CN111394266A - 一种去芹糖桔梗皂苷d的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种去芹糖桔梗皂苷D的制备方法，其特征在于，采用两种以上的菌株同时制备，包括库德里阿兹威毕赤酵母菌株和贝莱斯芽孢杆菌，制备去芹糖桔梗皂苷D的制备方法。本发明首次利用不同转化机制的两种菌株，以混合发酵的方式转化桔梗皂苷，有效提高了去芹糖桔梗皂苷D的产率。利用菌株发酵特性对桔梗皂苷进行生物转化，不仅可以实现对桔梗皂苷安全、环保的生产，还可以充分利用桔梗资源，使其内在含有的生物活性低的桔梗皂苷转化为生物活性高的皂苷，达到变废为宝的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种去芹糖桔梗皂苷D的制备方法及其应用，涉及采用含有库德里阿兹威毕赤酵母菌株和贝莱斯芽孢杆菌的混合菌株制备去芹糖桔梗皂苷D的制备方法及其应用。
背景技术
桔梗皂苷具有治疗高脂血症、高血压、糖尿病、肥胖等功能，其中主要生物活性成分为三萜皂苷(platycosides)。据调查，目前已经有超过三十种桔梗皂苷及多种皂苷元已经被分离鉴定，桔梗皂苷 D(Platycodin D)，简称PD，性状为白色结晶粉末，密度1.56g/cm3，熔点为228～237℃，分子式为C57H92O28，相对分子量为1224.58，水溶性好。桔梗皂苷D是桔梗酸类双糖链皂苷，其糖基分别连接在母核 C-3和C-28位上。2010版《中国药典》规定桔梗中桔梗皂苷D的质量分数为0.1％。在桔梗皂苷所表现的生物活性中，桔梗皂苷D最具有代表性。其对肿瘤细胞系表现出强烈的细胞毒性，可以作为治疗癌症的药物。WIE等通过黑曲霉(Aspergillus niger)的粗酶提取物处理，改良了桔梗皂苷D，显著减少了V79-4细胞(中国人仓鼠肺成纤维细胞)的细胞毒性和红细胞溶血毒性，增加了生物活性并提高了感官价值。去芹糖桔梗皂苷D(deapio-platycodin D)，简称(dPD)，白色至类白色粉末，分子式为C52H84O24，相对分子量1093.22，水溶性好。其分子结构与桔梗皂苷D相比少一个芹菜糖。已有研究发现，去芹糖桔梗皂昔D具有抑制胰脂肪酶活性及抗肿瘤活性。
目前，桔梗皂苷的生产方法有化学法、酶制剂法和微生物转化。化学法产生一系列副反应和化学残留，化学反应在制备过程中耗时、选择性低、转化率低。酶制剂法快速、高效，逐渐被认为是制备活性物质较为理想的方法。但是，酶制剂的制作成本高、保存条件苛刻，无法在短时间内大量应用于生产。因此，较多学者逐渐投入于微生物转化法制备桔梗皂苷。Lee等从酒曲中(nuruk)筛选出可以生产桔梗皂苷 D的微生物菌株，经鉴定为Cyberlindnera fabianii。Ling等利用具有β -葡萄糖苷酶活性的重组乳酸菌发酵生产人参皂苷Rg3(S)和化合物K，通过透化处理和混合发酵，转化产率分别达到61％和70％。
Pichia kudriavzevii中文名称叫库德里阿兹威毕赤酵母，国内学者研究发现，库德里阿兹威毕赤酵母菌株ZJPH0802能够较好的转化姜黄素，获得二种转化产物六氢姜黄素和四氢姜黄素。其中主要产物为四氢姜黄素，而Natio等实验证明了四氢姜黄素的抗氧化能力大于六氢姜黄素大于姜黄素，由此我们可以看出该菌株具有较好的研究前景。范光森等在浓香型大曲中筛选出库德里阿兹威毕赤酵母，该菌株不但产苯乙醇高，而且还能够在豆芽汁培养基中产近30种风味物质。所以该菌株在白酒中的应用前景广泛，具有较好的市场价值。Gilberto V.M等也发现库德里阿兹威毕赤酵母菌株LPB06和LPB07通过发酵可可豆，会使可可豆具有更好的色泽与更丰富的香气组成，可以用于可可豆的风味调节。可见该菌株在改善风味方面，前景大好。另有学者从非洲谷物发酵食品中筛选出库德里阿兹威毕赤酵母，发现该菌株存在叶酸生物合成基因，不但能够产叶酸和植酸酶，而且还能够在人类胃肠道的条件下传代生存，对肠细胞具有粘附力，具有良好的益生菌潜力，可直接在宿主体内发挥潜在的有益作用，增加其对宿主健康的影响。因此该菌株在研发通过天然发酵提高食品的营养价值及益生菌发酵罐的制备方面前景广泛。
Bacillus velezensis中文名称叫做贝莱斯芽胞杆菌，进来研究报道了该菌种在抑菌方面应用广泛，金疏桐等在盾叶薯蓣植物中分离得到贝莱斯芽胞杆菌，其具有一定的抗病原细菌活性。杨胜清证明了贝莱斯芽胞杆菌具有较广的抑菌作用，在一定剂量内对植物没有侵染，其发酵液在防治番茄早疫病方面效果较好。Liu，G等证明了贝莱斯芽胞杆菌LS69对多种致病细菌表现出拮抗活性，对其进行基因组分析鉴定发现该菌株含有一系列涉及增强植物生长和触发植物免疫的基因，为阐明其生物防治机制并促进其在未来的应用提供基础。Saad A.M.等利用响应面法优化贝莱斯芽胞杆菌KY498625的胞外多糖产生条件，结果表明纯化的EPS分子量为1.29×105Da，数均分子量为1.14×105Da，主要由葡萄糖，甘露糖和半乳糖组成，通过数据分析获得的最佳条件下EPS 的生产成功地将生产率从初始EPS产量增加到4.1至7.6g/L。
