CN109097291B - 一种复合发酵组剂及其在酿制赤霞珠干化酒中的应用 - Google Patents

一种复合发酵组剂及其在酿制赤霞珠干化酒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种复合发酵组剂及其在酿制赤霞珠干化酒中的应用，通过从新疆石河子地区酿酒地的葡萄酒前期发酵液中分离取样分离、培养、筛选，获得了一株非酿酒酵母库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）F0‑N475‑5；将制备的非酿酒酵母F0‑N475‑5二级发酵液和酿酒酵母（S.cerevisiae）GTGM‑E2二级发酵液1:1进行混，制备的复合发酵组剂应用于发酵南疆赤霞珠干化酒，具有口感复杂层次感突出，口香浓郁复杂，优雅细腻，余味悠长，香气和口感协调，整体品质优异，风格突出。打破依靠活性干酵母发酵葡萄酒，风格单一的局面，获得显著良好的技术效果。

Description

一种复合发酵组剂及其在酿制赤霞珠干化酒中的应用
技术领域
本发明涉及农业微生物应用技术领域，具体地说，本发明涉及自 行选育筛选的菌种制备复合干化酒发酵组剂及在干化酒发酵中应用 的技术领域。
背景技术
干化葡萄酒又称麦秆葡萄酒(Straw Wine)或葡萄干葡萄酒 (Raisin Wine)，是葡萄经过晾干后发酵而成的一种醇厚滋润、馥郁 芳香的葡萄酒。干化葡萄酒，其酿造工艺特点是将成熟的葡萄采摘后， 经过一定时间采后风干处理，至葡萄糖、酸、生物活性成分和香气高 度浓缩，再进行除梗破碎、发酵等酿造工序。干化葡萄酒原料糖分较 高属于甜型葡萄酒，在甜型酒酿造中，普遍存在发酵启动难，易提前 中止，发酵后期酵母活力不足等问题，因此筛选得到耐高糖、高渗透 压、高酒精、高SO2、无外源异味引入的酿酒酵母是酿造优质干化葡 萄酒的关键。
酵母菌是葡萄酒发酵过程中必不可少的微生物。按照其作用不 同，可分为酿酒酵母(S.cerevisiae，Sc)和非酿酒酵母(Non-S.，NS) 两大类。其中，Sc主要是将葡萄汁中糖类转化为酒精和CO2，同时 分泌少量的甘油、高级醇、醛、酯等产物。关于Sc对葡萄酒品质的影响已有很多相关的研究报道。所谓NS是指一类自然存在于葡萄园、 葡萄表皮、酿酒环境中，能够通过代谢和自溶提高葡萄酒的香气，参 与复杂新鲜的风味物质形成的酵母菌。NS能分泌果胶酶、葡萄糖苷 酶、脂肪水解酶、蛋白质水解酶等多种胞外酶，产生醇类、酯类、酸类、萜烯类等风味成分，但限于传统技术偏见，一般酿酒领域不采用 将NS用于酿酒，常见的更多采用各类的Sc。不同酵母种类不仅对葡 萄酒的产量、质量和生产管理影响很大，尤其对葡萄酒特色的形成至 关重要。
目前，新疆酿酒葡萄适宜生态区有天山北坡、吐哈盆地、伊犁河 谷、焉耆盆地以及喀什、和田多个产区，南疆产区包括焉耆盆地、库 尔勒、和田、喀什、阿克苏、阿图什等地区。南疆种植赤霞珠葡萄无 霜期长，昼夜温差大，日照时数长，使得糖分积累过高，对常规葡萄酒质量具有不利影响，据调研，现实情况表明新疆赤霞珠葡萄糖分过 高而被各个酒厂废弃不用的现象很严重。新疆南部地区气候干早，年 积温高、降水量少，为葡萄的干化处理提供了得天独厚的天然环境条 件，不仅使赤霞珠葡萄浆果在晾制过程中能够保证其品质特征，同时 零消耗，零成本。为酿制品质优良的干化葡萄酒提供原料保证。
为了深度发掘葡萄酒地域赋予典型风格特征，常从葡萄酒酵母天 然酵母中选育。在多年种植葡萄的园区有多种天然酵母与其相伴而 生，经长期的自然选择和进化演变，逐渐孕育了一批适于当地环境条 件和葡萄品种的优势天然酵母菌群，从中筛分出具有优良品质的葡萄 酒酵母，有可能酿制出具有地域特色和独特风格的产地葡萄酒。通过 本土酵母菌的筛选能够筛选出适宜本地各酿造条件的优良菌株，打破 依靠活性干酵母发酵的葡萄酒各类风格单一的局面。
发明内容
针对现有技术中未见有关从新疆本土筛选相关非酿酒酵母菌株 作为优良菌种，与酿酒酵母相配伍相融合制备赤霞珠干化酒发酵组剂 的技术现状，且现有干化酒发酵方法普遍存在酵母菌发酵启动难，易 提前中止，高糖掩盖葡萄酒香气不足等一系列问题，本发明旨在筛选 出具有产香型优于活性干酵母的非酿酒酵母菌，筛选出的非酿酒酵母 与优良酿酒酵母相配伍提供一种复合干化酒发酵组剂及其在赤霞珠 干化酒发酵中的应用。本发明通过在新疆石河子地区酿酒地的葡萄酒 前期发酵液中分离筛选出一株非酿酒酵母库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii)F0-N475-5CGMCC No.15772，利用分离出的非酿酒酵母库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCC No.15772和优良酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513相配伍相融合制备干化酒发酵组剂，应用到赤霞珠 干化酒发酵中，具有良好起发性，降糖性，显著的增香特性，对于微 生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。
本发明采用主要的技术方案：
本发明具体提供一种非酿酒酵母库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCC No.15772。通过从石河子地区酿酒 地的葡萄酒前期发酵液中分离取样，筛选出一株库德里阿兹威毕赤酵 母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5，该菌能够高度释放葡萄原料香 (β-大马士酮OAV＞11)，果香突出且层次丰富(酯类物质种类为最 多，且丁酸乙酯，乙酸乙酯，葵酸乙酯远远超过OAV＞1的香气活 度值)，及不同于其他甜型葡萄酒的蜜香(苯乙醛OAV＞3)，适度 而不刺鼻的醇香(高级醇含量＜300mg/L)。该菌不产生物胺，不产 H2S，高度自溶性(有助于增香)，及中等降酸特性。为酿制品质优 良的干化葡萄酒提供菌株保证。
本发明提供的菌种是根据新疆地理环境与气候的特殊性和新疆 微生物资源丰富的特点，通过从新疆石河子地区酿酒地的葡萄酒前期 发酵液中进行微生物菌种的培养、分离，筛选出一大批优良菌种，并 从中分离筛选出一株编号为F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii)，菌种经WL鉴别培养基培养菌体呈灰蓝色， 边缘白色，呈毛茸放射状，表面粗糙无光泽，微凸，经微生物学分类 与鉴定，属于库德毕赤酵母，通过在WL培养基上呈现不同的菌落形 态和颜色，进行分类与鉴定，确定F0-N475-5菌株为WL8类型。
