有峰，其中10个主要色谱峰得到明确的化学指认，分别为4(岗梅皂苷A)、5(岗梅皂苷B)、6(岗梅皂苷C)、7(岗梅皂苷J)、8(岗梅皂苷D)、9(岗梅皂苷E)、10(岗梅皂苷F)、11(岗梅皂苷G)、12(岗梅皂苷H)、14(岗梅皂苷I)等色谱峰。5号峰为岗梅皂苷B参照峰，图谱总长度为80分钟，具体如下：
1号峰，保留时间为7.88分钟，相对保留时间为0.44；
2号峰，保留时间为11.67分钟，相对保留时间为0.65；
3号峰，保留时间为13.14分钟，相对保留时间为0.73；
4号峰为岗梅皂苷A，保留时间为15.78分钟，相对保留时间为0.87；
5号峰为岗梅皂苷B，保留时间为18.07分钟，相对保留时间为1.00；
6号峰为岗梅皂苷C，保留时间为25.39分钟，相对保留时间为1.41；
7号峰为岗梅皂苷J，保留时间为26.40分钟，相对保留时间为1.46；
8号峰为岗梅皂苷D，保留时间为32.43分钟，相对保留时间为1.79；
9号峰为岗梅皂苷E，保留时间为39.88分钟，相对保留时间为2.21；
10号峰为岗梅皂苷F，保留时间为42.21分钟，相对保留时间为2.34；
11号峰为岗梅皂苷G，保留时间为45.33分钟，相对保留时间为2.51；
12号峰为岗梅皂苷H，保留时间为46.24分钟，相对保留时间为2.56；
13号峰，保留时间为59.95分钟，相对保留时间为3.32；
14号峰为岗梅皂苷I，保留时间为63.41分钟，相对保留时间为3.51；
15号峰，保留时间为64.41分钟，相对保留时间为3.56；
16号峰，保留时间为72.33分钟，相对保留时间为4.00；
17号峰，保留时间为76.04分钟，相对保留时间为4.21；
本发明是在对岗梅根的总提物进行系统化学成分研究，并通过HPLC-ELSD法鉴定了岗梅根主要色谱峰结构的基础上，提供了一种可指认岗梅根多指标成分的HPLC-ELSD特征指纹图谱的构建方法。所述HPLC-ELSD特征指纹图谱建立方法专属性强、操作简便、具有优异的精密度、重复性和稳定性，可较全面地检测岗梅根中主要和特征性化学成分，从而建立科学合理的岗梅根药材的HPLC-ELSD特征指纹图谱，进而更全面准确地监控岗梅根药材的质量，完整、准确地评价岗梅根的安全性、有效性、稳定性和质量均一性。
附图说明：
图1为实施例1的岗梅皂苷A的ESI-MS图；
图2为实施例1的岗梅皂苷A的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1的岗梅皂苷A的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图4为实施例1的岗梅皂苷B的ESI-MS图；
图5为实施例1的岗梅皂苷B的核磁共振氢谱图；
图6为实施例1的岗梅皂苷B的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图7为实施例1的岗梅皂苷C的ESI-MS图；
图8为实施例1的岗梅皂苷C的核磁共振氢谱图；
图9为实施例1的岗梅皂苷C的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图10为实施例1的岗梅皂苷J的ESI-MS图；
图11为实施例1的岗梅皂苷J的核磁共振氢谱图；
图12为实施例1的岗梅皂苷J的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图13为实施例1的岗梅皂苷D的ESI-MS图；
图14为实施例1的岗梅皂苷D的核磁共振氢谱图；
图15为实施例1的岗梅皂苷D的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图16为实施例1的岗梅皂苷E的ESI-MS图；
图17为实施例1的岗梅皂苷E的核磁共振氢谱图；
图18为实施例1的岗梅皂苷E的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图19为实施例1的岗梅皂苷F的ESI-MS图；
图20为实施例1的岗梅皂苷F的核磁共振氢谱图；
图21为实施例1的岗梅皂苷F的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图22为实施例1的岗梅皂苷G的ESI-MS图；
图23为实施例1的岗梅皂苷G的核磁共振氢谱图；
图24为实施例1的岗梅皂苷G的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图25为实施例1的岗梅皂苷H的ESI-MS图；
图26为实施例1的岗梅皂苷H的核磁共振氢谱图；
图27为实施例1的岗梅皂苷H的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图28为实施例1的岗梅皂苷I的ESI-MS图；
图29为实施例1的岗梅皂苷I的核磁共振氢谱图；
图30为实施例1的岗梅皂苷I的DEPT-135和核磁共振碳谱图；
图31为实施例2的15批岗梅根的HPLC-ELSD色谱叠加图；
图32为实施例2的岗梅根药材的HPLCELSD标准指纹图谱；
图33为实施例2的对照品与岗梅根药材供试品溶液主要色谱峰对比的色谱叠加图
图34为实施例2的可化学指认的岗梅根HPLC-ELSD特征指纹图谱。
具体实施方式：
以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步的阐述。
供试品来源为广东和广西产的15批岗梅根药材
仪器：Bruker AV-400/500/600FT型核磁共振仪；Agilent 6210LC/MSD TOF型质谱仪；Agilent 1260分析型高效液相色谱仪；
色谱测定中所用到的试剂：甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
实施例1岗梅根主要化学成分的分离纯化以及结构鉴定。