目前从国内外皂苷类生物转化的研究发现，单一菌株的转化途径有限，无法完全利用皂苷资源，因此对于生物转化方面很多学者开始利用混合酶体系、混合菌株进行生物转化研究，其效果理想，优于传统的单一菌株转化。Li，Ling等利用两种不同转化途径的重组乳酸菌进行人参皂苷转化，通过诱导产酶、透化和破碎处理、混合发酵等手段实现了人参皂苷的高效转化。利用菌株发酵特性对桔梗皂苷进行生物转化，不仅可以实现对桔梗皂苷安全、环保的生产，还可以充分利用桔梗资源，使其内在含有的生物活性低的桔梗皂苷转化为生物活性高的皂苷，达到变废为宝的效果。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种库德里阿兹威毕赤酵母菌株，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为 CGMCC No.17939。
本发明所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌株制备去芹糖桔梗皂苷D 的方法，包括以下步骤：
培养步骤：所述阿兹威毕赤酵母的培养选用YPD液体培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)；
种子培养步骤：菌落接种于20mL的液体培养基中，置于30℃， 110r/min条件下震荡培养14h～18h，作为种子培养液；
转化步骤：2％接种量加入0.1mg/mL皂苷标准品溶液中，在 30℃下转化24h～72h。
本发明所述的制备方法，其特征在于，生物转化过程中，发酵温度控制在30℃。
本发明还提供一种去芹糖桔梗皂苷D的制备方法，其特征在于，包括，采用两种以上的菌株混合发酵制备的步骤。
本发明所述的方法，其特征在于，所述菌株为以库德里阿兹威毕赤酵母菌株(Pichia kudriavzevii)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述库德里阿兹威毕赤酵母菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为CGMCC No.17939；所述贝莱斯芽孢杆菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏日期为2019年6月17 日，保藏编号为CGMCC No.17938。
本发明所述的制备方法，其特征在于，生物转化过程中，发酵温度控制在30～37℃。
本发明所述的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为37℃。
本发明进一步提供一种去芹糖桔梗皂苷D的应用，在制备抑制肿瘤药物、抑制类风湿关节炎药物、抗肥胖类药物、护肾类药物、护肝类药物、调节免疫活性类药物、抗糖尿病类药物、镇痛类药物、酶抑制类药物中的应用。
本发明的发明人首次利用不同转化机制的两种菌株，以混合发酵的方式转化桔梗皂苷，有效提高了桔梗皂苷D和去芹糖桔梗皂苷D的产率。利用菌株发酵特性对桔梗皂苷进行生物转化，不仅可以实现对桔梗皂苷安全、环保的生产，还可以充分利用桔梗资源，使其内在含有的生物活性低的桔梗皂苷转化为生物活性高的皂苷，达到变废为宝的效果。本发明提供不同转化方式的两种菌株及利用2种菌株进行混合发酵制备桔梗皂苷D和去芹糖桔梗皂苷D的方法。
利用不同转化机制的两种菌株，以混合发酵的方式转化桔梗皂苷，有效提高了桔梗皂苷D和去芹糖桔梗皂苷D的产率。
库德里阿兹威毕赤酵母将桔梗皂苷E先转化成桔梗皂苷D3再将桔梗皂苷D3转化成桔梗皂苷D(PE→PD3→PD)，将去芹糖桔梗皂苷E 转化成去芹糖桔梗皂苷D3再转化成去芹糖桔梗皂苷D (dPE→dPD3→dPD)，其中对dPD3和PD3的转化速度显著高于PE、 dPE；贝莱斯芽胞杆菌直接可以将桔梗皂苷E转化成桔梗皂苷D (PE→PD)，将去芹糖桔梗皂苷E转化成和去芹糖桔梗皂苷D。库德里阿兹威毕赤酵母的转化率高，但是转化速度慢，而贝莱斯芽胞杆菌转化速度快，但是转化率较库德里阿兹威毕赤酵母低，因此从桔梗皂苷资源充分利用的角度考虑，可以尝试进行混合菌株转化。