通过对前期各类型的菌种提取DNA，做26S rDNA D1/D2区及 5.8S-ITS rDNA区PCR扩增，并将扩增产物进行基因测序，序列参见 附后提供的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，同源分析、系统发 育分析，通过BLAST同源比对，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的序列，并结合真菌生物多样性研究中心 数据库，进行聚类分析和系统进化树构建。26S rDNA D1/D2区通过 BLAST同源比对，WL8类型的F0-N475-5菌株归属于库德里阿兹威 毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，菌株F0-N475-5与该属模式菌株序 列比对最高同源性为99％(P.kudriavzevii KJ7946971)，确定该菌种 为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，从分类学角度暂命 名为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5。已于 申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏 日期2018年5月21日，菌种保藏号为CGMCC No.15772。经微生物 学鉴定暂命名为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii) F0-N475-5。
菌株F0-N475-5在YPD培养基上，菌落边缘整齐、表面光滑、 乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，无性繁殖均为 芽殖，有时有假菌丝，无子囊孢子和掷孢子；该菌株最适生长条件为： 培养温度20-30℃，最适培养温度28℃；优先生长于YPD培养基表面，培养时间为18-24h。
同时，本发明提供了菌株库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCC No.15772的发酵工艺：在无菌条件 下，挑取该菌株，28℃，120r/min培养18-24h。
具体的，本发明具体提供一种酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513。从新疆阿克苏市阿瓦提县慕萨莱思酿造中筛选出 一株酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2，具有良好的耐受特性(糖 浓度>500g/L、SO2>200mg/L、酒精度(v/v)>15％)，高度起发性。该菌株培养条件：培养温度20-30℃，最适培养温度28℃；优先生长 于YPD培养基表面。本发明提供了酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，28℃， 120r/min培养18h-24h。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微 生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2013年4月23日，菌种保 藏号为CGMCC No.7513。
进一步，本发明提供编号为F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichiakudriavzevii)在赤霞珠干化酒发酵中的应用。通过利用 F0-N475-5库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和酿酒酵母 (S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513菌株制备复合发酵组剂 应用于发酵赤霞珠干化酒，有效的解决了干化酒发酵启动难，易提前 中止，产香不足，不能深度发觉干化典型酒风味特征等一系列问题， 且发酵出的南疆赤霞珠干化酒口感复杂层次感突出，口香浓郁复杂， 优雅细腻，余味悠长，香气和口感协调，整体品质优异，风格突出。 打破依靠活性干酵母发酵葡萄酒，风格单一的局面，获得显著良好的 技术效果。
同时，本发明具体提供一种复合发酵组剂的制备方法，具体制备 方法步骤如下：
(1)接种：制备非酿酒酵母库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCC No.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC No.7513两种菌种的固体培养基，灭菌后严格进 行无菌操作，从斜面转接至平板，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2分别 在温度28℃下培养18h-24h。
(2)一级培养：从步骤(1)中的固体培养基上挑取单菌落，分 别转接至装有液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，库德里阿兹 威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCC No.15772和酿 酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513在温度28℃、 120r/min培养18h-24h。
(3)二级发酵：将上述步骤一级培养菌种分别接种于盛有赤霞 珠葡萄汁的500mL锥形瓶中，无菌操作，库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCCNo.15772和酿酒酵母(S. cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513分别在温度28℃、120r/min培 养24h-48h。
(4)复合发酵组剂的配伍：按照体积比计，选用步骤(3)制备 的编号为F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) 二级发酵液和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2二级发酵液1:1进 行混合，制备获得南疆赤霞珠干化酒复合发酵组剂。
本发明中，所述的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) F0-N475-5CGMCC No.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513的培养基为葡萄糖酵母浸出粉培养基(YPD培养 基)，制备方法为：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂20g，补水至1000mL，分装，灭菌，即可制备获得YPD培养基。
进一步，本发明提供应用上述复合发酵组剂发酵赤霞珠干化酒的 方法，具体制备方法步骤如下：
(1)干化葡萄酒原料的选择：挑选优质赤霞珠葡萄，完全成熟 后推迟采摘，将赤霞珠葡萄延迟采收进行自然干化，原料进行严格分 选，要求果穗整齐成熟、着色率达100％，采摘时葡萄可溶性固形物 含量为45Brix。
(2)葡萄的除梗破碎：将挑选好的葡萄，经人工除梗，用螺旋 榨汁机进行破碎取汁。
(3)干化葡萄酒的酒精发酵：对进行除梗破碎处理的干化后赤 霞珠葡萄，输入至发酵罐中，分别均匀加入食品级偏重亚硫酸钾和果 胶酶，食品级偏重亚硫酸钾的添加量以SO2计为50mg/L，果胶酶的 添加量为0.02g/L；选用优选出的典型优良酵母复合发酵组剂F0-N475-5:GTGM-E2按照体积比1:1进行复配后组成复合发酵剂酒 精发酵，复合发酵剂的体积百分比接种量为2％，温度控制在25-28℃， 并每天进行循环浸渍，监测糖度变化。
