CN107629973A - 一株产β‑苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株生物转化L‑苯丙氨酸制备β‑苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株及其培养方法与应用，名为Pichia kudriavzevii Y1511菌株，已于2016年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC 12567；该菌株的26S rDNA D1/D2序列与其它多株库德里阿兹威毕赤酵母的26S rDNA D1/D2序列有99 %的相似性；该菌株具有较好的糖耐受性、乙醇耐受性和苯乙醇耐受性，生长pH和温度范围宽广；本发明筛选出的库德里阿兹威毕赤酵母Y1511具有β‑苯乙醇产量高的特点，经检测，该菌株β‑苯乙醇产量可达1.0‑11.0 g/L，有利于该菌株在β‑苯乙醇工业化生产中的应用，具有反应条件温和、产品绿色天然、成本较低、环境友好等优点。

Description

一株产β-苯乙醇的库德里阿兹威毕赤酵母菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地说涉及一株新分离产β-苯乙醇的酵母菌株及其培养方法与应用。

背景技术

β-苯乙醇是一种具有令人愉快的玫瑰花香味的无色粘稠液体，香气柔和淡雅，细腻持久，颇受人们喜爱，其天然存在于玫瑰、茉莉、风信子、茶叶、水仙、黄兰和百合等许多植物的精油中，尤其是在被称之为“液体软黄金”的玫瑰精油中，其含量可以达到60%。β-苯乙醇具有的玫瑰香味深受人们欢迎，是所有玫瑰香型香气的基本组分，使其在食品、化妆品、洗涤日用品、烟草和药品等中具有广泛的应用，成为继香兰素之后的第二大香精香料。

全球β-苯乙醇的年消耗量近万吨，基本是采用化工原料苯或苯乙烯通过化学合成的方法来生产，而化学合成所使用的廉价化工原料苯或苯乙烯多属于致癌物质，不仅对人体健康和环境都有巨大危害，而且还含有一些不良气味的副产物，严重影响了β-苯乙醇的品质。随着人们生活质量的提高，消费者越来越注重食品、日用品等的安全性，更倾向于天然食品添加剂。虽然从玫瑰或玫瑰精油中提取β-苯乙醇相对安全，但仅占极少量，并且该方法周期长、生产成本高，每5吨玫瑰花才可以提炼1千克玫瑰精油，远不能满足消费者的需求。微生物在合成生产天然β-苯乙醇方面具有生产成本低、周期短、对环境污染少等优点，因此，微生物合成方法是一条经济有效的途径，必将成为生产天然β-苯乙醇的主流。

许多酵母菌具有合成β-苯乙醇的能力，如发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、酸酒酵母（Saccharomyces vini）、产朊球拟酵母（Torulopsis utilis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和异常汉逊酵母（Hansenula anomala）等，但酵母自身合成β-苯乙醇浓度比较低，工业化前景不大，而以L-苯丙氨酸为底物，通过Ehrlich途径转化生产β-苯乙醇则具有很好的可行性。在采用生物转化生产天然β-苯乙醇的过程中，需要解决的关键问题是如何从源头上提高产β-苯乙醇的能力，即寻找更高产β-苯乙醇微生物菌株是解决这一问题的关键。

随着白酒现代化分析研究发现，β-苯乙醇是我国米香型酒、豉香型酒等白酒中的特征风味物质，对于白酒的风味具有重要的影响。从白酒酿造体系中获得能高产β-苯乙醇的功能微生物，并将其强化应用到白酒酿造体系中，对于提高白酒中β-苯乙醇含量，提升白酒品质具有重要意义。库德里阿兹威毕赤酵母是白酒酿造中存在的一类酵母菌株，在白酒酿造中具有提高酯类含量，提升白酒品质的作用。前期研究一直关注其产酯类化合物方面，而有关其产β-苯乙醇的能力未见相关研究。