干燥的岗梅根，粉碎，加入10倍量的70％乙醇回流提取三次，合并提取液并减压浓缩得粗提物，粗提物经适量水混悬经D101大孔树脂柱层析，乙醇-水系统(0∶100～95∶5)梯度洗脱，收集70％乙醇部位共91g。70％乙醇部位经硅胶柱层析(200-300目)，氯仿-甲醇系统(90∶10～50∶50)梯度洗脱，得18个主流分(Fr.1～Fr.18)。Fr.7、9和11经反复ODS柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析分离纯化，分别得化合物1～化合物10。
采用波谱学的方法鉴定岗梅根中含有的化学成分分别为岗梅皂苷A、岗梅皂苷B、岗梅皂苷C、岗梅皂苷J、岗梅皂苷D、岗梅皂苷E、岗梅皂苷F、岗梅皂苷G、岗梅皂苷H、岗梅皂苷I；其中，指纹图谱可化学指认化合物的光谱和理化数据如下：
化合物1：无定形粉末，(c1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 925.3564[M-H]-(C41H65O19S2，calcd 925.3567)，HR-ESI-MS图如图1所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.26(1H，d，J＝8.2Hz，H-1″)，5.46(1H，br s，H-12)，4.71(1H，d，J＝7.4Hz，H-1′)，3.18(1H，overlapped，H-3)，0.96(3H，d，J＝6.4Hz，H-30)，1.68(3H，s，H-27)，1.37(3H，s，H-29)，1.18(3H，s，H-23)，1.13(3H，s，H-26)，0.94(3H，s，H-24)，0.85(3H，s，H-25)。化合物1的核磁共振氢谱图如图2所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：177.0(C-28)，138.7(C-13)，127.5(C-12)，106.3(C-1′)，95.7(C-1″)，88.6(C-3)，73.2(C-19)，29.6(C-29)，28.0(C-23)，24.2(C-27)，17.3(C-26)，16.8(C-24)，15.9(C-30)，15.5(C-25)，化合物1的核磁共振碳谱图如图3所示。结合化合物1的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表1所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物1为(3β，19α，20β)-3-O-(3，4-O-disulfo)-β-D-xylopyranosyl 3，19-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosylester，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷A。
化合物2：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 925.3564[M-H]-(C41H65O19S2，calcd 925.3567)，HR-ESI-MS图如图4所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.16(1H，d，J＝8.2Hz，H-1″)，5.45(1H，br s，H-12)，4.70(1H，d，J＝7.3Hz，H-1′)，3.19(1H，dd，J＝11.7，4.5Hz，H-3)，1.00(3H，d，J＝6.5Hz，H-30)，1.60(3H，s，H-27)，1.32(3H，s，H-29)，1.18(3H，s，H-23)，1.07(3H，s，H-26)，0.92(3H，s，H-24)，0.81(3H，s，H-25)，化合物2的核磁共振氢谱图如图5所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：176.8(C-28)，139.0(C-13)，128.1(C-12)，106.3(C-1′)，95.5(C-1″)，88.5(C-3)，72.3(C-19)，27.8(C-23)，26.7(C-29)，24.3(C-27)，17.1(C-26)，16.6(C-24)，16.4(C-30)，15.3(C-25)，化合物2的核磁共振碳谱图如图6所示。结合化合物2的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表1所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物2为3-O-(3，4-O-disulfo)-β-D-xylopyranosyl3β，19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷B。
表1岗梅皂苷A和岗梅皂苷B的碳氢数据归属
化合物3：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 889.3871[M-H]-(C42H65O18S，calcd 889.3897)，HR-ESI-MS图如图7所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.16(1H，d，J＝8.1Hz，H-1″)，5.44(1H，br s，H-12)，4.97(1H，d，J＝7.7Hz，H-1′)，3.28(1H，dd，J＝11.7，4.5Hz，H-3)，1.00(3H，d，J＝6.5Hz，H-30)，1.62(3H，s，H-27)，1.32(3H，s，H-29)，1.21(3H，s，H-23)，1.05(3H，s，H-26)，0.92(3H，s，H-24)，0.77(3H，s，H-25)，化合物3的核磁共振氢谱图如图8所示。。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：176.9(C-28)，138.8(C-13)，128.0(C-12)，106.0(C-1′)，95.5(C-1”)，89.0(C-3)，72.2(C-19)，27.7(C-23)，26.5(C-29)，24.1(C-27)，17.0(C-26)，16.5(C-24)，16.3(C-30)，15.2(C-25)，化合物3的核磁共振碳谱图如图9所示。结合化合物3的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表2所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物3为3-O-(3-O-sulfo)-β-D-glucopyranosiduronicacid 3β，19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷C。