(4)干化葡萄酒的苹乳发酵：主发酵结束后，添加SO2至 30mg/L，注意及时添酒，保证在满罐、密封条件下进行苹果酸-乳酸 发酵；温度保持在20±2℃，时间为1个月左右，当检测确定苹乳发 酵结束时，终止发酵，低温保存。
(5)干化葡萄酒的陈酿：将苹乳发酵后原酒置于罐中陈酿，环 境温度保持在14-16℃，湿度保持在70-80％，定期添原酒处于满缸状 态，游离SO2含量保持在25-35mg/L，陈酿期为6-12个月。
(6)干化葡萄酒的出桶、装瓶与瓶储：干化葡萄酒陈酿后，经 品尝后决定出桶，出桶后原酒进行加入澄清用蛋清粉澄清处理后，装 瓶瓶储，瓶储期环境温度控制在12-15℃，湿度为70％-80％，且避免 光照，瓶储期为12-24个月以上。
进一步，本发明提供应用上述复合发酵组剂在赤霞珠干化酒发酵 中的应用。通过利用自行筛选、分离，驯化获得库德里阿兹威毕赤酵 母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5CGMCC No.15772，通过实践与 酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513相融合试验，实 践证明制备的复合发酵组剂应用于发酵赤霞珠干化酒，有效的解决了 干化酒发酵启动难，易提前中止，高糖掩盖特征风味等一系列问题， 且发酵出的赤霞珠干化酒口感复杂层次感突出，口香浓郁复杂，优雅 细腻，余味悠长，香气和口感协调，整体品质优异，风格突出。打破 依靠活性干酵母发酵葡萄酒，风格单一的局面，获得显著良好的技术 效果。
本发明所选用编号为F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichiakudriavzevii)是从新疆酿酒地的葡萄酒前期发酵液中筛选得 到，及本土葡萄酿酒基地筛选的慕萨莱思酿酒酵母(S.cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC No.7513，微生物菌种的特异性和复杂性，将各种 不同的菌种能够复合配伍使用，通过各种菌种的相融性、配伍性与各 菌种属性结合，考虑的复合菌种的安全性，特别是应用于赤霞珠干化 酒发酵中都需要大量的基础实验验证，本发明基于前期基础研究积 累，通过采用大量不同的菌种复配试验，证明本发明采用菌种 F0-N475-5和GTGM-E2组成复合菌种制备复发酵组剂，复合发酵复 组剂按照体积比配比由编号为F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii)二级发酵液和酿酒酵母(S.cerevisiae)二级发 酵液按照1:1进行混合，制备获得赤霞珠干化酒发酵组剂，并通过发 酵生产实践应用在赤霞珠干化酒酿酒全过程，有效解决了酵母菌发酵启动难，易提前中止，产香不足，不能深度发掘干化葡萄酒典型特征 等一系列问题，打破目前最常见采用依靠活性干酵母发酵葡萄酒风格 单一的局面，特别是通过自行筛选获得两种典型菌种F0-N475-5的库 德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)二级发酵液和酿酒酵母(S. cerevisiae)二级发酵液按照1:1进行混合，组成复发酵组剂用于赤霞 珠干化酒酿酒，获得一种具有非常突出口感复杂层次感突出、口香浓 郁复杂、优雅细腻、余味悠长、香气和口感协调、风格典型突出的干 化葡萄酒。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:
(1)本发明筛选的编号为F0-N475-5的非酿酒酵母库德里阿兹 威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)菌株，能够高度释放葡萄原料香(β- 大马士酮OAV＞11)，果香突出且层次丰富(酯类物质种类为最多， 且丁酸乙酯，乙酸乙酯，葵酸乙酯远远超过OAV＞1的香气活度值)， 及独特甜型葡萄酒蜜香(苯乙醛OAV＞3)，适度而不刺鼻的醇香(＜ 300mg/L)。该菌不产生物胺，不产H2S,高度自溶性(有助于增香)， 及中等降酸特性。
(2)本发明具体提供一种酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513。该菌用于干化酒的酿制具有良好的耐受特性(糖 浓度>500g/L、SO2>200mg/L、酒精度(v/v)>15％)，高度起发性， 不产生物胺，不产H2S，且能够耐受45℃高温等优良特性。
(3)利用自行筛选分离驯化获得库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCC No.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC No.7513相融合试验，实践证明制备的复合发酵 组剂应用于发酵赤霞珠干化酒，有效的解决了酵母菌发酵启动难，易 提前中止，发酵后期酵母活力不足等一系列问题，且发酵出的赤霞珠 干化酒口感复杂层次感突出，口香浓郁复杂，优雅细腻，余味悠长， 香气和口感协调，整体品质优异，风格突出。打破依靠活性干酵母发 酵葡萄酒，风格单一的局面，获得显著良好的技术效果。
附图说明
图1显示为基于5.8S-ITS rDNA区域序列和N-J法不同表型酵母 菌和相关酵母模式菌株系统发育树图。
图2显示为基于26S rDNA D1/D2区域序列和N-J法不同表型酵 母菌和相关酵母模式菌株系统发育树图。
图3显示为非酿酒酵母菌香气评定得分(前10名)图，其中 EC117、RV100为商用菌。
图4显示为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) F0-N475-5菌落形态图。
图5显示为酿酒酵母起发特性筛选图。
图6显示为酿酒酵降糖速率筛选图。
图7显示为酿酒酵母CO2释放特性筛选图。
图8显示为优良菌株复配比例降糖量比较图。
图9显示为优良菌株复配比例产酒精度比较图。
图10显示为优良菌株复配比例CO2释放量比较图。
图11显示为优良菌株复配比例香气值分布图。
图12显示为不同添加时序降糖量比较图。
图13显示为不同添加时序CO2释放量比较图。
图14显示为不同添加时序香气比较图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施 例。
本发明实施例中采用如下基础培养基：
培养基：YPD培养基，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉 10g/L，蒸馏水1.0L，自然pH值，121℃高压灭菌20min；WL培养 基，商用培养基，80g/L，蒸馏水1.0L，经加热煮沸至完全溶解，分 装后115℃高压灭菌15min。
采用的主要试剂：果胶酶、偏重亚硫酸钾、澄清用蛋清粉、葡萄 糖、果糖、无水乙醇均为分析纯，甲醇、乙腈、氨基酸标品均为色谱 纯。