利用不同菌株发酵特性对桔梗皂苷进行混合发酵生物转化，不仅可以实现对桔梗皂苷安全、环保的生产，还可以充分利用桔梗资源，使其内在含有的生物活性低的桔梗皂苷转化为生物活性高的皂苷，达到变废为宝的效果。
附图说明
图1示出库德里阿兹威毕赤酵母30℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化；
图2示出库德里阿兹威毕赤酵母37℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化；
图3示出贝莱斯芽孢杆菌37℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化；
图4示出贝莱斯芽孢杆菌30℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化；
图5示出贝莱斯芽孢杆菌发酵桔梗过程中皂苷的变化；
图6示出混合菌株30℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化；
图7示出混合菌株发酵桔梗过程中皂苷含量的变化。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更加清楚地明白本发明的目的、技术方案及优点，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的库德里阿兹威毕赤酵母菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为CGMCC No.17939。
本发明采用上述的库德里阿兹威毕赤酵母菌株制备桔梗皂苷D的方法，包括以下步骤：培养步骤：所述阿兹威毕赤酵母的培养选用YPD液体培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)；种子培养步骤：菌落接种于20mL的液体培养基中，置于30℃，110r/min条件下震荡培养14h～18h，作为种子培养液；转化步骤：2％接种量加入0.1mg/mL皂苷标准品溶液中，在30℃下转化24h～72h。
本发明的制备方法，其生物转化过程中，发酵温度控制在30℃～37℃，优选温度控制在30℃。
本发明进一步提供一种桔梗皂苷D的制备方法，其特征在于，采用以下所述的混合菌株；包括库德里阿兹威毕赤酵母菌株和贝莱斯芽孢杆菌，所述库德里阿兹威毕赤酵母菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为CGMCC No.17939；所述贝莱斯芽孢杆菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为CGMCC No.17938。
本发明从辣白菜样品发酵的桔梗提取液中筛选得到了库德里阿兹威毕赤酵母，该菌株发酵桔梗提取液与未发酵组相比，显著提高了 PD含量，转化率为46.44％，并且该菌株对人体健康不会造成影响，可用于发酵桔梗提取液提高PD含量，在食品发酵及发酵剂的制备方面有很好的前景。本专利中的库德里阿兹威毕赤酵母菌株来源于泡菜。
本发明从辣白菜样品的发酵液中分离筛选得到贝莱斯芽胞杆菌，该菌株发酵桔梗提取液后，与未发酵组相比，显著提高了PD含量，转化率为48.92％。目前尚未报到过该菌株对人体有致病性，故可用于微生物发酵转化桔梗皂苷D。
本发明所述的制备方法的生物转化过程中，发酵温度控制在 30～37℃，在利用所述混合菌株制备去芹糖桔梗皂苷D时，发酵温度优选为37℃。
本发明提供一种去芹糖桔梗皂苷D的应用，在制备抑制肿瘤药物、抑制类风湿关节炎药物、抗肥胖类药物、护肾类药物、护肝类药物、调节免疫活性类药物、抗糖尿病类药物、镇痛类药物、酶抑制类药物中的应用。
本发明的发明人首次利用不同转化机制的两种菌株，以混合发酵的方式转化桔梗皂苷，有效提高了去芹糖桔梗皂苷D的产率。利用菌株发酵特性对去芹糖桔梗皂苷进行生物转化，不仅可以实现对去芹糖桔梗皂苷安全、环保的生产，还可以充分利用桔梗资源，使其内在含有的生物活性低的桔梗皂苷转化为生物活性高的皂苷，达到变废为宝的效果。
本发明将阿兹威毕赤酵母、贝莱斯芽胞杆菌两菌株种子培养液以 2％的接种量接种到装有50mL桔梗水提液的锥形瓶中，110r/min震荡培养72h，发酵过程定期(0、4、8、12、24、36、48、60、72h)取样，HPLC测定六种桔梗皂苷含量。
表1发酵组的设定
混合菌株：库德里阿兹威毕赤酵母、贝莱斯芽胞杆菌
HPLC检测条件如下：
设备型号：Agilent 1200RRLC-G6410B
