CN104873563A - 桔梗茎叶皂苷的制备及在制备抗肿瘤药物和保健品中应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，主要公开了桔梗茎叶皂苷的制备方法及在制备抗肿瘤药物和保健品中的应用。经实验研究表明：该桔梗茎叶皂苷对H22移植瘤小鼠具有明显抑瘤作用，能够显著提高肿瘤小鼠机体免疫力，延长小鼠的生存时间，诱导肿瘤细胞凋亡等。因此，可以使用该提取物制备抗肿瘤药物、保健品、食品添加剂或复方制剂等。其药物或保健品可以是现有的任何剂型，如片剂，胶囊剂，粉针剂，注射剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等。

Description

桔梗茎叶皂苷的制备及在制备抗肿瘤药物和保健品中应用

技术领域

本发明主要涉及桔梗茎叶皂苷在制备抗肿瘤药物及保健品中的应用，主要对桔梗茎叶皂苷的抗肿瘤活性及应用进行申请保护；属于中药提取物的新生物活性的医药技术领域。

背景技术

肿瘤是危害人类健康最严重的一类常见病、多发病，其发病率高，死亡率也高。目前大多数的肿瘤治疗方法仍然是传统的治疗方法，比如化疗放疗，手术和综合治疗，而中药尤其是药食两用的中药作为辅助治疗，可减轻放、化疗的不良反应，同时在远期疗效方面，可提高肿瘤患者的生存质量，减少复发、转移，从而提高生存率（郑京胜，等. 药食两用中药抗癌作用及其与归经的相关性研究，海峡药学，2015, 27, 106-108）。

桔梗为桔梗科植物桔梗（Platycodon grandiflorum）的干燥根，收载于2010版《中国药典》，为我国传统的四十种大宗药材之一，主产安徽、河南、吉林、河北及内蒙古等省地^[1]。现代药理学研究表明：桔梗具有明显的抗炎、抗肿瘤、肝保护、免疫调节、抗肥胖及降血脂等多种药理作用(刘群, 等. 桔梗中三萜皂苷类成分及药理活性研究进展[J]. 吉林农业大学学报, 2013, 35, 221- 228.)。近年来，桔梗皂苷的抗肿瘤作用日益受到国内外学者的广泛关注，研究发现：桔梗皂苷主要通过线粒体介导途径及死亡受体介导途径激活Caspase级联反应，从而诱导肿瘤细胞凋亡(李伟, 等. 桔梗皂苷体外抗肿瘤活性研究, 中药药理与临床, 2009, 25, 37- 40;)。

桔梗属于多年生草本，一般种植2-3年后收获地下根，但非传统入药部位桔梗茎叶多丢弃处理，未见加以利用(王巍巍, 桔梗茎叶中皂苷类化学成分及生物活性研究, 吉林农业大学硕士学位论文, 2008)。研究发现：桔梗茎叶中含有丰富的皂苷，黄酮，多酚等，具有较强的抗氧化活性(Jeong, et al., Antioxidant activities from the aerial parts of Platycodon grandiflorum, Ho Jin Heoa, Food Chemistry, 2010, 118, 278- 282.)。从充分利用药材资源角度，应该对桔梗茎叶化学成分及药理活性做深入研究，以期为将来入药提供必要的理论基础。

发明人多年来一直从事桔梗的化学成分及生物活性研究，本发明是从同种植物不同药用部位可能具有相同药理作用角度，去新发现桔梗茎叶活性部位的制备方法及抗肿瘤活性，属于首次报道桔梗茎叶皂苷的抗肿瘤活性及在制备药物及保健品中的应用。本发明创新性的提出了桔梗茎叶皂苷的制备方法及在制备抗肿瘤药物及保健品中的应用，该制备工艺简单可行，原料廉价且容易获得，具有开发成抗肿瘤药物或保健品的潜力。

发明内容

本发明提供了桔梗茎叶皂苷在抗肿瘤药物或保健品及食品添加剂的应用。

桔梗茎叶皂苷的制备方法具有如下特征：桔梗茎叶皂苷通过如下步骤获得：干燥的桔梗茎叶样品，粉碎过40目筛，经适当的溶剂和提取方法，得到提取液，减压浓缩至干；用水混悬至无沉淀，上大孔树脂吸附柱色谱，依次用水和70%以上的乙醇进行洗脱，收集醇洗脱部分，即得桔梗茎叶皂苷。