采用的主要的仪器设备：HPX-9272 MBE数显电热培养箱； BS2202S电子天平；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器；SW-CJ-2F 超净工作台；DZKW D-2电热恒温水浴锅；MYCYCLER型PCR仪； DYY-6C型电泳仪；GEL Doc2000凝胶成像分析仪；气相色谱仪； 高效液相色谱仪；GC-MS。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂、仪器设备，以及选用的菌 种培养方法都为本领域熟知选用的，除非特别指出除外。
实施例一：库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) F0-N475-5 CGMCCNo.15772的分离、筛选和鉴定
1、分离、纯化：从新疆沿天山北带、伊犁河谷地区、吐鲁番地 区、环塔里木盆地地区的酿酒地中分离得到菌株。吸取5mL样品， 加入到装有50mL无菌水的锥形瓶中，于28℃、150r/min的摇床上震 荡摇匀。将处理过的样品稀释至10-2、10-3、10-4，将稀释后的不同梯度的样品溶液各取200μL，用涂布棒均匀的涂在YPD培养基上，放 入培养箱中28℃培养2-3d，待菌落长好后，挑取平板上不同形态且 生长良好的单菌落，反复划线直到获得纯菌株。
2、初步筛选：经活化后的菌株，用接种环在WL培养基上进行 划线接种，28℃培养3-8天，对划线法接种的菌种观察并记录菌落的 单个大小适度的菌落形态包括质地、颜色、表面特征、侧面特征、边 缘特征进行分析和初步的归类。
根据对相关酵母进行WL分类，得到25种类型，现将新疆南北疆 各类型对应各地区菌种进行以下统计，统计结果见表1、表2。
表1：北疆非酿酒酵母菌株统计表
Figure BDA0001767051930000131
Figure BDA0001767051930000141
由表1可知，通过对新疆北疆地区1719株非酿酒代表酵母菌进行 WL培养基表面菌落形态进行分类后，其中有755株菌株属于WL7型占 总数的43.92％，WL2型231株次之占总数的13.44％，WL1型101株占 总数的5.88％，该三种WL类型所占比例较大，为北疆地区非酿酒酵母 菌的优势菌群。
表2：南疆非酿酒酵母菌株统计表
Figure BDA0001767051930000142
由表2可知，通过对新疆南疆地区1397株非酿酒代表酵母菌进行WL培养基表面菌落形态进行分类后，其中有742株菌株属于WL7型占 总数的53.11％，WL21型127株次之占总数的9.09％，WL1型125株占 总数的8.95％，该三种WL类型所占比例较大，为南疆地区非酿酒酵母 菌的优势菌群。一共获得3116株非酿酒酵母菌株。
菌种经WL鉴别培养基培养，通过在WL培养基上呈现不同的菌落 形态和颜色，进行分类与鉴定，WL8类型菌体呈灰蓝色，边缘白色， 呈毛茸放射状，表面粗糙无光泽，微凸，菌落形态。
3、分子系统学分析和分类：通过挑选WL代表菌株66株，提取 DNA，做26S rDNA D1/D2区及5.8S-ITS rDNA区PCR扩增，并将扩增 产物送外测序，并对相应结果进行比对，共计得到9个属14个种。
(1)5.8S-ITS rDNA区序列分析结果
由附图1可知，对葡萄酒相关酵母菌25种不同WL表型的代表菌株 的5.8S-ITSrDNA区进行序列测定分析，根据附图1的结果得到：表型 8、11、14为Pichia kudriavzevii。
(2)26sr DNAD1/D2区序列分析结果
由附图2可知，对葡萄酒相关酵母菌25种不同WL表型的代表菌 株的26S rDNA D1/D2区进行序列测定分析，根据附图2的结果得到： 表型8、11、14为Pichia kudriavzevii。
由于菌株较多，后续实验代表菌按照每个地区每个类型挑选不少 于5株的典型菌株作为后续实验待测菌株，通过挑选选出非酿酒酵母 代表菌株共1533株。
4、代表菌株用于酿酒特性筛选实验
根据葡萄酒相关酵母菌的酿酒特性实验以不产生物胺、硫化氢、 自溶性、降酸特性等为主要因素结合其他指标进行综合评价，得到 68株非酿酒酵母菌，如表3所示。其中序号NS68(具体菌株的编号 为F0-N475-5)菌株不产生物胺，不产硫化氢，自溶性强，降酸特性较强，为理想中的优良非酿酒酵酵母。
表3：初筛得到优良非酿酒酵母菌汇总表
Figure BDA0001767051930000161
Figure BDA0001767051930000171
5.优良非酵母菌的复筛
(1)非酿酒酵母香气评定实验：起发性实验过程中每间隔一天 监测糖度的变化，以糖度不再变化为发酵终点，将发酵结束后的样品 做香气评定试验(以空白发酵液与标准成品酒的得分分别为0分和 10分做对比，根据与之香气的不同给出不同的得分)，香气浓郁度 评定(按照香气浓郁度弱、稍弱、平均、稍强、强的分值分别为0-2， 2-4，4-6，6-8，8-10)；对三个平行组得分求均值、并排序，挑选优 良非酿酒酵母(NS)。
通过非酿酒酵母菌香气评价结果：由附图3可以看出，根据香气 评定排在前十名的非酿酒酵母菌依次是序号为NS68(编号 F0-N475-5)、NS3、NS10、NS7、NS15、NS48、NS58、NS35、NS26、 NS34，NS68(编号F0-N475-5)菌株香气特性强于商用菌EC117， RV100。其中得分第一名的是NS68(编号F0-N475-5)得分均值为 6.33±0.08，且与其他菌株香气差异显著(P<0.05)。
通过对上述各类型的菌种提取DNA，做26S rDNA D1/D2区及 5.8S-ITS rDNA区PCR扩增，并将扩增产物进行基因测序，序列参见 附后提供的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，同源分析、系统发 育分析，通过BLAST同源比对，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。WL8类型的F0-N475-5菌株归属于库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii)，菌株F0-N475-5与该属模式菌株序列比对最 高同源性为99％(P.kudriavzevii KJ7946971)，确定该菌种为库德里 阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，从分类学角度暂命名为库德 里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5。已于申请日前 保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2018 年5月21日，菌种保藏号为CGMCC No.15772。经微生物学鉴定暂 命名为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5。
菌株F0-N475-5在YPD培养基上，菌落边缘整齐、表面光滑、 乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，无性繁殖均为 芽殖，有时有假菌丝，无子囊孢子和掷孢子，见附图4所示；该菌株 最适生长条件为：培养温度20-30℃，最适培养温度28℃；优先生长于YPD培养基表面，培养时间为18-24h。