发明内容

针对天然绿色β-苯乙醇不能满足市场需求的问题，以及提高传统酿造食品白酒中β-苯乙醇含量，提升白酒品质的实际应用，本发明目的在于提供一种从白酒酒曲中新分离的高产β-苯乙醇的菌株，命名为Y1511，并提供Y1511产β-苯乙醇的培养基及培养方法与应用。

本发明涉及的酵母是通过梯度稀释法结合平板涂布法从古井贡酒曲中筛选获得，为库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），该菌株已于申请日前保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12567。

上述所述菌株Y1511菌落特征和生化特性如下：该菌株在固体YPD培养基上菌落呈乳白色，边缘规则，中央微突起，湿润易挑起，细胞为狭长纺锤体形；该菌株在WL培养基上中间绿色边缘黄绿色，边缘不规则，中央微突起；发酵产香香味浓，能耐受12 %（v/v）的乙醇，对苯乙醇的耐受性为3.5 g/L，能在80 %的高糖培养基中生长，pH生长范围为2-10，生长温度范围为20-40 ^oC。所述的库德里阿兹威毕赤酵母Y1511主要用于微生物发酵制备β-苯乙醇，产量可达到1.0-11.0 g/L，可以作为提高白酒中β-苯乙醇含量的功能微生物菌株应用到白酒的生产中。

上述库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株的26S rDNA D1/D2序列与其它多株库德里阿兹威毕赤酵母的26S rDNA D1/D2序列有99 %的相似性。

上述库德里阿兹威毕赤酵母Y1511菌株在制备β-苯乙醇中的应用。

上述应用，步骤如下：

（1）从斜面上挑取1环库德里阿兹威毕赤酵母Y1511接入液体种子活化培养基中，在20-40 ^oC、120-240 r/min条件下，活化16-20 h，获得种子活化液；

（2）将步骤（1）获得的种子活化液以2-12 %（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在20-40 ^oC、静置或120-240 r/min条件下培养48-60 h，即得。

根据本发明，所述步骤（1）中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20 g/ L，蛋白胨20 g/ L，酵母浸粉10 g/L，腺嘌呤0.04 g/ L，尿嘧啶0. 02 g/ L，pH 5. 5，蒸馏水定容。

根据本发明，所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下：葡萄糖20 g/ L，硫酸镁0.5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，L-苯丙氨酸5 g/ L，初始pH值为自然pH。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中液体发酵培养基优化单相组分如下：葡萄糖80g/ L，硫酸镁0. 5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，酵母浸粉5 g/ L，L-苯丙氨酸25 g/ L，pH 5，蒸馏水定容。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中液体发酵培养基优化双相组分如下：葡萄糖80g/ L，硫酸镁0. 5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，酵母浸粉5 g/L，L-苯丙氨酸10 g/ L，pH 5，蒸馏水定容，后添加液体发酵培养基体积25%-30%的油酸或聚丙二醇2000。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中培养温度为25 ^oC，以210 r/min培养54-108h。

本发明的有益效果：

（1）本发明筛选出的菌株库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511来源于白酒酿造环境中，并且较新颖，具有β-苯乙醇产量高的特点，经检测，该菌株β-苯乙醇产量可达到1.0-11.0 g/L；

（2）本发明通过对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511发酵特性的研究，优化了培养基成分及培养条件，提高了该菌β-苯乙醇的产量。

（3）本发明筛选出的库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株β-苯乙醇和乙醇耐受性高，有利于该菌株生产β-苯乙醇及其在白酒酿造中的应用。

附图说明

图1是库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株在YPD培养基上的菌落形态照片；

图2是库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株的细胞形态照片（放大400倍）；

图3是库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株系统进化发育树；

图4是库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株高糖耐受性结果；

图5是库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株最适pH测定结果；

图6是库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株最适温度测定结果；

图7是β-苯乙醇标准品高效液相色谱图；

图8是β-苯乙醇标准品制作的标准曲线；

图9是发酵液中β-苯乙醇的高效液相色谱图；

图10是不同碳源对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图11是葡萄糖浓度对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图12是L-苯丙氨酸浓度对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图13是酵母浸粉浓度对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图14是转速对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图15是温度对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图16是pH对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图17是接种量对库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇的影响