表2岗梅皂苷C的碳氢数据归属
化合物4：无定形粉末，香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 845.3991[M-H]-，HR-ESI-MS图如图10所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.26(1H，d，J＝8.0Hz，H-1”)，5.46(1H，br s，H-12)，4.72(1H，d，J＝7.4Hz，H-1′)，3.29(1H，dd，J＝11.7，4.4Hz，H-3)，1.68(3H，s，H3-27)，1.36(3H，s，H3-29)，1.26(3H，s，H3-23)，1.13(3H，s，H3-26)，0.96(3H，s，H3-24)，0.95(3H，d，J＝7.3Hz，H3-30)，0.87(3H，s，H3-25)，化合物4的核磁共振氢谱图如图11所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：177.0(C-28)，138.8(C-13)，127.6(C-12)，107.1(C-1′)，95.8(C-1″)，88.7(C-3)，73.3(C-19)，29.7(C-29)，28.2(C-23)，24.3(C-27)，17.4(C-26)，16.9(C-24)，16.0(C-30)，15.6(C-25)，化合物4的核磁共振碳谱图如图12所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物4为岗梅皂苷J，为一已知化合物。
化合物5：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 845.3987[M-H]-(C41H65O16S，calcd 845.3999)，HR-ESI-MS图如图13所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.20(1H，d，J＝8.0Hz，H-1″)，5.48(1H，br s，H-12)，4.69(1H，d，J＝7.2Hz，H-1′)，3.27(1H，dd，J＝12.0，4.4Hz，H-3)，1.01(3H，d，J＝6.4Hz，H-30)，1.63(3H，s，H-27)，1.34(3H，s，H-29)，1.24(3H，s，H-23)，1.10(3H，s，H-26)，0.93(3H，s，H-24)，0.84(3H，s，H-25)，化合物5的核磁共振氢谱图如图14所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：176.7(C-28)，138.9(C-13)，128.0(C-12)，107.2(C-1′)，95.5(C-1″)，88.6(C-3)，72.2(C-19)，27.8(C-23)，26.6(C-29)，24.2(C-27)，17.1(C-26)，16.6(C-24)，16.3(C-30)，15.3(C-25)，化合物5的核磁共振碳谱图如图15所示。结合化合物5的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表3所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物5为3-O-(3-O-sulfo)-α-L-arabinopyranosyl 3β，19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷D。
化合物6：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 887.4092[M-H]-(C43H67O17S，calcd 887.4104)，HR-ESI-MS图如图16所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.17(1H，d，J＝8.2Hz，H-1″)，5.45(1H，br s，H-12)，4.69(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′)，3.12(1H，dd，J＝11.7，4.5Hz，H-3)，1.01(3H，d，J＝6.2Hz，H-30)，1.62(3H，s，H-27)，1.32(3H，s，H-29)，1.01(3H，s，H-23)，1.07(3H，s，H-26)，0.79(3H，s，H-24)，0.79(3H，s，H-25)，化合物6的核磁共振氢谱图如图17所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：176.8(C-28)，139.0(C-13)，128.1(C-12)，104.2(C-1′)，95.5(C-1″)，88.8(C-3)，72.3(C-19)，27.6(C-23)，26.7(C-29)，24.3(C-27)，17.1(C-26)，16.4(C-24)，16.4(C-30)，15.2(C-25)，化合物6的核磁共振碳谱图如图18所示。结合化合物6的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表3所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物6为3-O-(2-O-acety-3-O-sulfo)-α-L-arabinopyranosyl 3β，19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷E。