实施例二：酿酒酵母的筛选
通过对获得14株酿酒酵母进行系列实验，判断其酿酒特性，筛 选适宜酿制干化酒的酿酒酵母菌株。
1、酿酒酵母一级筛选
(1)酿酒酵母常温起发性测定
分别将活化后的酿酒酵母菌种，接种于灭菌后的装有10ml葡萄 汁并有杜氏管的的试管中，确保杜氏倒管内无空气，接种量为2％， 于恒温培养箱中(28±1)℃培养，每隔2h持续观察并记录产气量及 产满杜氏倒管的时间，实验每组设三个平行。如附图5所示，通过监 测酿酒酵母发酵过程的CO2释放量，经分析得到GTGM-E2起发速率 为测试组中最快(<10h)。
(2)发酵能力测定
将菌株用YPD培养基活化24h，接种量为5％，于恒温培养箱中 (28±1)℃培养活化。将活化好的菌株接入于装有50ml新鲜赤霞珠 葡萄汁中，接种量为2％，每组做3个平行，(28±1)℃培养，测定 初始糖度及初始重量，每2天测定重量及糖度，监测CO2释放量及降糖速率，直至糖度不再变化为发酵终点，测定发酵结束后的重量、糖 度及酒精度。如附图6、附图7所示，通过监测酿酒酵母发酵过程的 降糖速率以及发酵完成后样品的酒精度的测定，经分析得到GTGM-E2降糖速率最大，CO2释放量最高。
2、酿酒酵母二级筛选
通过前期对酿酒酵母的发酵特性进行测定，得到GTGM-E2菌株 常温起发性和发酵能力优于其余13株菌酿酒酵母，通过实验菌株耐 受性实验，考察GTGM-E2菌株在发酵过程中耐糖、耐酒精、耐SO2的特性。
将活化好的菌液接种于不同胁迫条件：耐糖(模拟葡萄汁分别添 加等量葡萄糖和果糖，形成浓度梯度为260g/L、450g/L及500g/L的 高糖耐受性培养基)；耐酒精(模拟葡萄汁培养基中添加无水乙醇， 形成乙醇含量为12％、14％、16％的乙醇耐受性培养基)；耐SO2(模 拟葡萄汁培养基中添加100mg/L、150mg/L、200mg/L的含SO2溶液， 形成不同浓度的SO2溶液耐受性培养基)的耐受性测试培养基中，接 种量为2％，摇匀。取200μl培养物于96微孔板中，590nm下测其 初始吸光度OD1值。将培养物于28℃培养72h后取200μl培养物于 96微孔板中，于590nm下测其发酵后吸光度OD2。实验中以不接菌 种的培养基作为空白试样，吸光值为ODK。测定过程中实验菌株 (GTGM-E2)、商用菌株(EC1118、RV100)及空白设置3个平行。 增长倍数＝(OD2-ODK2)/(OD1-ODK1)-1。如表4所示，通过对酿酒 酵母各耐受性增长倍数测定，经分析得到GTGM-E2耐受性增长倍数 最大。
表4：酿酒酵母各耐受性增长倍数比较表
Figure BDA0001767051930000201
Figure BDA0001767051930000211
通过监测酿酒酵母发酵过程的CO2释放量、降糖速率以及发酵完 成后样品的酒精度的测定，经分析得到GTGM-E2起发速率为测试组 中最快(<10h)，降糖速率最大，CO2释放量最高、耐高糖性，耐 SO2性及产酒精度优于商用菌EC118及VR100，说明酿酒酵母 GTGM-E2为干化葡萄酒的优良菌株。
实施例三：优良菌株复配比例的确定
1.复配菌株降糖幅度、CO2产生量和产香实验
通过实施例一筛选初筛得到的非酿酒酵母库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichiakudriavzevii)F0-N475-5(序号NS68)与实施例二提供酿酒 酵母菌GTGM-E2组合为复配菌株，按照不同体积比例复配进行葡萄 酒的酿制实验，在接入菌株后开始每隔1天测定糖度与三角瓶质量变 化并且计算CO2产生量，对发酵结束后的样品，邀请15名红酒评鉴 员，进行样品香气的评定并打分。如附图8、附图9所示，由EC118 和RV100，序号NS68:GTGM-E2按照1:1降糖水平，产酒精能力与 商用菌EC118和RV100相媲美，如附图10所示，序号NS68:GTGM-E2 按照1:1的CO2释放量远远高于两商用菌，如附图11所示，序号 NS68:GTGM-E2按照1:1组果香为比较组中最高，但冲鼻的酒香低于 两商用菌，由此判断该组配比具有优良的干化酒酿制效果。
2.优良菌株复配菌株添加时序的确定
将筛选出来的发酵菌剂按照序号NS68:GTGM-E2按照1:1体积 比例接种，按照不同的添加时序(GTGM-E2高泡期加入NS68，GTGM-E2末期加入NS68、NS68高泡期加入GTGM-E2，NS68末期 加入GTGM-E2)接入相应酵母菌，28℃恒温培养，培养期间测定CO2生成量、降糖量及对发酵样品进行香气浓郁度评定，来筛选出序号 NS68与GTGM-E2的最佳接入时机。
由附图12、附图13可以看出，不同添加时序的降糖速率和CO2释放量差异显著。GTGM-E2+NS68同时添加组优于其他类型的添加 组，同时显著高于商用菌RV100和EC118对照组。将不同添加时序 的复配菌株组经发酵结束后，请15名评鉴员进行香气评定。由附图14可以看出，根据酒香评定得分均值按降序排序后，样品 GTGM-E2+NS68同时添加组的果香得分明显高于其他复配组及活性 干酵母RV100和EC118，酒香与其他对照组几乎持平。经CO2释放 量、降糖量、酒香得分、果香得分，得到GTGM-E2:NS68按照1:1 体积比例同时添加组，为本复配发酵剂的最佳复配方式。
实施例四：复合发酵组剂的制备
具体制备方法步骤如下：
(1)接种：制备库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) F0-N475-5 CGMCCNo.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513两种菌的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作， 从斜面转接至平板，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii) F0-N475-5和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2分别在温度28℃下 培养18h-24h。
所述的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCCNo.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2CGMCC No.7513的培养基为YPD培养基，制备方法为：葡萄糖20g，蛋白胨 20g，酵母浸粉10g，琼脂20g，补水1000mL，分装，灭菌，即可制备获得YPD培养基。
(2)一级培养：从步骤(1)中的固体培养基上挑取单菌落。分别 转接至装有液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，库德里阿兹威 毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5CGMCC No.15772和酿酒 酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2CGMCC No.7513在温度28℃、120r/min 培养18h-24h。