色谱柱：Zorbax C18 column(150mm×2.1mm，3.5μm particle size)；HPLC条件：流动相水(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0～6 min：10％～15％B，6～50min：15％～25％B，50～60min：25％～47.5％B；流速：0.2mL/min；温度：室温；检测波长：210nm；进样量1.0μL。
MS条件：ESI-负离子模式，电喷雾离子源，4KV的离子喷射电压，-15V毛细管电压，300℃毛细管温度，扫描次数：500，总离子色谱图：100-1000m/z。
本发明首次在发现两种菌株对去芹糖桔梗皂苷具有不同的转化途径，如下，本发明为去芹糖桔梗皂苷D的微生物生产提供基础。
在本发明中，去芹糖桔梗皂苷转化率计算方法如下：
去芹糖桔梗皂苷转化率％＝(Y-X)/Y×100％
式中：Y-发酵前含量(mg/mL)
X-发酵后含量(mg/mL)
利用SPSS 17.0软件对试验结果进行处理，采用Duncan法进行多重比较，试验结果用平均值±标准差来表示。
在本发明中，库德里阿兹威毕赤酵母30℃发酵结果，如下详细说明：
在本发明中，库德里阿兹毕威赤酵母对于去芹糖桔梗皂苷存在 (PE→PD3→PD)、(dPE→dPD3→dPD)和(PD3→PD)和(dPD3→dPD)转化途径。
表2库德里阿兹威毕赤酵母30℃下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化
图1和表2为库德里阿兹威毕赤酵母30℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化，由图1可知，库德里阿兹威毕赤酵母在30℃条件下发酵桔梗过程中，桔梗发酵液中dPE、PE、dPD3呈下降趋势，PD3呈先上升后下降趋势，dPD、PD含量呈上升趋势；其中dPE、PE在 0～24h内含量未发生显著性变化，在24h后迅速下降，dPE在48h 后、PE在60h后未检出，转化率达100％，可能已经完成全部转化，这可能是因为发酵前期桔梗提取液中含有充足的桔梗多糖作为碳源，供库德里阿兹威毕赤酵母生长利用，在发酵后期多糖消耗殆尽，开始产生生物转化酶水解桔梗皂苷所致。dPD3在0～48h呈缓慢下降趋势，在48～60h内迅速下降，72h后仍存在剩余，含量为0.0023mg/mL， PD3在0～36h内含量未发生显著性变化，在36～48h内含量显著性上升(P＜0.01)，这是由于PE的分解转化所致，在48h后含量逐渐下降，转化产生PD，在72h后仍存在剩余，含量为0.0229mg/mL，这表明对 PD3的转化仍存在转化空间，需要进一步对菌株的产酶条件进行研究；dPD、PD在发酵结束时含量都得到了极显著的提高(P＜0.01)，dPD在72h后含量为0.054mg/mL，比初始的0.0462mg/mL提高了 16.88％、PD在72h后含量为0.2445mg/mL，比初始的0.2246mg/mL 提高了8.86％。
表3库德里阿兹威毕赤酵母37℃下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化
图2和表3示出库德里阿兹威毕赤酵母37℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化，由图2可知，库德里阿兹威毕赤酵母在37℃发酵桔梗过程中，发酵液内桔梗皂苷含量的变化趋势和30℃发酵条件相类似，但dPE、PE含量在36h后才开始下降，对比30℃发酵条件推迟了 12h，此外dPD3和PD3含量的变化也不明显，这表明库德里阿兹威毕赤酵母在37℃发酵条件下的发酵途径效率不高，这可能是因为所产生的转化酶在37℃条件下活性不强的原因；与30℃条件下发酵相比， 30℃更适合库德里阿兹威毕赤酵母对桔梗皂苷的转化。
表4贝莱斯芽孢杆菌37℃下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化
图3和表4示出贝莱斯芽孢杆菌37℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化，由图3可知，贝莱斯芽孢杆菌在37℃条件下发酵桔梗过程中，桔梗发酵液中，dPE、PE呈下降趋势，dPD3、PD3含量无明显变化，dPD、PD含量呈上升趋势；其中dPE、PE在24h内含量迅速下降，dPE在24h后未检出，可能已经转化完全，结合4.3.1中dPE、 PE含量变化情况分析，推测贝莱斯芽孢杆菌的桔梗皂苷转化酶可能是在发酵初期产生，不会受到桔梗中碳源的影响；dPD、PD含量在发酵后期含量分别为0.0434mg/mL、0.2847mg/mL，对比发酵前的0.0418 mg/mL、0.2560mg/mL分别提高了3.83％和11.21％。
