CN101904890A - 桔梗活性部位的制备、应用及质量控制检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了桔梗活性部位的一种制备方法和新用途，具体提供其在抗肿瘤药物中的应用；本发明同时涉及通过植物化学分离手段从桔梗活性部位中分离出两个新三萜皂苷类化合物(化合物A和B)及其制备方法；本发明还提供了以桔梗皂苷D、远志皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E对桔梗质量控制的检测方法，该方法重现性好，能较全面的评价桔梗、桔梗提取物及其活性部位的质量。

Description

桔梗活性部位的制备、应用及质量控制检测方法

技术领域

本发明涉及医药领域和色谱检测方法，具体涉及桔梗活性部位的制备及新化合物的提取分离方法及化学结构鉴定；桔梗活性部位在抗肿瘤药物中的应用；高效液相色谱法测定桔梗提取物及活性部位中的单体皂苷含量的方法。

背景技术

桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC为桔梗科植物多年生草本植物，其药用部位为根，为我国常用的四十种中药之一，广泛分布于我国，朝鲜半岛和日本，桔梗性味苦、辛、平，归肺经，有开宣肺气，祛痰排脓之功效。常用于外感咳嗽、咳痰不清、咽喉肿痛、胸闷腹胀、痢疾腹痛、血淤水肿、癃闭等症，为常用中药。国内外研究表明，桔梗中有效成分为桔梗皂苷，桔梗具有抗炎、祛痰、保肝、降血糖、抑制脂肪吸收、抗氧化、抗菌等广泛的药理作用。桔梗作为一种药食两用的植物，无毒副作用，因此其具有广阔的开发前景。目前国内外对桔梗总皂苷在抗肿瘤方面的研究为一片空白。

目前，对桔梗的质量控制多以桔梗皂苷为研究指标。2005版《中国药典》采用重量法测定桔梗中总皂苷的含量，规定药材中总皂苷含量不得低于6％，该方法操作繁琐，测量误差较大，重现性差。目前国内对桔梗单体皂苷的含量测定，多以桔梗皂苷D为指标成分。桔梗中皂苷成分种类较多，同一样品中各单体成分的含量差异较大。采用单体皂苷对桔梗皂苷进行质量分析，作为评价桔梗质量或进行良种选育的指标，缺乏整体性和科学性。同时，国内外在对桔梗皂苷D的含量测定中，桔梗皂苷D与桔梗皂苷D₂未完全分离，导致其含量测定的不准确(朱丹妮，郅慧，高山林.HPLC-ElSD法测定桔梗中桔梗皂苷D的含量.植物资源与环境学报，2001，10(4)：11-13.张振凌，杨海玲，张红伟等.炮制对桔梗不同饮片中桔梗皂苷D含量的影响.中成药，2008，30(4)：554-556.郭丽，肖永庆，张村等.桔梗药材中桔梗皂苷D的定性定量方法研究.北京中医药大学学报，2007，30(3)：200-209.黄樱，史春蕾，刘墨祥等.HPLC-ELSD法测定桔梗饮片中8种桔梗皂苷的含量.扬州大学学报(自然科学版)，2008，11(4)：41-43.)。

本发明通过对桔梗总皂苷的系统研究，药理筛选发现桔梗总皂苷对多种癌细胞具有显著的抑制作用，在此基础上，又对桔梗总皂苷中单体成分进行了研究，分离得到了桔梗皂苷D、远志皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E及两种新的三萜皂苷，并利用分离得到的八种单体皂苷建立定量分析方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供安全有效毒副作用低的抗肿瘤效果显著的中药活性部位，并提供一种制备方法。