(3)二级发酵：将上述步骤一级培养菌种接种于盛有赤霞珠葡萄 汁的500mL锥形瓶中，无菌操作，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2分别 在温度28℃、120r/min培养24h-48h。
(4)复合发酵液的配伍：按照体积比计，选用步骤(3)制备的编 号为F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和酿 酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2二级发酵液按照1:1进行混合，制 备获得赤霞珠干化酒发酵的复合发酵组剂。
实施例五：复合发酵组剂发酵酿制赤霞珠干化酒
干化酒酿制流程如下：延迟采收干化→原料的分选和检验→除梗 破碎→酒精发酵→苹乳发酵→陈酿→澄清处理→灌装→瓶储
操作要点：
(1)干化葡萄酒原料的选择：挑选库尔勒乡都酒庄新疆酿酒基 地优质赤霞珠葡萄，完全成熟后推迟采摘，将赤霞珠葡萄延迟采收进 行自然干化，原料进行严格分选，要求果穗整齐成熟、着色率达100％， 采摘时葡萄可溶性固形物含量为45Brix。
(2)葡萄的除梗破碎：将挑选好的葡萄，经人工除梗，用螺旋 榨汁机进行破碎取汁。
(3)干化葡萄酒的酒精发酵：对进行除梗破碎处理的干化后赤 霞珠葡萄，输入至发酵罐中，分别均匀加入食品级偏重亚硫酸钾和果 胶酶，食品级偏重亚硫酸钾的添加量以SO2计为50mg/L，果胶酶的 添加量为0.02g/L，选用优选出的典型优良酵母复合发酵组剂F0-N475-5:GTGM-E2按照体积比1:1进行酒精发酵，复合发酵组剂接 种量按照体积百分比添加2％，温度控制在25-28℃，并每天进行循环 浸渍，监测糖度变化。
(4)干化葡萄酒的苹乳发酵：主发酵结束后，添加SO2至30mg/L， 注意及时添酒，保证在满罐、密封条件下进行苹果酸-乳酸发酵。温 度保持在20±2℃，时间为1个月左右，当检测确定苹乳发酵结束时， 终止发酵，低温保存。
(5)干化葡萄酒的陈酿：将苹乳发酵后原酒置于缸中陈酿，环 境温度保持在14-16℃，湿度保持在70-80％，定期添原酒处于满缸状 态，游离SO2含量保持在25-35mg/L，陈酿期为6-12个月。
(6)干化葡萄酒的出桶、装瓶与瓶储：干化葡萄酒陈酿后，经 品尝后决定出桶。出桶后原酒进行加入澄清用蛋清粉澄清处理后，装 瓶瓶储，瓶储期环境温度控制在12-15℃，湿度为70％-80％，且避免 光照，瓶储期12-24个月以上。
进一步，本发明提供应用上述复合发酵组剂在赤霞珠干化酒发酵 中的应用。通过利用自行筛选、分离，驯化获得库德里阿兹威毕赤酵 母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5CGMCC No.15772，通过实践与 酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513相融合试验， 实践证明制备的复合发酵组剂应用于发酵赤霞珠干化酒，有效的解决 了酵母菌发酵启动难，易提前中止，发酵后期酵母活力不足，高糖掩 盖葡萄酒香气不足等一系列问题，且发酵出的赤霞珠干化酒口感复杂 层次感突出，口香浓郁复杂，优雅细腻，余味悠长，香气和口感协调， 整体品质优异，风格突出。打破依靠活性干酵母发酵葡萄酒，风格单 一的局面，获得显著良好的技术效果。
实施例六：复合发酵组剂酿制的赤霞珠干化酒的品质
基于上述实施例的基础上，即采用提供的复合发酵组剂 F0-N475-5:GTGM-E2体积比1:1用于酿造的赤霞珠干化酒进行如下 干化酒品质实验。
1.干化赤霞珠果浆入罐时的各项指标
干化赤霞珠果浆入罐时的各项指标如表5所示。
表5：干化赤霞珠果浆入罐时各项指标
项目 指标
温度 20±2℃
糖度(手持糖度仪) 45±0.65Brix
pH 4.3
总酸 7.3±0.37(g/L)
游离SO<sub>2</sub> 9±0.46mg/L
2.赤霞珠干化酒成品酒各项指标结果
选用试验筛选出的F0-N475-5:GTGM-E2(1:1)复合发酵组剂进行 赤霞珠干化酒的酿制(20L)，并以活性干酵母(RV100)及商业菌 株(EC118)作为对照组，每组三个平行，发酵结束后的测定成品酒 各项理化指标，由表6所示，F0-N475-5:GTGM-E2(1:1)复合发酵菌剂组发酵结束后成品酒平均总糖含量(226.66±1.37g/L)低于活性干酵 母(RV100)及商业菌株(EC118)发酵的成品酒，平均酒精度 (13.23±0.01％vol)高于活性干酵母(RV100)及商业菌株(EC118) 发酵的成品酒。由表7所示，复合发酵菌剂组发酵结束后成品酒平均 总酸、游离SO2含量高于活性干酵母(RV100)及商业菌株(EC118) 发酵的成品酒。
表6：赤霞珠干化酒各指标汇总表(一)
样品 总糖(g/L) 葡萄糖(g/L) 果糖(g/L) 酒精度％vol
复合发酵菌剂 226.66±1.37<sup>d</sup> 85.19±2.42<sup>b</sup> 166.48±0.65<sup>c</sup> 13.23±0.01<sup>bc</sup>
RV100 245.21±1.73<sup>bc</sup> 94.70±0.63<sup>a</sup> 180.34±1.72<sup>a</sup> 13.07±0.01<sup>c</sup>
EC118 242.80±1.04<sup>c</sup> 84.29±0.23<sup>b</sup> 165.83±1.71<sup>c</sup> 14.10±0.01<sup>a</sup>
注:同列数据旁标不同小写字母表示差异显著，P<0.05；相同或不标字母表示差异不显著， P>0.05。
表7：赤霞珠干化酒各指标汇总表(二)
样品 总酸(g/L) 挥发酸(g/L) 总SO<sub>2</sub>(mg/L) 游离SO<sub>2</sub>(mg/L)
复合发酵菌剂 6.72±0.18<sup>a</sup> 0.120±0.003<sup>a</sup> 9.192±0.063a 64.243±0.000<sup>a</sup>
RV100 6.67±0.01<sup>a</sup> 0.110±0.005<sup>a</sup> 9.296±0.000a 55.066±0.000<sup>c</sup>
EC118 6.14±0.01<sup>b</sup> 0.123±0.025<sup>a</sup> 9.178±0.000a 58.125±0.000<sup>b</sup>
注:同列数据旁标不同小写字母表示差异显著，P<0.05；相同或不标字母表示差异不显 著，P>0.05。
4.干化酒样品主体香气分析
香气是葡萄酒重要品质指标之一，葡萄酒中各种挥发性香气物质 的含量及它们之间的平衡关系是衡量其品质的关键因素。目前葡萄酒 中己检测出的挥发性成分达到了上千种，但是挥发性成分的含量与其 对葡萄酒总体香气贡献却不一定成正比。通常，只有那些大于嗅觉阑 值的香气物质才能被感觉器官所捕获为了评估每种香气物质对葡萄 酒香气的整体贡献，计算出了每种香气物质的气味活性值 (OdorActivity Values，简称OAV)。通过AMDIS技术对GCMS总离 子流图谱进行解析，使用F0-N475-5:GTGM-E2(1:1)复合发酵组剂发 酵的赤霞珠干化酒样品中共鉴定出77种挥发性物质，并通过计算得 到其绝对含量及OAV。