表3岗梅皂苷D和岗梅皂苷E的碳氢数据归属
化合物7：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 887.4115[M-H]-C43H67O17S，calcd 887.4104)，HR-ESI-MS图如图19所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.19(1H，d，J＝7.9Hz，H-1″)，5.40(1H，br s，H-12)，4.69(1H，d，J＝7.7Hz，H-1′)，3.11(1H，overlapped，H-3)，0.89(3H，d，J＝6.5Hz，H-30)，1.62(3H，s，H-27)，1.31(3H，s，H-29)，1.06(3H，s，H-26)，0.97(3H，s，H-23)，0.77(3H，s，H-24)，0.77(3H，s，H-25)，化合物7的核磁共振氢谱图如图20所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：176.8(C-28)，138.5(C-13)，127.2(C-12)，104.0(C-1′)，95.4(C-1″)，88.8(C-3)，73.0(C-19)，29.3(C-29)，27.5(C-23)，23.9(C-27)，17.1(C-26)，16.3(C-24)，15.6(C-30)，15.1(C-25)，化合物7的核磁共振碳谱图如图21所示。结合化合物7的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表4所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物7为(3β，19α，20β)-3-O-(2-O-acety-3-O-sulfo)-β-D-xylopyranosyl 3，19-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosylester，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷F。
化合物8：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 887.4119[M-H]-(C43H67O17S，calcd 887.4104)，HR-ESI-MS图如图22所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：6.16(1H，d，J＝7.9Hz，H-1″)，5.44(1H，br s，H-12)，4.70(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′)，3.10(1H，dd，J＝11.8，4.3Hz，H-3)，1.00(3H，d，J＝9.2Hz，H-30)，1.60(3H，s，H-27)，1.31(3H，s，H-29)，1.05(3H，s，H-26)，0.98(3H，s，H-23)，0.77(3H，s，H-24)，0.77(3H，s，H-25)，化合物8的核磁共振氢谱图如图23所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：176.6(C-28)，138.6(C-13)，127.7(C-12)，103.8(C-1′)，95.2(C-1″)，88.6(C-3)，72.0(C-19)，27.2(C-23)，26.4(C-29)，23.9(C-27)，16.8(C-26)，16.1(C-24)，16.1(C-30)，14.9(C-25)，化合物8的核磁共振碳谱图如图24所示。结合化合物8的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表4所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物8为3-O-(2-O-acety-3-O-sulfo)-β-D-xylopyranosyl 3β，19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosylester，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷G。
表4岗梅皂苷F和岗梅皂苷G的碳氢数据归属
化合物9：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 743.3319[M-H]-(C36H55O14S，calcd 743.3318)，HR-ESI-MS图如图25所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：5.52(1H，br s，H-12)，5.20(1H，d，J＝8.2Hz，H-1′)，4.25(1H，m，H-23a)，4.21(1H，dd，J＝11.9，4.5Hz，H-3)，3.67(1H，m，H-23b)，1.08(3H，d，J＝6.6Hz，H-30)，1.65(3H，s，H-27)，1.38(3H，s，H-29)，1.04(3H，s，H-26)，0.90(3H，s，H-24)，0.86(3H，s，H-25)，化合物9的核磁共振氢谱图如图26所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：180.5(C-28)，139.7(C-13)，127.8(C-12)，105.7(C-1′)，82.3(C-3)，72.4(C-19)，64.1(C-23)，26.9(C-29)，24.5(C-27)，17.0(C-26)，16.6(C-30)，15.9(C-25)，13.4(C-24)，化合物9的核磁共振碳谱图如图27所示。结合化合物9的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表5所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物9为3-O-(3-O-sulfo)-β-D-glucopyranosiduronicacid 3β，19α，23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷H。