本发明目的之二是提供一种具有抗肿瘤活性的药物，以桔梗提取物和可药用辅料组成。

本发明目的之三是对桔梗活性部位中单体成分进行研究，以期寻找抗肿瘤活性强的单体皂苷。

本发明目的之四是提供两种新的桔梗皂苷化合物(化合物A，化合物B)。

               R₁      R₂

化合物A        Glc-    Glc-

化合物B        Glc-    Xyl-

本发明的目的之五是提供制备这两种化合物(化合物A，化合物B)的方法。

本发明的目的之六是提供三种全面的准确的控制桔梗提取物及活性部位的质量控制检测方法。

本发明的技术方案依此包含如下方法步骤：

1、桔梗活性部位的制备

(1)、将桔梗生药粉碎后，用3-5倍水或含水有机溶剂回流或超声提取；每次回流提取时间为1-3小时，超声提取时间为0.5-2小时，提取液减压浓缩得浸膏；

提取中所用含水有机溶剂是指含不同量的水的甲醇、乙醇、异丙醇等。

(2)、将步骤(1)中所得浸膏用去离子水将浸膏溶解，采用3-10倍有机溶剂萃取；弃去有机溶剂层，将水层减压浓缩，除去有机溶剂。

所用有机溶剂指乙酸甲酯、乙酸乙酯、石油醚、汽油等。

(3)、将步骤(2)所得水溶液通过大孔树脂，用去离子水洗脱至流出液无色，采用不同浓度乙醇梯度洗脱，收集50-95％乙醇洗脱液，减压浓缩，完全去除乙醇和水，得桔梗提取物。

不同浓度乙醇指50-95％的乙醇；大孔树脂指AB-8或D-101型树脂。

所得桔梗活性部位中可测总皂苷成分应大于50％

所得桔梗活性部位中应含有如下成分：

桔梗皂苷D、远志皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂。

2、本发明中皂苷单体化合物的提取分离步骤和方法如下：

取步骤1中所得桔梗提取物213g，按附图1所示进行柱色谱层析分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检测，将相同馏分合并，得八份馏分Fr1-Fr8。Fr7(氯仿-甲醇，2∶1)浓缩至干，得浸膏(30g)，浸膏经中压柱色谱，采用氯仿甲醇梯度洗脱，氯仿-甲醇(5∶1)部分经制备HPLC得化合物A(10mg)，B(7.5mg)，氯仿-甲醇(2∶1)部分经制备HPLC得化合物1(35mg)，2(21mg)，氯仿-甲醇(1∶1)部分，其中24-28部分经制备HPLC得化合物3(18mg)，4(24mg)，5(17.8m)，6(101mg)。Fr8(氯仿-甲醇，0∶1，8g)溶于甲醇后，溶液中加入石油醚-丙酮(1∶1)，白色沉淀析出，过滤得沉淀，经制备HPLC得化合物7(43mg)，8(40mg)。

对于色谱分离过程中使用的不同填料，采取的不同条件，具体为：(1)大孔树脂层析：采用常压玻璃柱，以AB-8或D101大孔树脂为填料，柱床所用大孔树脂质量为样品的5-100倍，采用不同浓度乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，直到流出液中不含样品为止，每次增加20％的比例进行下一步洗脱，洗脱液减压浓缩至干；(2)硅胶柱层析：采用常压玻璃柱，以100-400目正相硅胶为填料，柱床所用硅胶量于样品比为5-100倍，采用氯仿-甲醇(100∶1-0∶1)不同体积比的梯度洗脱，收集洗脱液，直到流出液中不含样品为止，增大极性，进行下一步洗脱，洗脱液减压浓缩至干；(3)中压柱色谱：采用常压玻璃柱，以300-400目硅胶为填料，柱床所用硅胶量于样品比为5-50倍，采用氯仿-甲醇(100∶1-0∶1)不同体积比的梯度洗脱，收集洗脱液，直到流出液中不含样品为止，增大极性，进行下一步洗脱，洗脱液减压浓缩至干；(4)高效液相制备色谱：采用不锈钢制备柱，填料为C18或C30反相硅胶，检测波长为200-210nm，采用不同比例甲醇水为流动相，甲醇水的比例为：10∶90-70∶30，按色谱峰进行收集。

所得两个新化合物结构鉴别如下：

化合物A白色粉末，

(c＝0.63，MeOH)。ESI-MS给出分子离子峰m/z827[M-H]^-，碎片峰m/z 665[M-162-H]^-，m/z 503[M-162-162-H]^-表示该化合物结构中含有两个六碳糖。HR-ESI-MS：m/z 827.4432([M-H]^-，Calcd for C₄₂H₆₇O₁₆：827.4424)，结合¹H-NMR和¹³C-NMR推断该化合物的分子式为C₄₂H₆₈O₁₆。IR(KBr)：3380cm^-1(-OH)，1677cm^-1(-C＝O)，1648cm^-1(C＝C)。