前述的提取方法选自加压溶剂提取、回流提取、超声辅助提取、微波辅助提取等的任何一种，其优选加压溶剂提取；提取溶剂选自水，甲醇，乙醇任何一种及不同比例混合物；用于样品后续纯化处理的大孔吸附柱色谱，包括药学上能够接受的，可以用于分离的多种常规树脂，选自D101，NKA12或ADS等的任何一种。

前述的桔梗茎叶皂苷，比色法测定皂苷含量在50-99%，HPLC分析主要包含桔梗皂苷D，去芹糖桔梗皂苷D等皂苷类成分。

前述的桔梗茎叶皂苷，具有抗肿瘤作用，可以用于药物、保健品及食品添加剂中的应用。

当本发明用于上述用途时，其口服或胃肠外给药，均是安全的，在口服情况下，其可以以任何常规的形式给药，如片剂，胶囊剂，粉针剂，注射剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等。

本发明制备具有抗肿瘤作用的桔梗茎叶皂苷可以与药用载体或食品载体混合，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖，淀粉，糊精，碳酸钙，合成或天然硫酸铝，氧化镁，硬脂酸镁，碳酸氢钠，干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水，甘油，1，2-丙二醇，单糖浆，乙醇，乙二醇，聚乙二醇，山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木蜡、液体石蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。

本发明优选片剂和胶囊剂。

本发明的药物制剂组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量。

本发明所述的治疗用途是通过以下实验证明的：

本发明可以通过下面的实验例进一步说明。

实验例1. 桔梗提取物的制备方法

制备方法1：采集新鲜的桔梗茎叶，自然干燥，粉碎至40目，用30%乙醇作为提取溶剂，在密闭的容器内，调整压力为100MPa，提取3次，每次1h，提取后浓缩至无沉淀后，过NKA-12大孔树脂柱色谱，依次用水，70%乙醇洗脱，收集醇洗脱部分，浓缩至无醇味，冷冻干燥或真空干燥即得桔梗茎叶皂苷。

制备方法2：采集新鲜的桔梗茎叶，自然干燥，粉碎至40目，用水/含水的乙醇做溶剂，超声波辅助提取3次，每次2h，提取后浓缩至无沉淀后，过D101大孔树脂柱色谱，依次用水，70%乙醇洗脱，收集醇洗脱部分，浓缩至无醇味，冷冻干燥或真空干燥即得桔梗茎叶皂苷。

制备方法3：采集新鲜的桔梗茎叶，自然干燥，粉碎至40目，用水/含水的乙醇做溶剂，微波辅助提取3次，每次2h，提取后浓缩至无沉淀后，过NKA-12大孔树脂柱色谱，依次用水，70%乙醇洗脱，收集醇洗脱部分，浓缩至无醇味，冷冻干燥或真空干燥即得桔梗茎叶皂苷。

上述三种提取方法获得桔梗茎叶皂苷提取率顺序依次为加压溶剂提取（12.2%）>超声辅助提取（9.8%）>微波辅助提取（9.3%），因此，本发明优选加压溶剂提取法。

实验例2  桔梗茎叶皂苷对H22移植瘤小鼠的抑瘤作用

1.实验材料

1.1动物

雄性ICR小鼠，SPF级，5-6周龄，体重20-22g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号：SCXK（吉）2011-0004，自由饮水，适应性饲养1周后随机分成5组，进行实验。

1.2 材料、试剂与仪器

小鼠H₂₂肝癌细胞株，购自中国科学院上海细胞所，经本实验室传代并保存；注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司；ALT和AST试剂盒，购自南京建成生物工程有限公司；肿瘤坏死因子TNF-α和干扰素IFN-γ试剂盒，美国R&D公司（国内分装），购自长春百金生物技术有限公司；VD-650超净工作台，上海苏净实业有限公司；连续光谱扫描式酶标仪Spectra Max Plus 384，美国分子生物仪器公司。

1.3样品的制备

将100g干燥桔梗茎叶粉碎制成40目粗粉，加10倍量无水乙醇提取、过滤、减压浓缩回收乙醇浸膏，用水分散至无沉淀作为样品备用。将上述样品过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩洗脱液至无醇，真空冷冻干燥，即得淡黄色桔梗茎叶皂苷粉末（Saponins from the stems and leaves of Platycodon grandiflorum, PS），置于干燥器中备用。