化合物10：无定形粉末，(c 1.0，MeOH)；香草醛-浓硫酸反应显紫红色(薄层显色)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，其化学结构为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z 727.3363[M-H]-(C36H55O13S，calcd 727.3369)，HR-ESI-MS图如图28所示。
1H NMR(500MHz，pyridine-d5)δH：5.35(1H，br s，H-12)，5.00(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，3.30(1H，dd，J＝11.7，4.4Hz，H-3)，1.08(3H，d，J＝6.6Hz，H-30)，1.71(3H，s，H-27)，1.41(3H，s，H-29)，1.25(3H，s，H-23)，1.01(3H，s，H-26)，0.94(3H，s，H-24)，0.77(3H，s，H-25)，化合物10的核磁共振氢谱图如图29所示。
13C NMR(125MHz，pyridine-d5)δC：180.5(C-28)，139.7(C-13)，127.8(C-12)，106.4(C-1′)，89.1(C-3)，72.5(C-19)，27.9(C-23)，26.9(C-29)，24.5(C-27)，17.0(C-26)，16.7(C-24)，16.6(C-30)，15.2(C-25)，化合物10的核磁共振碳谱图如图30所示。结合化合物10的2D NMR数据，可对其碳氢全归属如表5所示。
根据以上光谱数据鉴定化合物10为3-O-(3-O-sulfo)-β-D-glucopyranosiduronic acid 3β，19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid，为一新的三萜皂苷类化合物，并命名为岗梅皂苷I。
表5岗梅皂苷H和岗梅皂苷I的碳氢数据归属
实施例2岗梅根药材的HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法及其指纹图谱(1)、供试品溶液的制备
岗梅根药材粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，置50mL具塞锥形瓶，精密加入75％甲醇20mL，密塞，称定重量，浸泡30min，超声处理(功率1000W，频率40KHz)30min，取出，放至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，再用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
(2)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用法测定(HPLC-ELSD)
将步骤(2)的供试品溶液进行高校液相色谱法分析，色谱条件为：
色谱柱：Waters XBridge C18(4.6mm×250mm，5.0μm)；
柱温：35℃；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸体积百分比为0.1％的三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序见表6所示：
表6岗梅根HPLC的洗脱程序
流速：1.0mL/min；
进样量：20μL；
蒸发光散射检测器的漂移管温度：100℃；
气体流速：2.5L/min；
增益值：1。
采用上述方法检测岗梅根药材供试品溶液，得到各自的色谱图，将供试品溶液的色谱图采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件进行分析，生成岗梅根药材的对照HPLC-ELSD指纹图谱(R)，确定了17个共有峰。各共有峰的保留时间和相对保留时间见表7.
表7岗梅根HPLC-ESD指纹图谱共有峰的保留时间和相对保留时间
注：“S”为参照峰。
本发明所检测的15批岗梅根药材，编号S1～S15，来源如表8所示
表8 15批岗梅根药材来源
按照步骤(1)制备供试品溶液，采用步骤(2)的色谱条件进行测定，所得的15批岗梅根药材的指纹图谱如图31所示。
分析所得15批岗梅根指纹图谱的检测数据，计算各特征峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，检测结果见表9和10。
将15批岗梅根的HPLC-ELSD指纹图谱，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件进行分析，采用中位数法，时间窗0.1，以5号峰为参照峰，经多点校正自动匹配后生成岗梅根的HPLC-ELSD标准指纹图谱。所述岗梅根的HPLC-ELSD标准指纹图谱如图32所示。
所述的采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件模拟生成岗梅根的标准HPLC-ELSD指纹图谱为常规方法进行操作：将15批岗梅根的HPLC-ELSD色谱图的AIA数据文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件进行分析，采用中位数法，时间窗0.1，以5号峰为参照峰，经多点校正自动匹配后生成岗梅根的HPLC-ELSD标准指纹图谱，确定了17个共有峰。
实施例3岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱的测定方法