表5贝莱斯芽孢杆菌30℃下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化
注：同列肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，下表同。
图4和表5示出贝莱斯芽孢杆菌30℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化，由图4可知，贝莱斯芽孢杆菌在30℃条件下发酵桔梗过程中，桔梗发酵液中dPE、PE在8～12h内含量迅速下降，dPE在12h 后未检出，可能已经转化完全；dPD、PD在发酵后期含量有所下降，与37℃条件下发酵相比，37℃更适合库德里阿兹威毕赤酵母对桔梗皂苷的转化。
此外，在贝莱斯芽孢杆菌30℃、37℃发酵过程中，观察到了一种色谱峰面积逐渐增加，图示出贝莱斯芽孢杆菌发酵桔梗过程中皂苷的变化，如图5所示，其在dPD和PD3之间，并且随着未知峰的峰面积增加，dPD3附近的其它峰面积逐渐减少，推测其可能是其它皂苷含量的变化，贝莱斯芽孢杆菌对桔梗皂苷的生物转化可能还存在其它的转化机制，需要进一步试验研究。
表6混合菌株30℃下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化
图6和表6示出混合菌株30℃条件下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化，由图6可知，混合菌株在37℃条件下发酵桔梗过程中，桔梗发酵液中dPE、PE呈下降趋势，dPD3含量在发酵前中期呈波动性变化，在发酵后期呈上升趋势，PD3含量呈上升趋势，dPD含量呈上升趋势，PD含量呈先下降后上升趋势；其中dPE、PE在24～36h内迅速下降，发酵结束时仍存在剩余；dPD3在24h后开始上升，PD3在12h后开始上升，并且未出现下降情况，结合库德里阿兹威毕赤酵母37℃的发酵结果分析，库德里阿兹威毕赤酵母可能在混合菌株37℃发酵过程中受到了一定程度的抑制，导致dPD3、PD3含量无法下降；dPD、PD 含量在发酵后期含量分别为0.0562mg/mL、0.3213mg/mL，对比发酵前的0.0458mg/mL、0.2960mg/mL分别提高了22.71％和8.55％，因此 37℃条件可用于混合菌株发酵转化桔梗皂苷。
表7混合菌株37℃下发酵桔梗过程中皂苷含量的变化
图7和表7示出混合菌株发酵桔梗过程中皂苷含量的变化，由图7 可知，混合菌株在30℃条件下发酵桔梗过程中，桔梗发酵液中dPD含量呈波动性变化、PD含量几乎不变，dPE、PE呈下降趋势，dPD3含量呈波动性变化，PD3含量出现了先上升后下降的变化，其中dPE、PE在4h内含量无显著性变化(P＞0.05)，dPE在4h后迅速下降，24h 后未检出，可能已经转化完全，PE在4～8h内缓慢下降，在12～24h 内迅速下降，dPE、PE前期含量的变化表明贝莱斯芽孢杆菌参与了发酵前期的皂苷转化；dPD3含量在8～12h出现上升，但无显著性差异(P >0.05)、PD3含量在12～36h内极显著性上升(P＜0.01)，随后在36～48 h缓慢下降(P＜0.01)，这表明库德里阿兹威毕赤酵母参与了发酵中后期的皂苷转化；与30℃条件下相比，37℃更适合混合菌株的发酵。
本发明首次利用不同转化机制的两种菌株，以混合发酵的方式转化桔梗皂苷，有效提高了桔梗皂苷D和去芹糖桔梗皂苷D的产率。为桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D的微生物生产和库德里阿兹威毕赤酵母、贝莱斯芽孢杆菌对桔梗的混合发酵提供理论基础。根据本发明，单一菌株的转化途径有限，无法完全利用皂苷资源，显著优于传统的单一菌株转化。利用菌株发酵特性对桔梗皂苷进行生物转化，不仅可以实现对桔梗皂苷安全、环保的生产，还可以充分利用桔梗资源，使其内在含有的生物活性低的桔梗皂苷转化为生物活性高的皂苷，达到变废为宝的效果。
本发明利用库德里阿兹威毕赤酵母、贝莱斯芽孢杆菌对桔梗皂苷水提液进行发酵，分别监测了单独菌株和混合菌株在30℃、37℃条件下对桔梗皂苷的生物转化情况。库德里阿兹威毕赤酵母在30℃条件下对桔梗皂苷的发酵优于37℃，dPD提高了16.88％、PD提高了8.86％；贝莱斯芽孢杆菌37℃条件下对桔梗皂苷的发酵优于30℃，dPD提高了 3.83％、PD提高了11.21％；两种菌株混合发酵37℃条件下对桔梗皂苷的发酵优于30℃，dPD提高了22.71％、PD提高了8.55％，混合发酵模式可以作为桔梗皂苷转化的一种途径。