图18是双相体系原位发酵（油酸和聚丙二醇2000）时库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511合成β-苯乙醇情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例所用培养基如下：

YPD培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，蒸馏水定容。

WL培养基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，琼脂20 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙 0.125 g/L，氯化铁0.0025 g/L，硫酸镁0.125 g/L，硫酸锰0.0025 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L，pH值为6.5，蒸馏水定容。

实施例中所述库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株，2016年5月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12567。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例中所述β-苯乙醇标准品购自美国Sigma公司。

实施例1 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511的分离

将古井贡大曲粉碎并混合均匀后，称取1 g，加入9 mL无菌水，充分振荡后浸泡15 min，制成悬液。在无菌操作条件下，取0.1 mL悬液用无菌水逐级稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。取各梯度悬液0.1 mL涂布于YPD平板上，每个稀释梯度做三个平行，由低稀释浓度至高稀释浓度依次涂布。将培养基平板置于30 ^oC的恒温培养箱中培养2 d，观察菌落生长情况。挑起平板上为球形、表面突起、乳白色、不透明的单菌落，多次划线接种于YPD平板上，直至在显微镜下观察菌体形态一致。将单菌落接种于50 mL液体发酵培养基中，30 ^oC、180 r/min条件下振荡培养48 h。液体发酵培养基配方为：葡萄糖20 g/ L，硫酸镁0.5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/L，L-苯丙氨酸5 g/ L，初始pH值为自然pH。筛选能够转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的菌株，并测定β-苯乙醇含量，最终获得一株转化能力较好、能积累较高浓度β-苯乙醇的菌株，即库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511。

实施例2 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511的保存

上述所获得的库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511通过以下方法进行保存：

（1）斜面保存：将纯化后的菌种接种至YPD斜面，放置培养箱中培养48-72 h后，在4 ^oC冰箱中保存。

（2）甘油管保存：取6 mL 20 %甘油于已纯化的菌种平板中，将菌落刮净并与20 %甘油混合，将混合液分装于1.5 mL无菌PE管中，于-80 ^oC下保存。

实施例3 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511的鉴定

上述所涉及的库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511的鉴定包括以下步骤：

步骤1：形态学特征

为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下形态学特征观察：

（1）YPD培养基菌落形态和细胞观察：将实施例1中所获得的菌株纯培养体接种于YPD培养基上，于48 h后观察其形态特征（图1），结果如表1，将其在光学显微镜下放大400倍后观察，结果如图2，呈现狭长的纺锤体，少量为椭圆形，芽殖。

（2）WL培养基菌落形态观察：将筛选出的菌种接种至YPD上进行活化，培养24-48 h后接种至WL培养基，30 ^oC下培养，5 d后进行观察，结果如表1。

表1 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511形态培养特征

步骤2： 生理生化鉴定

为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下生理生化测定：

（1）糖发酵实验

本发明所测试的糖类包括以下糖源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉籽糖、乳糖和海藻糖。

本发明所进行的糖发酵实验由以下步骤组成： 配制糖发酵培养基，分装于试管中，并加入杜氏管，121 ^oC灭菌20 min；将上述糖浓度配成50 mmol/L，经过滤（0.22 μm）除菌，并将其加入含有杜氏管的培养基中；将活化好的菌种液接入以上发酵管中，每种糖类做三个平行实验，以不加测试糖、不接菌的发酵管作为空白对照，置于25 ^oC下静置培养，每天观察杜氏小管中气泡量，以及颜色变化，并连续观察两周，以杜氏管中有气泡记为阳性（+），表示该酵母能利用该糖进行发酵；无气泡记为阴性（-），表示该酵母不能利用该糖进行发酵。