(1)、供试品溶液的制备
岗梅根药材粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，置50mL具塞锥形瓶，精密加入25％甲醇20mL，密塞，称定重量，浸泡30min，超声处理(功率1000W，频率40KHz)30min，取出，放至室温，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，再用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
(2)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用法测定(HPLC-ELSD)
将步骤(1)的供试品溶液进样分析，色谱条件为：
色谱柱：Waters XBridge C18(4.6mm×250mm，5.0μm)；
柱温：25℃；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸体积百分比为0.01％的三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；
流速：0.8mL/min；
进样量：25μL；
蒸发光散射检测器的漂移管温度：110℃；
气体流速：3.0L/min；
增益值：1。
采用上述方法检测岗梅根，得到色谱图，其它步骤同实施例2。
实施例4岗梅根HPLC-ELSD特征指纹图谱的测定方法
(1)、供试品溶液的制备
岗梅根药材粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，置50mL具塞锥形瓶，精密加入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率1000W，频率40KHz)30min，取出，放至室温，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，再用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
(2)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用法测定(HPLC-ELSD)
将步骤(1)的供试品溶液进样分析，色谱条件为：
色谱柱：Waters XBridge C18(4.6mm×250mm，5.0μm)；
柱温：30℃；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸体积百分比为0.05％的三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；
流速：1.0mL/min；
进样量：20μL；
蒸发光散射检测器的漂移管温度：105℃；
气体流速：2.5L/min；
增益值：1。
采用上述方法检测岗梅根，得到色谱图，其它步骤同实施例2。
实施例5岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱的测定方法
(1)、供试品溶液的制备
岗梅根药材粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，置50mL具塞锥形瓶，精密加入75％甲醇30mL，密塞，称定重量，浸泡30min，超声处理(功率1000W，频率40KHz)40min，取出，放至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，再用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
(2)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用法测定(HPLC-ELSD)
将步骤(1)的供试品溶液进样分析，色谱条件为：
色谱柱：Waters XBridge C18(4.6mm×250mm，5.0μm)；
柱温：35℃；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸体积百分比为0.1％的三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；
流速：1.2mL/min；
进样量：15μL；
蒸发光散射检测器的漂移管温度：100℃；
气体流速：2.0L/min；
增益值：1。
采用上述方法检测岗梅根，得到色谱图，其它步骤同实施例2。
实施例6岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱的测定方法
(1)、供试品溶液的制备
岗梅根药材粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，置50mL具塞锥形瓶，精密加入甲醇40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率1000W，频率40KHz)60min，取出，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，再用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
(2)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用法测定(HPLC-ELSD)
将步骤(1)的供试品溶液进样分析，色谱条件为：
色谱柱：Waters XBridge C18(4.6mm×250mm，5.0μm)；
柱温：40℃；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸体积百分比为0.1％的三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
蒸发光散射检测器的漂移管温度：95℃；