在本发明中，阿兹威毕赤酵母的转化机制为(PE→PD3→PD)、 (dPE→dPD3→dPD)，其中对dPD3和PD3的转化速度显著高于PE、dPE；贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)的转化机制为(PE→PD)、 (dPE→dPD)，转化速度快，从桔梗皂苷资源充分利用的角度考虑，可以尝试进行混合菌株转化。
根据本发明，桔梗最适转化资源筛选：十二份不同地区的桔梗中水分、总灰分、醇浸出物及桔梗皂苷D均达到了药典规定的要求；粗蛋白含量在4.38％～20.13％之间；粗纤维含量在3.80％～12.70％之间；多糖含量在18.86％～51.00％％之间；总黄酮含量在0.22％～0.54％之间；总酚含量在0.64％～0.96％之间；各地区桔梗中dPD、PD及总皂苷的含量差异较大，其中安徽大别山桔梗总皂苷含量最高，值为11.88％，其次为山东淄博、吉林长白山，分别为11.25％、11.00％；浙江桔梗桔梗皂苷D含量最高，值为0.8212％，其次为吉林长白山桔梗，值为 0.6280％；去芹糖桔梗皂苷D含量最高的为浙江桔梗，值为0.1196％，其次为广东和吉林桔梗，值分别为0.0793％、0.0777％；根据多糖、总皂苷及六种皂苷含量综合考虑，选择吉林长白山桔梗作为生物转化材料。
根据本发明，库德里阿兹威毕赤酵母在30℃条件下对桔梗皂苷的发酵优于37℃，dPD提高了16.88％、PD提高了8.86％；贝莱斯芽孢杆菌37℃条件下优于30℃，dPD提高了3.83％、PD提高了11.21％；两种菌株混合发酵37℃条件下优于30℃，dPD提高了22.71％、PD提高了8.55％，确定混合发酵模式可以作为桔梗皂苷转化的一种途径。
本发明采用如下实验材料进行试验得到，贝莱斯芽胞杆菌和库德里阿兹威毕赤酵母菌株由本实验室筛选，桔梗片购自河北全泰药业有限公司。
本发明中使用的实验试剂购于天津科密欧化学试剂有限公司，包括，亚硝酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇、硝酸铝、福林酚、碳酸钠，水杨酸，双氧水，硫酸亚铁等；Tris-HCl缓冲液、邻苯三酚、抗坏血酸购自北京索莱宝科技有限公司；芦丁标准品、DPPH购于上海源叶生物科技有限公司。没食子酸标准品购于上海麦克林生化科技有限公司。总抗氧化能力试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
总抗氧化能力的测定
按照表8配制试剂二和试剂三应用液，精密量取0.1mL待测样品溶液，按照表9步骤配置测定管和对照管，用浓度为0.5mg/mL，1mg/mL， 2mg/mL VC溶液做阳性对照。
表8试剂组成及配制
表9总抗氧化能力测定操作步骤表
注：a为待测样品的量取体积，mL
配置后混匀，静置10min。以蒸馏水为空白，在520nm下测定各管吸光度值。
总抗氧化能力(U/mL)的计算公式：
ODU-测定管的吸光度值；
ODC-对照管的吸光度值；
V-测定时反应液的总体积(mL)；
V0-样品取样量(mL)；
M-样品的稀释倍数。
DPPH·清除率的测定
精密称取5mg DPPH，用无水乙醇溶解，并定容在100mL容量瓶中，用三蒸水将样品溶液稀释2倍，4倍，6倍，8倍，配置成50mg/mL，25 mg/mL，12.5mg/mL，8.33mg/mL，6.25mg/mL的不同浓度的样品溶液，分别取不同浓度的样品溶液2mL，并加入2mL DPPH溶液，用无水乙醇做对照，空白组为无水乙醇，蒸馏水各2mL，摇匀，在室温下避光静置30min，用Vc做阳性对照，进行3次平行试验，在517nm波长下测定吸光度。
计算公式：
DPPH·清除率＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％，
A0为未加清除剂的吸光值(加入无水乙醇)
Ai为加入清除剂的吸光值
Aj为样品溶液+无水乙醇的吸光度
在水杨酸体系中羟基自由基清除率的测定
按照上述方法稀释样品溶液，分别取不同浓度的样品溶液0.5mL于试管中，按顺序加入，8mmol/L的硫酸亚铁溶液0.6mL，20mmol/L的双氧水0.5mL和3mmol/L的水杨酸(无水乙醇溶解)2mL，混匀后放在水浴锅中，37℃反应30分钟，流水冷却。用无水乙醇作对照组，去离子水代替水杨酸作空白组，用Vc作阳性对照做三次平行实验。在510nm 波长下测定吸光度。
按下式计算清除率：
清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％，
A0为未加清除剂的吸光值(加入无水乙醇)