（2）碳同化实验

本发明为鉴定所需同化碳源包括琥珀酸、山梨醇、木糖、鼠李糖、乙醇、赤藓糖醇、葡萄糖酸、乳酸、核糖、甲醇、甘油、D-葡糖酸-1, 5-内酯。

本发明所进行的碳同化实验包括以下步骤：将上述物质配成溶液，经过滤（0.22μm）除菌后，分别加入到含有杜氏管的碳源同化培养基中，使终浓度达到50 mmol/L；将活化后的酵母菌分别加入上述培养基中，每种碳源做三个平行，以不含碳源的试管作为空白对照，置于25 ^oC培养两周，两周后观察，充分振荡试管，若试管中培养基变浑浊，则记为阳性（+），反之为阴性（-）。

（3）氮同化实验

本发明鉴定所需氮源同化物质包括硝酸钾、硫酸铵、乙胺、亚硝酸钾、L-赖氨酸和肌酐。

本发明所进行的氮同化实验包括以下步骤：将上述物质配成溶液，经过滤（0.22μm）除菌后，分别加入到氮源同化培养基中，使终浓度达到50 mmol/L；将活化的酵母分别接入到上述试管中，每个氮源做三个平行，以不加氮源的培养基作为空白对照，置于25 ^oC条件下培养一周，一周后观察。若试管中培养基变浑浊则记为阳性（+），反之记为阴性（-）。

上述库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株的生理生化实验结果如表2，可发酵葡萄糖和麦芽糖，利用琥珀酸、乙醇、乳酸、核糖、甘油和葡萄糖酸，能利用硫酸铵、乙胺和L-赖氨酸。

表2 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511生理生化实验结果

步骤3：分子生物学鉴定

为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行的分子生物学测定包括以下步骤：

（1）菌体培养

上述涉及酵母是按照以下步骤进行培养：将实施例1中酵母菌株在YPD固体培养基中进行活化， 在30 ^oC条件下培养48 h后接种于YPD液体培养基中，置于28 ^oC、160 r/min摇床中，培养48 h。

（2） PCR 扩增

上述涉及的酵母菌株基因组DNA提取方法按照真菌DNA提取试剂盒方法。

本发明为鉴定所用的扩增引物为酵母26S rDNA基因D1/D2区序列扩增引物，由以下引物组成：正向引物，NL1：5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´；反向引物，NL4：5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´。

上述所涉及酵母菌株鉴定的PCR条件包括以下：PCR反应体系：LA PCR Buffer2.5 μL、正反引物各1 μL、dNTP 2 μL、LAtaq酶0.2 μL、DNA 2 μL、ddH₂O补至25 μL；PCR扩增程序：94 ^oC预变性5 min，94 ^oC变性30 s，58 ^oC退火30 s，72 ^oC延伸1 min，共30次循环，最后72 ^oC延伸10 min；PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检验。

（3）序列测定及系统发育树的构建

将（2）中的PCR扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，得到菌株PCR扩增片段的原始序列。采用序列图谱软件BioEdit，参照正向序列图谱，对序列人工校对。用校对后的26S rDNA D1/D2区序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLASTsearch），与其它多株库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）的26S rDNA D1/D2区序列有99 %的相似性；为进一步显示供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbour-joining方法构建系统发育树；所构建的系统进化发育树如图3所示，将该菌鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

该菌株已于2016年5月31日送至中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.12567。

实施例4 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511的生长特性

本发明所涉及库德里阿兹威毕赤酵母生长特性，其特征在于，步骤如下：

步骤1：糖耐受性

本发明所涉及的酵母菌株糖耐受性，其特征在于，以YPD培养基为基础，配制糖浓度为30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %，分装于大试管中，并加入杜氏管，做三个平行，以1 %的接种量，于30 ^oC下培养5 d，以测定OD₅₆₀作为高糖耐受性结果，结果如图4所示；由图4可以看出该菌株糖耐受能力超过80 %以上，具有较好的糖耐受性。