¹H-NMR(600MHz，pyridine-d₅)显示两个糖端基氢信号δ5.03(d，J＝7.8Hz)和δ5.08(d，J＝7.8Hz)，七组甲基氢信号δ1.00(3H，s)，1.17(3H，s)，1.21(3H，s)，1.26(3H，s)，1.31(3H，s)，1.34(3H，s)，1.35(3H，s)及一个双键氢信号δ5.57(br.s.)。¹³C-NMR显示该化合物中有42个碳原子信号，其中12个碳原子为糖基中碳原子。结合DEPT谱，化合物中甲基的化学位移分别为δ16.2，17.3，18.1，18.4，26.9，28.8，30.1；两个不饱和碳原子δ123.2和142.6，两个糖的端基碳原子δ106.5和108.1，一个羰基碳原子δ179.6，以上信息显示该化合物为齐墩果酸型三萜皂苷类化合物。结合HMQC谱对苷元中碳、氢原子的化学位移进行了归属(表1)。

HMBC谱图，H₃-29(δ1.21)和H₃-30(δ1.35)分别与C-18(δ55.6)，C-19(δ34.6)，C-21(δ79.0)，C-22(δ44.9)有远程相关；H-22α(δ2.42)和H-22β(δ1.26)与C-21(δ79.0)相关。H-22α(δ2.42)与C-16(δ83.4)相关，H-15(δ1.70，2.25)分别与C-16(δ83.4)和C-26(δ26.9)相关；H₃-23(δ1.17)和H₃-24(δ1.31)分别与C-3(δ81.4)远程相关，可推断，δ81.4位于C-3位。

NOESY谱图显示，H-16(δ4.34)与H-26(δ1.00)有NOE增益，可判断化合物中16位为α构型，H-21(δ3.42)与H-18(δ0.94)；H-21(δ3.42)与H-22β(δ1.26)有NOE增益，表明C-21构型为β构型，该部分构型与化合物prosapogenin一致。以上数据表明化合物A为2β，3β，16α，21β-tetrahydroxyolean-12-ene-28-oic acid化合物。

化合物A酸水解，所含糖TLC检测与标准品对照鉴定为葡萄糖，测定水解单糖的旋光值(

c＝0.21，H₂O)，与标准品对照鉴定为D型葡萄糖。¹H-NMR谱中糖的两个端基氢偶合常数为7.8Hz，因此化合物中糖的构型为β型。结合TOCSY谱，对单糖中各个碳原子的化学位移进行了归属(表1)。HMBC谱显示，H-1′(δ5.03)和H-1″(δ5.08)分别与C-3(δ81.4)及C-16(δ83.3)有相关，表明化合物中糖分别连在C-3位和C-16位。同时，NOESY谱图中，H-1′(δ5.03)与H-3(δ4.13)；H-1″(δ5.08)与H-16(δ4.34)有NOE增益近一步证明化合物中糖分别位于C-3位和C-16位。

根据以上数据综合解析，该化合物A的结构确定为3-O-β-D-glucopyranosyl-16-O-β-D-glucopyranosyl-2β，3β，16α，21β-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid，为一个新化合物。

化合物B白色粉末，

(c＝0.43，MeOH)。ESI-MS给出分子离子峰m/z 797[M-H]^-，二级质谱碎片m/z 635[M-162-H]^-及m/z 503[M-162-132-H]^-表明化合物中存在一个六碳糖和一个五碳糖。根据HR-ESI-MS m/z：797.4321[M-H]^-(Calcd for C₄₁H₆₅O₁₅：797.4318)和¹H-NMR和¹³C-NMR综合解析推断该化合物的分子式为C₄₁H₆₆O₁₅。化合物酸水解后，所得单糖经TLC检测并与标准品比对，鉴定为葡萄糖与木糖；采用制备TLC纯化水解液中两个单糖，测定单糖旋光值并与标准品比对，两个糖分别为D-葡萄糖(

c＝0.21，H₂O)与D-木糖(

c＝0.12，H₂O)；¹H-NMR谱中糖的两个端基氢偶合常数为7.5Hz，表明化合物中D-葡萄糖与D-木糖的为β构型。

结合HMQC和HMBC谱解析，化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR得以归属(表1)。与化合物A的¹H-NMR和¹³C-NMR的对比发现，化合物B具有与化合物A相同的苷元。综合TOSCY和HMQC谱解析，糖残基的¹H-NMR和¹³C-NMR得以归属(表1)。HMBC谱显示δ4.86(H-1′，Glucose)及δ5.01(H-1″，Xylose)分别与δ81.5(C-3)和δ83.4(C-16)远程相关，表明葡萄糖和木糖分别连在苷元的C-3位与C-16位。