Ai为加入清除剂的吸光值
Aj为空白组吸光值
超氧阴离子清除率的测定
按上述方法配置不同浓度样品溶液，分别取不同浓度的样品溶液 0.1mL，加入0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)2.8mL，0.1mL 3mmol/L的邻苯三酚，用蒸馏水代替样品溶液作为对照组，空白组为2.8 mL Tris-HCl缓冲液，0.1m L蒸馏水，0.1mL 0.01mol/L的HCl，用Vc 作阳性对照，进行三次平行实验。开始反应30s后，在320nm波长下测定其吸光度，每隔30s记录一次吸光度值，反应5min[68]。
计算公式：
氧化速率＝(最后一次记录值-第一次记录值)/5
清除率(％)＝(A0-A1)/A0×100
式中：A0为未加清除剂的吸光值(加入蒸馏水)
A1为加入清除剂的吸光值。
还原力的测定
按上述方法配置不同浓度的样品溶液，分别取不同浓度的样品液 1mL于试管中，向其中加入pH＝6.6的磷酸缓冲液和0.3％的铁氰化钾溶液各2.5mL，混匀后放在水浴锅中，55℃恒温温育20min，之后取出，迅速冷却，加入2.5mL 10％的三氯乙酸溶液，3000rpm，离心10min，取上清液2.5mL，加入2mL蒸馏水，0.5mL质量分数0.1％的FeCl3溶液，充分混合，静置10min后，在波长700nm下测定吸光度值，吸光度值越大，代表还原力越强。蒸馏水组作为空白组，Vc为阳性对照，进行3 次平行试验。
计算公式：
还原力＝样品吸光度一空白对照组吸光度
总抗氧化能力
表10发酵对桔梗提取液总抗氧化能力的影响
注：同行肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
如上表10所示，50mg/mL的未发酵组，库德里阿兹威毕赤酵母发酵组总抗氧化能力和1mg/mL抗坏血酸相当，而50mg/mL贝莱斯芽胞杆菌发酵组总抗氧化能力强于1mg/mL的抗坏血酸，可见微生物发酵提高了桔梗提取液的总抗氧化能力。
DPPH·的清除能力
表11发酵对桔梗提取液DPPH清除能力的影响
注：同列肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
如表11所示，发酵组与未发酵组对DPPH·的清除能力均随着浓度的不断增加而增大，具有浓度依赖性，当浓度为50mg/mL时，各液体清除能力达到最大，其中贝莱斯芽胞杆菌发酵组清除率最高，高达 90.73％，库德里阿兹威毕赤酵母发酵组为85.16％，未发酵组为80.23％。在相同的浓度下，各液体对DPPH·清除能力的强弱依次为：贝莱斯芽胞杆菌发酵组＞库德里阿兹威毕赤酵母发酵组＞未发酵组，组间差异显著，可见发酵显著提高了桔梗提取液对DPPH·的清除能力。
水杨酸羟基清除能力
表12发酵对桔梗提取液羟基清除能力的影响
注：同列肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
从上表12可见：发酵组与未发酵组均具有一定的清除羟自由基的能力，且随着浓度的增加，清除羟基的能力也随之增大。当浓度为 50mg/mL时，既溶液浓度达到最大时，各液体羟基清除能力也达到最高，其中贝莱斯芽胞杆菌发酵组清除率最大，为70.28％，库德里阿兹威毕赤酵母发酵组为61.54％，未发酵组为57.30％。在相同浓度下，羟基清除能力的强弱依次为：贝莱斯芽胞杆菌发酵组＞库德里阿兹威毕赤酵母发酵组＞未发酵组。库德里阿兹威毕赤酵母发酵组与未发酵组相比，组间差异不显著，贝莱斯芽胞杆菌组与未发酵组及库德里阿兹威毕赤酵母组相比，组间差异显著。可见贝莱斯芽胞杆菌菌株发酵后显著提高了桔梗提取液清除羟自由基的能力。
超氧负离子清除能力
表13发酵对桔梗提取液超氧负离子清除能力的影响
注：同列肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
从表13可见：发酵组与未发酵组其超氧负离子清除能力均随浓度的增加而增大。与浓度呈正相关，在相同浓度下各液体超氧负离子的清除能力强弱依次为：贝莱斯芽胞杆菌发酵组＞库德里阿兹威毕赤酵母发酵组＞未发酵组。在浓度为50mg/mL时，贝莱斯芽胞杆菌发酵组清除率最大，为63.28％，库德里阿兹威毕赤酵母发酵组为54.68，未发酵组为47.74％。发酵组与未发酵组相比，组间差异显著，可见，微生物发酵后桔梗提取液的超氧负离子清除能力也会有显著提高。
还原力
表14发酵对桔梗提取液还原力的影响
注：同列肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