步骤2：乙醇耐受性

本发明所涉及的酵母菌株乙醇耐受性，其特征在于，将灭菌后的 YPD 琼脂培养基降温至 40 ^oC左右，按 8 %、10 %、12 %、14 %、16 %、18 % 、20 % (v/v)的浓度加入乙醇，接种已活化的待测菌株于上述固体培养基中，在30 ^oC下培养一周后观察其生长状况，表征其酒精耐受性，结果如表3所示，由表可见该酵母能在12 %的乙醇浓度下生长，属于高耐受乙醇菌株。

表3 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511菌株乙醇耐受性结果

浓度	8%	10%	12%	14%	16%	18%	20%
								Y1511	+	+	+	-	-	-	-

步骤3：苯乙醇耐受性

本发明所涉及的库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511 β-苯乙醇耐受性，其特征在于，将活化后的菌株Y1511划线接种于含有苯乙醇浓度为0.0-4.0 g/L的固体培养基中，于30 ^oC的条件下培养4 d，观察其生长情况，以Y1511接种于不含苯乙醇的培养基的生长情况为空白对照，“+”为正常生长，“-”为达到耐受极限，“×”为不能生长，其结果如表4，由表可见该菌株在固体培养基上的β-苯乙醇耐受浓度为3.5 g/L。

表4 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511β-苯乙醇耐受性结果

注：+代表生长状况；-代表耐受极限； ×代表完全不生长

步骤4：生长pH

本发明所涉及的酵母菌株生长pH，其特征在于，以YPD培养基为基础，配制pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的液体培养基，接种已活化的待测菌株，于30 ^oC条件下静置培养2 d，测定OD₅₆₀，结果如图5所示，由图可以看出本发明所涉及菌株生长pH范围比较宽广，为pH 2-10，其最适生长pH为3。

步骤5：生长温度

本发明所涉及的酵母菌株生长温度，其特征在于，将已活化的待测菌株接种于YPD培养基中，分别置于20、25、30、35、40、45和50 ^oC条件下静置培养2 d，测定OD₅₆₀，结果如图6所示，由图可以看出，本发明所涉及菌株的温度生长范围为20-40 ^oC，其最适生长温度为35^oC。

实施例5 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511制备β-苯乙醇

本发明所涉及库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Y1511制备β-苯乙醇步骤如下：

（1）从斜面上挑取1环库德里阿兹威毕赤酵母Y1511接入液体种子培养基中，在20-40^oC、120-240 r/min条件下，活化16-20 h，获得种子活化液；

（2）将（1）获得的种子活化液以2-12 %（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在20-40^oC、120-240 r/min条件下培养48-60 h，即得。

所述步骤（1）中的液体种子培养基组成为：葡萄糖20 g/ L，蛋白胨20 g/ L，酵母浸粉10 g/L，腺嘌呤0.04 g/ L，尿嘧啶0. 02 g/ L，pH 5. 5，蒸馏水定容。

所述步骤（2）中的液体发酵培养基组成为：葡萄糖20 g/ L，硫酸镁0.5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，L-苯丙氨酸5 g/ L，初始pH值为自然pH。

产物和产物浓度的确定

采用高效液相色谱法确定和测定β-苯乙醇浓度，高效液相色谱（Agilent 1260infinity）仪器参数为：C-18反相色谱柱（ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：水= 1：1（v/v），流速0.5 mL/min，检测波长260 nm，柱温30 ^oC，进样量10μL。

（1）β-苯乙醇标准曲线的绘制

精确吸取0.2 mL β-苯乙醇标准品，用色谱纯甲醇定容至10 mL，配制浓度为20 g/L的贮备液，分别吸取贮备液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，再以色谱纯甲醇定容至10 mL，得到0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4和2.8 g/L的β-苯乙醇标准溶液。

将上述不同浓度梯度的β-苯乙醇标准溶液在上述条件下进行测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线。β-苯乙醇标准品高效液相色谱图如图7，β-苯乙醇标准品出峰时间在16-17 min之间，每一浓度重复测定3次，求均值绘制β-苯乙醇标准曲线，如图8所示，根据该曲线获得的方程式为y=1889.0x+3.5567（R ² =0.9998）。