综上所述，该化合物的结构推断3-O-β-D-glucopyranosyl-16-O-β-D-xylopyranosyl-2β，3β，16α，21β-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid，化合物B为一个新化合物。

化合物1-8，通过MS，IR，NMR与文献报道比对，其结构分别为桔梗皂苷D、远志皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E。

表1化合物A和B的¹H-和¹³C-NMR数据

3、本发明桔梗活性部位对不同的癌细胞具有很好的抑制活性。

4、桔梗皂苷的质量控制方法之一，所述方法应包括如下步骤：

(1)、色谱条件  色谱柱为Zorbax SB-Phenyl(4.6×150mm，5μm)，柱温为20-35℃；流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，10％～20％；15～30min，20％～23％；30～45min，23％～23％；45～60min，23％～60％；60～65min，60％～100％；流速为1mL/min。理论塔板数按桔梗皂苷D计算应不低于6000。

(2)、检测器  检测器为蒸发光检测器，雾化温度为30-50℃，漂移管温度为40-120℃；紫外检测器，检测波长200-210nm。

(3)、供试品溶液制备  取干燥桔梗药材粉末，粉碎，过四十目筛，称定适量药材粉末1.00g，置三角瓶中，加入50倍量的50-70％甲醇，超声提取半小时，过滤，反复3次，合并三次滤液，减压浓缩蒸干，残留物用50％甲醇溶解，并转移至10ml容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤后即得。

(4)、精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

5、桔梗皂苷的质量控制方法之二，所述方法应包括如下步骤：

(1)、色谱柱为Develosil RPAQUEOUS C30(4.6×250mm，5μm)柱，柱温为20-35℃，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，5％～20％；15～25min，20％～25％；25～40min，25％～30％；40～60min，30％～40％；60～65min，30％～100％；流速为1mL/min。

(2)、检测器及样品的制备同方法4。

6、桔梗皂苷的质量控制方法之三，所述方法应包括如下步骤：

(1)、色谱柱为Zorbax XDB-C18(4.6×150mm，5μm)柱，柱温为20-35℃，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，5％～20％；15～30min，22％～26％；30～40min，26％～22％；40～60min，22％～28％；流速为1mL/min。

(2)、检测器及样品的制备同方法4。

本发明经分析方法验证，其精密度、重现性、回收率和稳定性符合中国药典2005版一部附录《中药质量标准分析方法验证指导原则》的要求。

有益效果：本发明采用高效液相色谱发测定桔梗中八种皂苷的含量，重现性好，能够全面的评价桔梗及其制品的质量。

附图说明：

图1：桔梗单体皂苷的制备流程

图2：化合物A的HR-ESI-MS谱图

图3：化合物A的¹H-NMR谱；

图4：化合物A的¹³C-NMR谱；

图5：化合物A的HMBC谱；

图6：化合物A的HMQC谱；

图7：化合物A的NOESY谱；

图8：化合物A的TOCSY谱；

图9：化合物A的IR图谱；

图10：化合物B的HR-ESI-MS谱图；

图11：化合物B的¹H-NMR谱；

图12：化合物B的¹³C-NMR谱；

图13：化合物B的HMBC谱；

图14：化合物B的HMQC谱；

图15：化合物B的TOCSY谱；

图16：混合对照品溶液色谱图(峰序号：1-去芹菜糖桔梗皂苷E；2-桔梗皂苷E；3-去芹菜糖桔梗皂苷D₃；4-桔梗皂苷D₃；5-去芹菜糖桔梗皂苷D₂；6-桔梗皂苷D₂；7-桔梗皂苷D；8-远志皂苷D₂)；

图17：桔梗样品色谱图(ELSD)；

图18：桔梗样品色谱图(UV)。

具体实施方式：

下面所实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例一：桔梗活性部位的提取分离

取桔梗科植物桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC)的根(4.0kg)为原料，用5倍量95％乙醇回流提取3次，每次2小时，减压回收溶剂，得浸膏900g，将浸膏用水溶解后，置于分液漏斗中，用约5L乙酸乙酯萃取，取下层水层，减压浓缩去除水溶液中少量乙酸乙酯，将水溶液通过AB-8大孔树脂柱(3kg)，用去离子水洗脱至流出液无色，而后采用95％乙醇洗脱。95％醇洗脱部分浓缩至干，即得桔梗活性部位(213g)。