2实验方法

2.1药物配制

称取桔梗茎叶皂苷（PS），加CMC-Na混悬至所需浓度，按10mL/kg灌胃给药。环磷酰胺CTX用生理盐水配制成所需浓度，采用腹腔注射给药形式。

2.2 H ₂₂ 皮下移植瘤模型建立

将腹水型小鼠肿瘤H₂₂细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，用含10% FBS的RPMI 1640完全培养基悬浮培养。取最佳生长状态的小鼠肿瘤H₂₂细胞，浓度调为5×10⁶/mL，以0.2 mL/只(1 ×10⁶个细胞/只) 无菌注入雄性ICR小鼠腹腔内，进行接种传代，于接种7 d 左右，小鼠腹部膨隆，出现血性腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接种。于无菌条件下抽取H₂₂ 腹水瘤小鼠的腹水，用无菌生理盐水稀释后，1500 r/ min 离心10min，洗涤细胞3次，取0.2 mL瘤细胞悬液接种到雄性ICR小鼠的右肩皮下。

2.3 动物分组及处理

ICR小鼠适应性饲养1周，接种后第2天，小鼠随机分成共5组，即空白对照组（Normal），模型组（Model），桔梗茎叶皂苷低剂量组（25mg/kg, PS-L）、高剂量（50 mg/kg, PS-H）组和环磷酰胺（CTX, 25 mg/kg）阳性对照组，每组10只。CTX采用腹腔注射方式给药，桔梗茎叶皂苷组采用灌胃方式给药，模型组和空白对照组以等量的生理盐水灌胃，每日1次，连续15 d。末次给药后禁食不禁水16 h后断颈处死，收集血液及组织，做相关分析。

2.4 计算抑瘤率和免疫器官指数

分别称取小鼠体质量、瘤质量，计算抑瘤率。并称取肝脏、胸腺、脾脏质量，计算脏器指数。眼球取血后颈椎脱臼处死，完整剥离瘤块，分离血清。

抑瘤率＝（模型组瘤质量－药物组瘤质量）／模型组瘤质量

胸腺（肝脏、脾脏）指数＝胸腺（肝脏、脾脏）质量／体质量

2.5 血清学指标及细胞因子测定

依照南京建成生物工程有限公司提供的试剂盒说明书，采用微板法检测血清中肝功能指标，包括谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）。依照试剂盒说明书利用酶联免疫法（ELISA）检测血清中肿瘤坏死因子TNF-α和干扰素IFN-γ。

2.6 肿瘤组织H&E染色

将肿瘤组织固定于10%甲醛中，常规石蜡切片，对肿瘤进行HE染色。将切片浸入二甲苯 I 、II各15min脱蜡；再依次浸入无水乙醇 I 、II各5min；95%、70%、50%乙醇各3min；蒸馏水5min；加入苏木精染色30s，然后用水轻轻冲洗返蓝，将切片依次浸于50%、70%、95%乙醇各3min脱水。加入伊红染色，随后浸于无水乙醇中5min，二甲苯 I 、II中透明，各15min。

2.7 肿瘤组织Hoechst染色

取上述肿瘤组织常规石蜡切片，对其进行Hoechst染色。染色前脱蜡处理等步骤与H&E染色前处理方法相同。将切片于蒸馏水中拿出后，用0.9%Nacl洗两次，各3min；加入hoschst33258染色5min；再用0.9%Nacl洗两次，各3min；滴加抗荧光封片液于切片上，盖上载玻片置于显微镜下观察肿瘤细胞凋亡。

2.8 统计学方法

数据应用SPSS 10.0 软件包进行处理。各项数据以Mean ±S.D. 表示，P<0.01或P<0.05具有统计学意义。

3结果

3.1对H ₂₂ 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

不同剂量的桔梗总皂苷对肿瘤H₂₂移植瘤的抑瘤作用如表1所示。与模型组相比，桔梗总皂苷低、高剂量组小鼠肿瘤H₂₂移植瘤的质量降低，生长明显受到抑制。低、高剂量组具有显著性差异（P<0.05）。

不同剂量的桔梗总皂苷对肿瘤H₂₂移植瘤的抑瘤作用如图1所示。高剂量组抑制瘤重量比低剂量组抑制瘤更显著。高剂量组中瘤生长明显受到显著抑制。

表1 桔梗茎叶皂苷对肿瘤H₂₂移植瘤小鼠肿瘤生长的影响（n=10, Mean ± S.D)

Table 1 Effect of PS on tumor growth of H₂₂-bearing mice（n=10, Mean ± S.D)