气体流速：2.5L/min；
增益值：1。
采用上述方法检测岗梅根，得到色谱图，其它步骤同实施例2。
实施例7岗梅根药材HPLC-ELSD指纹图谱建立方法的验证
1、仪器精密度试验
取编号为S9的岗梅根药材，按照实施例2中岗梅根供试样品的步骤(2)制备成供试品溶液，连续进样6次，并采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，测定结果见表11和表12。
表11 S9岗梅根药材HPLC指纹图谱仪器精密度试验的相对保留时间计算结果(n＝6)
注：“S”为参照峰。
表12 S9岗梅根药材HPLC指纹图谱仪器精密度试验的相对峰面积计算结果(n＝6)
注：“S”为参照峰。
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致(RSD＜5％)，以第一次进样所得的指纹图谱为参照，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求，见表13。
表13仪器精密度试验的相似度计算结果(n＝6)
2、方法重复性试验
取编号为S9的岗梅根药材，按照实施例2中岗梅根供试样品的步骤(2)平行制备6份供试品溶液，采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，测定结果见表14和表15。
表14 S9岗梅根药材HPLC指纹图谱重复性试验的相对保留时间计算结果(n＝6)
注：“S”为参照峰。
表15 S9岗梅根药材HPLC指纹图谱重复性试验的相对峰面积计算结果(n＝6)
注：“S”为参照峰。
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致(RSD＜5％)，以第一次进样所得的指纹图谱为参照，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求，见表16。
表16方法重复性试验的相似度计算结果(n＝6)
4、样品稳定性试验
取编号为S9的岗梅根药材，按照实施例2中岗梅根供试样品的步骤(2)制备成供试品溶液，分别于制备后的第0、2、4、8、12、24小时后，采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，测定结果见表17和表48。
表17 S9岗梅根药材HPLC指纹图谱稳定性试验的相对保留时间计算结果(n＝6)
注：“S”为参照峰。
表18 S9岗梅根药材HPLC指纹图谱稳定性试验的相对峰面积计算结果(n＝6)
注：“S”为参照峰。
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致(RSD＜5％)，以第一次进样所得的指纹图谱为参照，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求，见表19。
表19稳定性试验的相似度计算结果(n＝6)
以上结果表明，供试品溶液在24h内稳定性良好。
以上方法学考察结果表明，用本方法建立岗梅根的HPLC-ELSD指纹图谱，仪器精密度、方法重复性和样品稳定性均较好，能够准确测定该药材的指纹图谱。
实施例8岗梅根药材HPLC-ELSD指纹图谱相似度的考察
1、15批岗梅根的测定和HPLC-ELSD指纹图谱的获得
按照实施例2的步骤(2)制备供试品溶液，采用步骤(3)的色谱条件分别对15批岗梅根进行测定。
2、岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱相似度的考察
以实施例2中的岗梅根HPLC-ELSD标准指纹图谱为参照，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”计算每批岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱的相似度。结果如表20所示。
表20 15批岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱相似度考察结果
由表20可以看出，15批岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱与岗梅根HPLC-ELSD标准指纹图谱的相似度均大于0.879，表明所述岗梅根HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法重复性好，相似度高。
实施例9岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱
(1)、对照品溶液的制备
精密称取岗梅皂苷A、岗梅皂苷B、岗梅皂苷C、岗梅皂苷4、岗梅皂苷J、岗梅皂苷D、岗梅皂苷E、岗梅皂苷F、岗梅皂苷G、岗梅皂苷H、岗梅皂苷I，分别用70％甲醇溶解，各自稀释成浓度为0.01～0.1mg/mL的溶液，滤过，即得。
对照品经HPLC-ELSD检测，按峰面积归一化法测定纯度如表21所示：
表21对照品纯度
注：“S”为参照峰
(2)、供试品溶液的制备
岗梅根药材干燥粉碎，过60目筛，精密称取粉末2.0g，置50mL具塞锥形瓶，精密加入75％甲醇20mL，密塞，称定重量，浸泡30min，超声处理(功率1000W，频率40KHz)30min，取出，放至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，再用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
采用实施例2中的方法检测岗梅根药材供试品溶液和对照品溶液，得到各自的色谱图，对比供试品溶液和对照品溶液色谱峰的保留时间。对照品溶液与岗梅根药材供试品溶液主要色谱峰对比的色谱叠加图如图33所示。以5号峰岗梅皂苷B为参照，确定了各色谱峰的相对保留时间(见表22)。
表22岗梅根HPLC-ESD指纹图谱共有峰的保留时间和相对保留时间
注：“S”为参照峰。