实施例二：单体桔梗皂苷分离纯化

取实施例一中所得桔梗提取物213g，按附图1所示进行柱色谱层析分离，用氯仿-甲醇不同比例(100∶1-0∶1)梯度洗脱，TLC检测，将相同馏分合并，得八份馏分Fr1-Fr8。Fr7(氯仿-甲醇，2∶1)浓缩至干，得浸膏(30g)，浸膏经中压柱色谱，采用氯仿甲醇梯度洗脱，氯仿-甲醇(5∶1)部分经制备HPLC{检测波长210nm，C30(Develosil rpaqueous PackedФ20×100mm，Nomura Chemistry Ltd.，Japan)}得化合物A(10mg)，B(7.5mg)，氯仿-甲醇(2∶1)部分经制备HPLC得化合物1(35mg)，2(21mg)，氯仿-甲醇(1∶1)部分，其中24-28流分经制备HPLC得化合物3(18mg)，4(24mg)，5(17.8m)，6(101mg)。Fr8(氯仿-甲醇，0∶1，8g)溶于甲醇后，溶液中加入石油醚-丙酮(1∶1)，白色沉淀析出，过滤得沉淀，经制备HPLC得化合物7(43mg)，8(40mg)。

化合物1-8，通过MS，IR，NMR与文献报道比对，其结构分别为桔梗皂苷D、远志皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E。化合物A为3-O-β-D-glucopyranosyl-16-O-β-D-glucopyranosyl-2β，3β，16α，21β-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid，其分子式为C₄₂H₆₈O₁₆，白色无定形粉末，化合物A为新化合物；化合物B为3-O-β-D-glucopyranosyl-16-O-β-D-xylopyranosyl-2β，3β，16α，21β-tetra hydroxyolean-12-en-28-oic acid.，其分子式为C₄₁H₆₆O₁₅，白色无定形粉末，化合物B为新化合物。

实施例三：桔梗总皂苷抗肿瘤活性筛选

取样品液给小鼠体内腹腔注射，同时设置对照组，连续给药7天后，分别无菌取脾，制备脾细胞悬液，作MTT法淋巴细胞转化试验，记录OD值。

(1)、小鼠脾细胞悬液的制备：将小鼠拉颈处死，用75％乙醇浸泡1-2分钟，在超净台内无菌取脾，置盛有Hank’s液的平皿中于钢网上剪碎用针芯轻轻研磨，即成单细胞悬液，离心10分钟，弃上清液后洗两次，进行细胞计数，细胞沉淀用c-RPMI-1640细胞培养液调至107/ml浓度。

(2)、MTT法淋巴细胞增殖反应试验：新鲜分离的107/ml小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，再根据实验设计加入刺激剂(conA)100μl/孔，每个样品设三个平行孔并设对照孔(仅加c-1640)，每孔总体积200ul，然后将培养板置于37℃的5％CO₂培养箱中培养48小时。取出培养板，每孔吸弃上清液100μl，各孔加5mg/ml MTT 10ul，继续培养4小时，取出培养板，各孔加10％SDS裂解液100μl，放培养箱中过夜，于570nm处比色测定OD值。

抑制肿瘤细胞生长率＝(1-实孔测定值/对照孔测定值)×100％

结果表明桔梗总皂苷对不同的癌细胞具有很好的抑制活性。结果如下(表2)：

表2桔梗总皂苷对不同的癌细胞抑制活性

实施例四：质量控制方法的建立

1、实验材料与方法

(1)、仪器与试药

液相色谱仪：美国Waters公司高效液相色谱仪(Waters^TM600Delta四元泵；Waters^TM600Controller系统控制器；Waters 2996DAD检测器；Waters 2420ELSD检测器；Waters Empower色谱工作站)。其它仪器：KQ-100E型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；V3003旋转蒸发仪(上海振捷)；分析天平(梅特勒，AB135-S)；超纯水仪。

试剂：甲醇(分析纯)：北京化工厂；水为超纯水；乙腈(色谱纯)：B&J ACS，SK Chemicals。

对照品分别为桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、远志皂苷D₂，以上对照品均从桔梗药材中分离得到，其结构经光谱确证；HPLC分析，面积归一化法计算，各对照品纯度在98％以上。