表8：赤霞珠干化葡萄酒样品挥发性成分质量浓度及其OAV
Figure BDA0001767051930000271
Figure BDA0001767051930000281
Figure BDA0001767051930000291
注：同一行不同字母表示5个地区相应香气成分含量有显著差异(P＜0.05)；nd 表示为检测到；-表示未描述；A(水果味)、B(化学味)C(芬芳花香)D(植物味) E(坚果味)F(微生物味)G(焦糖味)
如表8所示，使用F0-N475-5:GTGM-E2(1:1)复合发酵组剂发 酵的赤霞珠干化酒样品中共准确定量分析出了77种挥发性物质，它 们质量浓度范围在0.05ug/L-21.31mg/L之间，所检测出的物质包括12 个类别，分别是C6醇、高级醇、酚、醛、脂肪酸、降异戊二烯、酮、萜烯、乙酸酯、脂肪酸乙酯、其他酯类。赤霞珠干化酒挥发性成分总 含量为136.50mg/L。其中包含物质种类最多的为酯类物质，分别包 括34种，34种酯类物质中包含4种乙酸酯、17种脂肪酸乙酯，13 种其他酯类物质。气味活性值(OAV)分析表明，有7种物质在赤霞 珠干化酒样品中具有香气活性(即OAV>1)，其中OAV大于10的 物质分别为丁酸乙酯和β-大马士酮，为此干化酒的典型香气化合(浓 郁的甜型果香)。香气成分中OAV低于1的挥发性化合物，也是为 葡萄酒提供潜在香气的不可忽视的一部分内容。
(1)醇类化合物：直链高级醇或杂醇油大多是伴随乙醇产生的 发酵副产物，是葡萄酒中含量最多的挥发性物质。如表8所示，赤霞 珠干化葡萄酒共鉴定出21种醇类化合物，醇类化合含量在测定出的 挥发性化合物中含量为113.51mg/L，研究表明在葡萄酒中的高级醇质 量浓度低于300mg/L时，会使葡萄酒复杂且宜人的风味更加突出， 但当其质量浓度一旦超过400mg/L时，则使葡萄酒香气失去平衡， 反而对葡萄酒的香气产生负面影响。赤霞珠干化葡萄酒的高级醇含量 均低于300mg/L，属正常范围，对酒品的香气复杂性有贡献作用。
(2)有机酸化合物：葡萄酒中挥发性酸类物质主要在发酵过程中产 生，其对葡萄酒中具有果香气味酯类物质的形成具有重要作用。使用 F0-N475-5:GTGM-E2(1:1)复合发酵组剂发酵的赤霞珠干化酒样品 的有机酸种类及含量远远少于和地于常规葡萄酒，为此干化酒的另外 一显著特点。
(3)酯类化合物：酯类化合物是一种良好的风味物质，大多呈 现水果的香气。如表8所示，实验中赤霞珠干化酒样品共检测出34 种酯类物质，按化学结构可将其分为乙酸酯、脂肪酸乙酯、其他酯类， 其种类分别为4种、17种、13种，其中香气活度值超过1的有四种，总香气活度值远远高于其他香气化合物，是此干化酒的浓郁果香的重 要贡献香气化合物群体，为此酒型的显著特点。
(4)醛类化合物物种，具有蜜香的苯乙醛香气活度值为 3.638±0.097，为此干化酒甜香物质的重要贡献者，此不同于甜型酒中 的呋喃类物质。
实施例七：复合发酵组剂酿制的赤霞珠干化酒感官评定
由10名行业内匿名抽检红酒评鉴员组成评定小组，对4个赤霞 珠干化葡萄酒样品(其中1号：活性干酵母RV100发酵赤霞珠干化 葡萄酒，2号：商业菌株EC118酿制的赤霞珠干化葡萄酒，3号：酵 母菌GTGM-E2发酵赤霞珠干化葡萄酒，4号：复合发酵组剂 FO-N475-5:GTGM-E2(1:1)发酵赤霞珠干化葡萄酒，5号：市售干 化葡萄酒产品1，6号：市售干化葡萄酒产品2，进行了各项指标(外 观、香气、口感、整体等)质量优劣排序。
表9：6种赤霞珠干化酒外观排序检验统计表
Figure BDA0001767051930000311
Figure BDA0001767051930000321
表10：6种赤霞珠干化酒香气喜排序检验统计表
Figure BDA0001767051930000322
表11：6种赤霞珠干化酒口感排序检验统计表
Figure BDA0001767051930000323
表12：6种赤霞珠干化酒整体特征排序检验统计表
Figure BDA0001767051930000331
由表9、表10、表11和表12所示，GTGM-E2:NS68(1:1)同 时添加酿制赤霞珠干化葡萄酒的外观、口感、香气、整体特征均高于 其他五组对照组，且各项评分均高于2种市售商品干化葡萄酒，表明 库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCCNo.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513(1:1) 复合发酵组剂发酵的赤霞珠干化葡萄酒具优良酿酒感官的特征。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实 施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基 础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有 的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处 于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 塔里木大学
<120> 一种复合发酵组剂及其在酿制赤霞珠干化酒中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 580
<212> DNA
<213> 酵母菌(Saccharomyce)
<400> 1
acagggtttg ctcatagcgg cgagtgagcg gcaagagctc agatttgaaa tcgtgctttg 60
cggcacgagt tgtagattgc aggttggagt ctgtgtggaa ggcggtgtcc aagtcccttg 120
gaacagggcg cccaggaggg tgagagcccc gtgggatgcc ggcggaagca gtgaggccct 180
tctgacgagt cgagttgttt gggaatgcag ctccaagcgg gtggtaaatt ccatctaagg 240
ctaaatactg gcgagagacc gatagcgaac aagtactgtg aaggaaagat gaaaagcact 300
ttgaaaagag agtgaaacag cacgtgaaat tgttgaaagg gaagggtatt gcgcccgaca 360
tggggattgc gcaccgctgc ctctcgtggg cggcgctctg ggctttccct gggccagcat 420
cggttcttgc tgcaggagaa ggggttctgg aacgtggctc ttcggagtgt tatagccagg 480
gccagatgct gcgtgcgggg accgaggact gcggccgtgt aggtcacgga tgctggcaga 540
acggcgcaac accgcccgtc ttaaaccccc ggaccaaaag 580