（2）样品的制备

取8 mL发酵液于10 mL离心管中，经6000 r/min 离心10 min，取上清液1 mL，经0.22 μm水系滤膜过滤得到样品。

高效液相色谱（Agilent 1260 infinity）仪器参数为：C-18反相色谱柱（ZORBAXEclipse Plus C-18，4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：水= 1：1（v/v），流速0.5 mL/min，检测波长260 nm，柱温30 ^oC，进样量10 μL。外标法测定β-苯乙醇。

样品的高效液相色谱图如图9所示，由图可看出β-苯乙醇出峰时间在16-17 min之间，与标准品出峰时间一致，样品中含有β-苯乙醇。

高效液相色谱测定样品的峰面积带入标准曲线方程y=1889.0x+3.5567（R ² =0.9998）中，峰面积为y值，求出β-苯乙醇浓度x。

实施例6 碳源种类的优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，液体发酵培养基中碳源分别选择麦芽糖，葡萄糖，蔗糖，甘露醇，乳糖和糖蜜，添加量为20 g/L。以2 %的接种量，在30 ^oC、150r/min的条件下培养54 h。通过图10可以看出，酵母Y1511几乎不能利用甘露醇，对于蔗糖和糖蜜的利用率也极低，其利用葡萄糖和麦芽糖合成β-苯乙醇产量较高，分别为1.26和1.00g/L，葡萄糖利用率最佳。

实施例7 葡萄糖浓度优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，液体发酵培养基中葡萄糖浓度分别为20、50、80、110、140和170 g/L，以2 %的接种量，在30 ^oC、150 r/min的条件下培养54h。用高效液相色谱法检测β-苯乙醇，通过图11可以看出，当葡萄糖浓度80 g/L时，酵母Y1511利用葡萄糖合成苯乙醇含量最高，为1.59 g/L。

实施例8 L-苯丙氨酸浓度的优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，在实施例7基础上，选择L-苯丙氨酸浓度为5-40 g/L。以2 %的接种量，在30 ^oC、150 r/min的条件下培养54 h。由图12可以看出，在其浓度达到25 g/L时，生成的苯乙醇含量最高为1.93 g/L，故选择L-苯丙氨酸的浓度为25 g/L。

实施例9 酵母浸粉添加量优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，在实施例8基础上，添加不同浓度（0-30 g/L）的酵母浸粉，以2 %的接种量，在30 ^oC、150 r/min的条件下培养54 h。结果如图13。由图可知，当酵母浸粉加入量为5 g/L时，菌株Y1511合成β-苯乙醇产量为2.27 g/L。

实施例10 转速的优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，在实施例9基础上，在静置和不同转速（120、150、180、210和240 r/min）条件下培养，以2 %的接种量，在30 ^oC条件下培养54h。由图14可以看出，菌株Y1511在静置和低转速条件下，产生β-苯乙醇含量较低；随着转速提高，产生β-苯乙醇含量提高，在210和240 r/min条件下，菌株Y1511合成的β-苯乙醇含量相差不多，分别为2.68和2.70 g/L。考虑成本问题，选择210 r/min。

实施例11 温度的优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，在实施例10基础上，选择温度范围为20-40 ^oC之间，以5 ^oC为一个梯度，以2 %的接种量培养54 h。结果如图15。当温度为25 ^oC时，菌株Y1511合成β-苯乙醇产量为2.79 g/L。因此，Y1511合成苯乙醇的最适温度为25 ^oC。

实施例12 pH的优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，在实施例11基础上，调整初始发酵培养基pH分布为1、2、3、4、5、6和7。以2 %的接种量培养54 h。由图16可以看出，当pH为5时，菌株Y1511合成β-苯乙醇产量为3.00 g/L。因此，Y1511合成β-乙醇的优选pH为5。