(2)、色谱条件

色谱柱为Zorbax SB-Phenyl(4.6×150mm，5μm)，柱温为25℃；检测器为ELSD，雾化温度为30.0℃，漂移管温度为60.0℃，载气压力为30psi，增益值设置为20；流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，10％～20％；15～30min，20％～23％；30～45min，23％～23％；45～60min，23％～60％；60～65min，60％～100％；流速为1mL/min。

(4)、对照品溶液的配制

将各对照品放置在真空干燥器中，干燥24小时，分别精密称定各对照品适量，定容至10ml容量瓶中，配制成含各对照品各400μg/ml的混合标准液。精密量取混合标准液25，50，150，250，500，750，1000，1500，1750，2000μl，分别置于2ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。配制成十个不同浓度梯度的对照品溶液。

(5)、供试品溶液的制备

取干燥桔梗药材粉末，称定适量(精确至0.01g)，置三角瓶中，加入50倍量的70％甲醇，超声提取半小时，过滤，反复3次，合并三次滤液，减压浓缩蒸干，残留物用50％甲醇溶解，并转移至10ml容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤后即得。

2、方法学考察

(1)、线性关系

各浓度对照品溶液分别进样10μl，进样两次，选取其中八个浓度，以其峰面积为纵坐标(y)，对照品浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。线性方程，相关系数R²及线性范围见表2：

表2桔梗中单体皂苷线性方程

(2)、精密度

取同一浓度供试品溶液，连续进样六次，测定各化合物峰面积，计算其相对标准偏差，测定其日内精密度；将供试品溶液放置于4℃冰箱中冷藏保存，分别在第1，2，3，4，5，6天进样，测定其日间精密度，结果见表3：

表3精密度测定结果(n＝6)

(3)、重复性

称取同一药材粉末六份各1.00g，按供试品溶液制备方法，平行制备六份。

精密吸取上述供试品溶液20μl，进样，计算各待测成分在药材中的平均含量(μg/g)及相对标准偏差，结果见表4：

表4重复性测定结果(n＝6)

(4)、回收率

精密称定三份已知含量的药材粉末0.50g，分别放入锥形瓶中，分别按高、中、低比例将各单体对照品溶液加入锥形瓶中，样品中单体皂苷含量、各待测组分加入的量、供试品中测定的结果(检测量)、回收率(％)及RSD值(％)见表5：

表5回收率测定结果

3、样品含量测定

取干燥桔梗药材粉末，称定适量(精确至0.01g)，置三角瓶中，加入50倍量的70％甲醇，超声提取半小时，过滤，反复三次，合并三次滤液，减压浓缩蒸干，残留物用50％甲醇溶解，并转移至10ml容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤后即得。精密量取20μl供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例五：质量控制方法的建立

采用紫外检测器，检测波长为203nm，色谱条件，样品溶液制备，测定方法同实施例四，样品紫外色谱图见附图18。

实施例六：质量控制方法的建立

采用Develosil RPAQUEOUS C30(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，5％～20％；15～25min，20％～25％；25～40min，25％～30％；40～60min，30％～40％；60～65min，30％～100％；流速为1mL/min。样品测定方法同实施例四。

实施例七：质量控制方法的建立

采用Zorbax XDB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，5％～20％；15～30min，22％～26％；30～40min，26％～22％；40～60min，22％～28％；流速为1mL/min。样品测定方法同实施例四。

Claims (12)

1.一种具有抗肿瘤活性的桔梗活性部位的制备方法，其特征在于该方法和步骤如下：

取干燥的中药桔梗药材，粉碎，加入0-95％乙醇或甲醇回流或超声提取三次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩回收溶剂，用去离子水稀释溶解，乙酸乙酯萃取，水层减压浓缩除去残留乙酸乙酯，将所得浓缩液用去离子水稀释，经大孔树脂，依次用水，50％-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液浓缩即得。

2.一种从权利要求1所述的活性部位中分离得到的两个新皂苷，其结构式及特征如下：

           R₁        R₂

化合物A    -Glc      -Glc

化合物B    -Glc      -Xyl

化合物A为3-O-β-D-glucopyranosyl-16-O-β-D-glucopyranosyl-2β，3β，16α，21β-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid，其分子式为C₄₂H₆₈O₁₆，白色无定形粉末，化合物A为新化合物；化合物B为3-O-β-D-glucopyranosyl-16-O-β-D-xylopyranosyl-2β，3β，16α，21β-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid.，其分子式为C₄₁H₆₆O₁₅，白色无定形粉末，化合物B为新化合物。