与模型组比较，^a  P＜0.05 orP<0.05; vs Model group

3.2 对H ₂₂ 荷瘤小鼠免疫器官指数的影响                                                                 

CTX是一线抗肿瘤药物，但其免疫抑制作用对机体的损伤一直饱受诟病。本实验观察了CTX和桔梗茎叶皂苷对H₂₂移植瘤小鼠肝脏、脾脏和胸腺等免疫器官指数影响。如表2所示，与模型组相比，CTX组肝指数明显升高，胸腺和脾指数显著增加，均具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，表明CTX具有一定的肝毒性，且对免疫器官具有抑制作用；给药2周后，桔梗茎叶皂苷两个剂量组肝、脾和胸腺指数接近模型组，其中肝指数显著低于CTX组，脾和胸腺指数显著高于CTX组，表明桔梗茎叶皂苷对免疫器官具有保护作用。

表2 桔梗茎叶皂苷对H₂₂移植瘤小鼠免疫器官指数的影响（n=10, Mean ± S.D)

Table 2 Effect of PS on liver/ spleen/thymus indexes of H₂₂ tumor-bearing mice（n=10, Mean ± S.D)

与模型组比较：^a P＜0.01或^a P＜0.05；与CTX组比较：^b P <0.01或^b  P＜0.05；

CTX vs Model group ^aP  <0.01 or ^a P＜0.5; PS vs CTX group ^b  P <0.01 or ^b P＜0.05

3.3对肝功能的影响

对肿瘤H₂₂移植瘤小鼠肝功能的影响如图2所示。环磷酰胺有肝毒性，与空白组比较，模型组ALT，AST指数均有所增加，其中AST显著增加且具有显著性(P＜0.01或P＜0.05）。与模型组相比，CTX组ALT指数升高，AST指数降低且具有显著性（P＜0.01或P＜0.05）；桔梗茎叶皂苷各剂量组中ALT，AST指数均降低，其中ALT指数基本接近空白组水平，AST指数水平变化较少。说明桔梗茎叶皂苷给药组降低了CTX引起的肝毒性，但对AST没有影响。

3.4对细胞因子的影响

对H₂₂移植瘤小鼠细胞因子的影响如图3所示。与空白组比较，模型组和CTX组小鼠TNF-α 和IFN-γ 水平均降低，且具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；经过2周治疗给药后，与模型组比较，桔梗茎叶皂苷两个剂量组小鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平显著增高（P＜0.05或P＜0.01），表明桔梗茎叶皂苷可能通过提高小鼠体内的细胞因子水平而发挥抗肿瘤作用。

3.5肿瘤组织H&E染色

对肿瘤组织切片后，常规HE染色观察，如图4所示。结果表明：模型组肿瘤细胞生长旺盛，排列整齐且致密，细胞核清晰可见，经给药治疗后，CTX组肿瘤组织呈现大面积的坏死区域，桔梗茎叶皂苷高剂量足可以观察到一定的组织坏死，且细胞排列疏松，部分细胞核消失。

3.6肿瘤组织Hoechst染色

为了确定桔梗茎叶皂苷是否能够诱导H₂₂移植瘤小鼠肿瘤细胞凋亡，本文进行了肿瘤组织的Hoechst染色。如图5所示，结果表明：模型组小鼠肿瘤细胞生长旺盛，经Hoechst染色后未见细胞皱缩及凋亡发生；经2周给药后，桔梗茎叶皂苷高剂量组的肿瘤组织内部，可以明显看见细胞核皱缩，可见部分碎片，呈致密浓染。推测，桔梗茎叶皂苷抗肿瘤作用部分通过诱导细胞凋亡而实现的。

实施例  药物及保健品制备的实施例

实施例1：片剂

【处方】桔梗茎叶皂苷100g，微晶纤维素50g，微粉硅胶3g，硬脂酸镁1.5g

【制法】取原、辅料分别过100 目筛；取桔梗茎叶皂苷、硫酸钙、微晶纤维素，混匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000 片，即得。

实施例2：片剂

【处方】桔梗茎叶皂苷75g，硫酸钙112g，微晶纤维素37g，微粉硅胶2.3g，硬脂酸镁1.1g。

【制法】取原、辅料分别过100目筛；取桔梗茎叶皂苷、硫酸钙、微晶纤维素，混匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。

实施例3：片剂

【处方】桔梗茎叶皂苷133g，硫酸钙200g，微晶纤维素66g，微粉硅胶4g，硬脂酸镁2g

【制法】取原、辅料分别过100目筛；取桔梗茎叶皂苷、硫酸钙、微晶纤维素，混匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。