因此，建立了岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱，其中10个主要色谱峰得到明确的化学指认，分别为4号峰(岗梅皂苷A)、5号峰(岗梅皂苷B)、6号峰(岗梅皂苷C)、7号峰(岗梅皂苷J)、8(岗梅皂苷D)、9(岗梅皂苷E)、10(岗梅皂苷F)、11(岗梅皂苷G)、12(岗梅皂苷H)和14(岗梅皂苷I)。以5号峰岗梅皂苷B为参照峰，4号峰(岗梅皂苷A)的相对保留时间为0.87；5号峰(岗梅皂苷B)的相对保留时间为1.00；6号峰(岗梅皂苷C)的相对保留时间为1.41；7号峰(岗梅皂苷J)的相对保留时间为1.46；8号峰(岗梅皂苷D)的相对保留时间为1.79；9号峰(岗梅皂苷E)的相对保留时间为2.21；10号峰(岗梅皂苷F)的相对保留时间为2.34；11号峰(岗梅皂苷G)的相对保留时间为2.51；12号峰(岗梅皂苷H)的相对保留时间为2.56；14号峰(岗梅皂苷I)的相对保留时间为3.51。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变性和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取对照品岗梅皂苷A、岗梅皂苷B、岗梅皂苷C、岗梅皂苷D、岗梅皂苷E、岗梅皂苷F、岗梅皂苷G、岗梅皂苷H、岗梅皂苷I和岗梅皂苷J适量，分别用30～90％甲醇溶解各稀释成浓度为0.01～0.1mg/mL的溶液，滤过，即得；
其中岗梅皂苷A、岗梅皂苷B、岗梅皂苷C、岗梅皂苷D、岗梅皂苷E、岗梅皂苷F、岗梅皂苷G、岗梅皂苷H、岗梅皂苷I和岗梅皂苷J为如下结构式的化合物：
(2)供试品溶液的制备
精密称取岗梅根药材细粉，置具塞锥形瓶，精密加入60～80％甲醇，浸泡，超声处理，放至室温，微孔滤膜滤过，然后用60～80％甲醇定容，摇匀，即得。
(3)采用HPLC-ELSD色谱法测定
将步骤(2)的供试品溶液进样分析，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
柱温：20～50℃；
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸体积百分比为0.01～0.5％的甲酸、乙酸或三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脱；
检测器：蒸发光散射检测器。
2.根据权利要求1所述的一种岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述的梯度洗脱，洗脱程序按如下体积浓度配置进行：
0分钟时，流动相A的体积百分比为20％、流动相B体积百分比为80％；
10分钟时，流动相A的体积百分比为26％、流动相B体积百分比为74％；
26分钟时，流动相A的体积百分比为26％、流动相B体积百分比为74％；
34分钟时，流动相A的体积百分比为31％、流动相B体积百分比为69％；
46分钟时，流动相A的体积百分比为33％、流动相B体积百分比为67％；
58分钟时，流动相A的体积百分比为38％、流动相B体积百分比为62％；
66分钟时，流动相A的体积百分比为38％、流动相B体积百分比为62％；
68分钟时，流动相A的体积百分比为45％、流动相B体积百分比为55％；
75分钟时，流动相A的体积百分比为50％、流动相B体积百分比为50％；
80分钟时，流动相A的体积百分比为50％、流动相B体积百分比为50％。
3.根据权利要求1所述的一种岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中的色谱条件还包括：
流速：0.8～1.2mL/min；
进样量：10～30μL；
蒸发光散射检测器的漂移管温度：90～110℃；
气体流速：2.0～3.0L/min；
增益值：1～4。
4.根据权利要求3所述的一种岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述的流速为1mL/min，进样量为20μL，蒸发光散射检测器的漂移管温度为100℃，气体流速为2.5L/min，增益值为1。
5.根据权利要求1所述的一种岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述的色谱柱为Waters XBridge C18，其规格为4.6mm×250mm,5.0μm。
6.根据权利要求1所述的一种岗梅根药材特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述柱温为35℃。
7.根据权利要求1所述的一种岗梅根药材特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述流动相B为0.1％三氟乙酸-水溶液或0.4％甲酸-水溶液或0.6％乙酸-水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种岗梅根药材特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱中有17个共有峰，5号峰岗梅皂苷B为参照峰，图谱总长度为80分钟，其中选自以下一种或多种共有峰进行指认：4号峰为岗梅皂苷A、5号峰为岗梅皂苷B、6号峰为岗梅皂苷C、7号峰为岗梅皂苷J、8号峰为岗梅皂苷D、9号峰为岗梅皂苷E、10号峰为岗梅皂苷F、11号峰为岗梅皂苷G、12号峰为岗梅皂苷H和14号峰为岗梅皂苷I。
9.根据权利要求8所述的一种岗梅根药材特征指纹图谱的建立方法，其特征在于，对以下共有峰进行指认：4号峰为岗梅皂苷A、5号峰为岗梅皂苷B、6号峰为岗梅皂苷C、7号峰为岗梅皂苷J、8号峰为岗梅皂苷D、9号峰为岗梅皂苷E、10号峰为岗梅皂苷F、11号峰为岗梅皂苷G、12号峰为岗梅皂苷H和14号峰为岗梅皂苷I。
10.权利要求1-9任意一项所述的岗梅根药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的建立方法，应用于岗梅根药材的真伪鉴别、基源鉴别和质量控制。
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