3.权力要求1所述的桔梗活性部位，其特征在其应含有桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、远志皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂。

4.权利要求2所述的两个新的单体皂苷制备方法，包括以下步骤：

干燥桔梗药材粉末，用0-95％乙醇回流提取，提取液减压浓缩，回收溶剂得浸膏，用去离子水溶解，乙酸乙酯萃取，水层经AB-8或D-101大孔树脂，依次用去离子水，50-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩得浸膏，浸膏经反复硅胶柱色谱层析，中压柱层析，最后经制备高效液相纯化，得新化合物A和B。

5.权利要求1所述的桔梗活性部位在制备肿瘤治疗药物中的应用。

6.权利要求1所述的桔梗活性部位在制备辅助治疗肿瘤的保健品中的应用。

7.一种桔梗、桔梗提取物及活性部位的质量控制检测方法，其特征在于采用高效液相测定桔梗中桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、远志皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂的含量的方法。

8.权利要求7所述的质量控制检测方法，其特征在于采用蒸发光检测器或紫外检测器为检测器。

9.权利要求7所述的质量控制检测方法，其特征在于以桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、远志皂苷D₂、桔梗皂苷D₃、去芹菜糖桔梗皂苷D₃、桔梗皂苷D₂、去芹菜糖桔梗皂苷D₂为检测对象。

10.权利要求7所述的桔梗皂苷的质量控制检验方法之一，其特征在于由以下步骤组成：

(1)、色谱条件  色谱柱为Zorbax SB-Phenyl(4.6×150mm，5μm)，柱温为20-35℃；流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，10％～20％；15～30min，20％～23％；30～45min，23％～23％；45～60min，23％～60％；60～65min，60％～100％；流速为1mL/min。理论塔板数按桔梗皂苷D计算应不低于6000。

(2)、检测器  检测器为蒸发光检测器，雾化温度为30-50℃，漂移管温度为40-120℃；紫外检测器，检测波长200-210nm。

(3)、供试品溶液制备  取干燥桔梗药材粉末，粉碎，过四十目筛，称定适量药材粉末1.00g，置三角瓶中，加入50倍量的50-70％甲醇，超声提取半小时，过滤，反复3次，合并三次滤液，减压浓缩蒸干，残留物用50％甲醇溶解，并转移至10ml容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤后即得。

(4)、测定  精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

11.权利要求7所述的桔梗皂苷的质量控制检验方法之二，其特征在于由以下步骤组成：

(1)、色谱柱为Develosil RPAQUEOUS C30(4.6×250mm，5μm)柱，柱温为20-35℃，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，5％～20％；15～25min，20％～25％；25～40min，25％～30％；40～60min，30％～40％；60～65min，30％～100％；流速为1mL/min。

(2)、检测器  检测器为蒸发光检测器，雾化温度为30-50℃，漂移管温度为40-120℃；紫外检测器，检测波长200-210nm。

(3)、供试品溶液制备  取干燥桔梗药材粉末，粉碎，过四十目筛，称定适量药材粉末1.00g，置三角瓶中，加入50倍量的50-70％甲醇，超声提取半小时，过滤，反复3次，合并三次滤液，减压浓缩蒸干，残留物用50％甲醇溶解，并转移至10ml容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤后即得。

(4)、测定  精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

12.权利要求7所述的桔梗皂苷的质量控制检验方法之三，其特征在于由以下步骤组成：

(1)、色谱柱为Zorbax XDB-C18(4.6×150mm，5μm)柱，柱温为20-35℃，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：流动相为乙腈-水，梯度洗脱，乙腈变化梯度如下：0～15min，5％～20％；15～30min，22％～26％；30～40min，26％～22％；40～60min，22％～28％；流速为1mL/min。

(2)、检测器  检测器为蒸发光检测器，雾化温度为30-50℃，漂移管温度为40-120℃；紫外检测器，检测波长200-210nm。

(3)、供试品溶液制备  取干燥桔梗药材粉末，粉碎，过四十目筛，称定适量药材粉末1.00g，置三角瓶中，加入50倍量的50-70％甲醇，超声提取半小时，过滤，反复3次，合并三次滤液，减压浓缩蒸干，残留物用50％甲醇溶解，并转移至10ml容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤后即得。

(4)、测定  精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

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