实施例4：胶囊

取桔梗茎叶皂苷50g，加入适量淀粉，硬脂酸镁等辅料，制粒，整粒，装入1号胶囊，即得。

实施例5：口服液

取桔梗茎叶皂苷5g，加入适量蔗糖，防腐剂，加水到1000ml，分装成10ml一支，即得口服液。

实施例6：颗粒剂

取桔梗茎叶皂苷50g，加入适量糊精、甜菊素，干式制粒，整粒，分装，即得。

实施例7：注射剂

桔梗茎叶皂苷5g 加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水溶解，混匀，调pH值。注射用水稀释至1000ml，用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。

实施例8：注射剂

桔梗茎叶皂苷1g 加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水溶解，混匀，调pH

值。注射用水稀释至1000ml，用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。

以上根据上述实施方式对本发明的桔梗茎叶皂苷在制备抗肿瘤药物和保健品的应用进行了说明，但本发明并不限于上述实施方式，在不脱离其要旨的范围内，可在各种方式中实施本发明。除了上述实施方式之外，其它等同技术方案也应当在其保护范围之内，在此不再一一叙述。

说明书附图：

图1 桔梗茎叶皂苷对肿瘤H₂₂移植瘤小鼠肿瘤重量的影响（n=10, Mean ±S.D）

图2 桔梗茎叶皂苷对H₂₂移植瘤小鼠ALT和AST的影响（n=10, Mean ± S.D）空白组比较：^a P＜0.01或^a P＜0.05；与模型组比较：^b P＜0.01或^b P＜0.05 ；与CTX组比较：^c P <0.01或^c P＜0.05；

图3 桔梗茎叶皂苷对H₂₂移植瘤小鼠细胞因子的影响（n=10, Mean ±S.D）。与空白组比较：^a  P＜0.05或^a  P＜0.01；与模型组比较：^b  P＜0.05或^b  P＜0.01

图4. H&E染色肿瘤切片。图中Model组肿瘤细胞生长旺盛，排列整齐且致密，细胞核清晰可见；CTX组中圆形区域为肿瘤细胞大面积坏死显著区域； PS-H 组中圆形区域中可观察到一定的组织坏死，且部分细胞核消失。

图5. Hoechst 33258染色肿瘤切片。图中Model 组小鼠肿瘤细胞生长旺盛，经Hoechst染色后未见细胞皱缩及凋亡发生；CTX组中箭头所指区域为肿瘤细胞大面积凋亡坏死显著区域；PS-H组中箭头所指区域可明显看出肿瘤细胞的细胞核皱缩，可见部分碎片，呈致密浓染。

Claims (9)

1.一种桔梗茎叶皂苷的制备方法及在制备抗肿瘤药物和保健品中的应用。

2.根据权利要求1所述的桔梗茎叶皂苷制备方法，具体包括如下步骤：干燥的桔梗茎叶样品，粉碎过40目筛，经适当的溶剂和提取方法，得到提取液，减压浓缩至干；用水混悬至无沉淀，上大孔树脂吸附柱色谱，依次用水和70%以上的乙醇进行洗脱，收集醇洗脱部分，减压回收至无醇味，用水混悬至一定体积后冻干，即得桔梗茎叶皂苷。

3.根据权利要求2所述的提取溶剂和提取方法，提取溶剂选自水，甲醇，乙醇任何一种及不同比例混合物；提取方法选自加压溶剂提取、超声辅助提取、微波辅助提取等的任何一种。

4.根据权利要求2所述的大孔吸附柱色谱，主要包括药学上能够接受的，可以用于分离的多种常规树脂，选自D101，NKA12或ADS等的任何一种。

5.根据权利要求3所述的提取方法，优选加压溶剂提取，其提取压力优选1.0MPa~100MPa，提取时间优选30~180min，提取溶剂优选10~100%含水乙醇。

6.根据权利要求1所述的桔梗茎叶皂苷，具有抗肿瘤作用，可以用于药物、保健品及食品添加剂中的应用。

7.根据权利要求1所述的桔梗茎叶皂苷，比色法测定其含量在50~99%，主要含有桔梗皂苷D，去芹糖桔梗皂苷D等成分。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗肿瘤是指抑制移植瘤小鼠的肿瘤增长及诱导凋亡。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物或保健品可以是片剂，胶囊剂，粉针剂，注射剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等多种剂型。