<210> 2
<211> 487
<212> DNA
<213> 酵母菌(Saccharomyce)
<400> 2
catgcgggga ggtattactg cagatttagt actacactgc gtgagcggaa cgaaaacaaa 60
aacacctaaa atgtggaata tagcatatag tcgacaagag aaatctacga aaaacaaaca 120
aaactttcaa caacggatct cttggttctc gcatcgatga agagcgcagc gaaatgcgat 180
acctagtgtg aattgcagcc atcgtgaatc atcgagttct tgaacgcaca ttgcgcccct 240
cggcattccg gggggcatgc ctgtttgagc gtcgtttcca tcttgcgcgt gcgcagagtt 300
gggggagcgg agcggacgac gtgtaaagag cgtcggagct gcgactcgcc tgaaagggag 360
cgaagctggc cgagcgaact agactttttt tcagggacgc ttggcggccg agagcgagtg 420
ttgcgagaca acaaaaagct cgacctcaaa tcaggtagga atacccgctg aacttaagca 480
tatcaaa 487

Claims (8)

1.一种适用于赤霞珠干化酒酿造的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5，其特征在于，所述的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5保藏编号为CGMCC No.15772。
2.如权利要求1所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5酿制获得的赤霞珠干化酒。
3.一种适用于赤霞珠干化酒酿造的复合发酵组剂，其特征在于，所述的复合发酵组剂由库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCC No.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513按照体积比1:1进行复配后组成。
4.如权利要求3所述复合发酵组剂酿制获得的赤霞珠干化酒。
5.如权利要求3所述复合发酵组剂的制备方法，其特征在于，所述的复合发酵组剂的制备方法：
(1)接种：制备非酿酒酵母库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5CGMCC No.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513两种菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)F0-N475-5和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2分别在温度28℃下培养18h-24h；
(2)一级培养：从步骤(1)中的固体培养基上挑取单菌落，分别转接至装有液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5CGMCC No.15772和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513在温度28℃、120r/min培养18h-24h；
(3)二级发酵：将上述步骤一级培养菌种分别接种于盛有赤霞珠葡萄汁的500mL锥形瓶中，无菌操作，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5 CGMCCNo.15772和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513在温度28℃、120r/min培养24h-48h；
(4)复合发酵组剂的配伍：按照体积比计，选用步骤(3)制备的编号为F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)二级发酵液和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2二级发酵液按照体积比1:1进行混合，制备获得复合发酵组剂。
6.如权利要求5所述复合发酵组剂的制备方法，其特征在于，所述的复合发酵组剂中，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)F0-N475-5CGMCC No.15772与酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC No.7513的培养基为YPD培养基，制备方法为：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂20g，补水至1000mL，分装，灭菌，即可制备获得YPD培养基。
7.如权利要求3所述复合发酵组剂酿制赤霞珠干化酒的方法，其特征在于，所述的酿制方法步骤如下：
(1)干化葡萄酒原料的选择：挑选优质赤霞珠葡萄，完全成熟后推迟采摘，将赤霞珠葡萄延迟采收进行自然干化，原料进行严格分选，要求果穗整齐成熟、着色率达100％，采摘时葡萄可溶性固形物含量为45Brix；
(2)葡萄的除梗破碎：将挑选好的葡萄，经人工除梗，用螺旋榨汁机进行破碎取汁；
(3)干化葡萄酒的酒精发酵：对进行除梗破碎处理的干化后赤霞珠葡萄，输入至发酵罐中，分别均匀加入食品级偏重亚硫酸钾和果胶酶，食品级偏重亚硫酸钾的添加量以SO2计为50mg/L，果胶酶的添加量为0.02g/L；选用F0-N475-5的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)二级发酵液和酿酒酵母(S.cerevisiae)GTGM-E2二级发酵液按照1:1进行混合制备的复合发酵组剂进行酒精发酵，复合发酵剂接种量为2％，温度控制在25-28℃，并每天进行循环浸渍，监测糖度变化；
(4)干化葡萄酒的苹乳发酵：主发酵结束后，添加SO2至30mg/L，注意及时添酒，保证在满罐、密封条件下进行苹果酸-乳酸发酵，温度保持在20±2℃，时间为1个月，当检测确定苹乳发酵结束时，终止发酵，低温保存；
(5)干化葡萄酒的陈酿：将苹果酸-乳酸发酵后原酒置于罐中陈酿，环境温度保持在14-16℃，湿度保持在70-80％，定期添原酒处于满缸状态，游离SO2含量保持在25-35mg/L，陈酿期为6-12个月；
(6)干化葡萄酒的出桶、装瓶与瓶储：干化葡萄酒陈酿后，经品尝后出桶，出桶后原酒进行加入澄清用蛋清粉澄清处理后，装瓶瓶储，瓶储期环境温度控制在12-15℃，湿度为70％-80％，且避免光照，瓶储期为12-24个月以上。
8.如权利要求7所述复合发酵组剂酿制赤霞珠干化酒的方法酿制获得的赤霞珠干化酒。
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