实施例13 接种量的优选

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，不同之处在于，在实施例12基础上，分别以2 %、4%、6 %、8 %、10 %、12 %的接种量将Y1511种子活化液接种于转化培养基中培养54 h。由图17可以看出，当接种量为10 %时，菌株Y1511合成β-苯乙醇产量为3.15 g/L。因此，Y1511合成苯乙醇的优选接种量为10 %。

实施例14 双相体系转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇

采用实施例5的方法培养酵母Y1511，选择油酸或聚丙二醇2000作为有机相，在液体发酵培养基基础上添加油酸或聚丙二醇2000，所添加量为液体发酵培养基体积的25%-30%，于20-40 ^oC条件下培养。优化后双相培养基组成为：葡萄糖80 g/ L，硫酸镁0. 5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，酵母浸粉5 g/L，L-苯丙氨酸10 g/ L，pH 5，蒸馏水定容，后添加液体发酵培养基体积28%的油酸或聚丙二醇2000，在25 ^oC条件下培养108 h。取10 mL菌液在5000 r/min条件下离心20 min，取上清液，过膜（0.45 μm）待测；取有机相，用5倍的甲醇稀释，过膜处理，用高效液相色谱法检测。经过计算，由图18可以看出，Y1511合成苯乙醇的能力分别达到10.8 g/L（油酸）和10.6 g/L（聚丙二醇2000）。

Claims (9)

1.一株库德里阿兹威毕赤酵母菌株，其特征在于：该库德里阿兹威毕赤酵母的菌株名为库德里阿兹威毕赤酵母Y1511，已于2016年5月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 12567，该菌株的特征是：形状多为狭长的纺锤体，少量椭圆形，芽殖，菌落颜色为乳白色，可利用葡萄糖、麦芽糖、琥珀酸、乙醇、乳酸、核糖、甘油和葡萄糖酸，能利用硫酸铵、乙胺和L-赖氨酸，在不含维生素的培养基上生长，糖耐受能力大于80 %，在12 %的乙醇浓度下能正常生长，该菌β-苯乙醇耐受浓度为3.5 g/L，最适生长pH和温度分别为3和35 ^oC，所述库德里阿兹威毕赤酵母Y1511菌株的26S rDNA D1/D2序列与其它多株库德里阿兹威毕赤酵母的26S rDNA D1/D2序列有99 %的相似性。

2.如权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母Y1511菌株在制备β-苯乙醇中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）从斜面上挑取1环库德里阿兹威毕赤酵母Y1511接入液体种子活化培养基中，在20-40 ^oC、120-240 r/min条件下，活化16-20 h，获得种子活化液；

（2）将步骤（1）获得的种子活化液以2-12 %（v/v）的接种量接种于液体发酵培养基，在20-40 ^oC、静置或120-240 r/min条件下培养48-60 h，即得。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中液体种子活化培养基组分如下：葡萄糖20 g/ L，蛋白胨20 g/ L，酵母浸粉10 g/L，腺嘌呤0.04 g/ L，尿嘧啶0. 02 g/L，pH 5. 5，蒸馏水定容。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中液体发酵培养基组分如下：葡萄糖20 g/ L，硫酸镁0.5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，L-苯丙氨酸5 g/ L，初始pH值为自然pH，蒸馏水定容。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中液体发酵培养基优化单相组分如下：葡萄糖80 g/ L，硫酸镁0. 5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，酵母浸粉5 g/ L，L-苯丙氨酸25 g/ L，pH 5，蒸馏水定容。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中液体发酵培养基优化两相组分如下：葡萄糖80 g/ L，硫酸镁0. 5 g/ L，磷酸二氢钾5 g/ L，酵母浸粉5 g/L，L-苯丙氨酸10 g/ L，pH 5，蒸馏水定容，后添加液体发酵培养基体积25%-30%的油酸或聚丙二醇2000。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，采用权利要求6所述培养基，所述步骤（2）中培养温度为25 ^oC，以210 r/min培养54 h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，采用权利要求7所述培养基，所述步骤（2）中培养温度为25 ^oC，以210 r/min培养108 h，可得到成熟的β-苯乙醇转化液。