如表14所示：发酵组与未发酵组其还原力均随浓度的增加而增大，在相同浓度下，各液体还原力强弱依次为：贝莱斯芽胞杆菌发酵组＞库德里阿兹威毕赤酵母发酵组＞未发酵组。贝莱斯芽胞杆菌组与库德里阿兹威毕赤酵母发酵组相比，组间差异不显著，但与未发酵组相比，组间差异显著，可见，微生物发酵后桔梗提取液的还原力也会有显著提高。
通过本发明，贝莱斯芽胞杆菌和库德里阿兹威毕赤酵母菌株发酵桔梗提取液后，总黄酮、总酚含量均显著提高，王行等通过测定蓝莓酒发酵过程中酚类等物质，发现蓝莓酒在发酵过程中，总酚、总黄酮含量呈先增加后减少的趋势；但显著高于初始含量。陈彩云利用纳豆菌对槐米进行发酵，提高了芦丁和槲皮素含量。但本实验各液体中总黄酮、总酚不论是发酵或未发酵，含量均较低，查阅文献发现桔梗水提黄酮含量会少于醇提，黄酮更易溶于醇类试剂，故含量会较低。钱骅等也表明：抗氧化活性物质如酚类、黄酮类等多存在于醇提物中。
在利用微生物发酵提高体外抗氧化能力方面，杨学娟利用纳豆芽孢杆菌对豆粕进行固体发酵，证明了豆粕提取物发酵后不但在体外具有更高的清除DPPH自由基和超氧负离子的活性、还原力及抑制脂质过氧化的能力，而且在体内也具有更高的抗氧化能力。由此，我们可以推断发酵后的提取液，可能是因为提高或生成了多种具有抗氧化活性的物质的含量，从而使抗氧化能力得到显著的提高。
本发明将贝莱斯芽胞杆菌和库德里阿兹威毕赤酵母接种到桔梗提取液中，进行微生物发酵，并与未发酵的提取液做对比，研究微生物发酵对桔梗提取液体外抗氧化能力的影响。结果如下：
1.微生物发酵后，桔梗提取液中的总黄酮、总酚含量提高显著， 50mg/mL桔梗提取液和库德里阿兹威毕赤酵母发酵组的总抗氧化能力相当于1mg/mL的抗坏血酸。而50mg/mL贝莱斯芽胞杆菌发酵液总抗氧化能力强于1mg/mL的抗坏血酸溶液。
2.通过考察DPPH·，羟基自由基，超氧负离子的清除能力及还原力来研究其体外抗氧化能力，发现发酵组与未发酵组的清除自由基的能力与还原力均随溶液浓度的增大而增大，且呈正相关。其中2个发酵组均比未发酵组的抗氧化能力高，贝莱斯芽胞杆菌发酵后，更是显著提高了桔梗提取液的体外抗氧化能力。说明微生物发酵会显著提高桔梗提取液的体外抗氧化能力。
通过本发明，可以低成、保存条件不苛刻，在短时间内大量应用于生产。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种库德里阿兹威毕赤酵母菌株，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为CGMCC No.17939。
2.一种采用权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌株制备去芹糖桔梗皂苷D的方法，包括以下步骤：
培养步骤：所述阿兹威毕赤酵母的培养选用YPD液体培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)；
种子培养步骤：菌落接种于20mL的液体培养基中，置于30℃，110r/min条件下震荡培养14h～18h，作为种子培养液；
转化步骤：2％接种量加入0.1mg/mL皂苷标准品溶液中，在30℃下转化24h～72h。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，生物转化过程中，发酵温度控制在30℃。
4.一种去芹糖桔梗皂苷D的制备方法，其特征在于，包括采用两种以上的菌株混合发酵制备的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述菌株为以库德里阿兹威毕赤酵母菌株和贝莱斯芽孢杆菌，所述库德里阿兹威毕赤酵母菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为CGMCC No.17939；所述贝莱斯芽孢杆菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月17日，保藏编号为CGMCC No.17938。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，生物转化过程中，发酵温度控制在30～37℃。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为37℃。
8.一种去芹糖桔梗皂苷D的应用，在制备抑制肿瘤药物、抑制类风湿关节炎药物、抗肥胖类药物、护肾类药物、护肝类药物、调节免疫活性类药物、抗糖尿病类药物、镇痛类药物、酶抑制类药物中的应用。
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