CN116083263A - 一种产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株及其应用 - Google Patents
一种产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株及其应用，本发明从贵州罗甸火龙果枝干上分离筛选得到一株库德里阿兹威式毕赤酵母，该非酿酒酵母保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:2022300，名称为Z03M。将Z03M应用于火龙果果酒发酵中，所得果酒具有花果香浓郁、酒香清幽等特征，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯等风味物质明显增加，该菌可应用于低度火龙果果酒酿造中，能明显提高火龙果酒品质，有利于促进火龙果果酒的发展。属于酿酒工程领域。
Description
技术领域
本发明涉及果酒酿造技术领域，具体涉及一种具有产香功能库德里阿兹威式毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)的分离、鉴定及其在火龙果果酒酿造中的应用。
背景技术
火龙果在我国种植面积广、产量多、品质高，但食用方式较为单一，大多以鲜果销售为主，缺乏规范的、专业的火龙果营销机构和目标市场，鲜果于盛产期集中大量上市，不仅造成价格低廉，还会因量大滞销导致果子腐烂，销售价格下滑严重，给农户和企业带来巨大的经济损失。更重要的是，火龙果是一种季节性水果,具有产期短、贮藏性差、肉质纤维容易老化和腐烂、不利于长途运输等局限。以火龙果为原料酿造的火龙果果酒不仅大大延长了市场供应期，还将火龙果中丰富的营养价值与酒的特殊风味相结合。然而，火龙果自身有机酸和酯类芳香因子等风味化合物含量较少，导致酿造出的火龙果果酒风味不足，难以满足消费者的需求。
近年，非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵果酒受到越来越多研究者的关注，在发酵过程中非酿酒酵母分泌的多种胞外酶将与香气前体物质相互作用，从而形成酯类、酸类、醇类化合物等代谢产物，对果酒增香、丰富口感具有举足轻重的作用。果酒风味物质主要通过酵母代谢产生，因此产香酵母的筛选和应用对提高果酒品质具有重要意义。
目前针对葡萄酒生产工艺和产品需求研究较多，所分离筛选的菌株多以葡萄酒酵母为主，而不同酵母菌对碳源种类的“偏爱性”具有较大差异，因此葡萄酒酵母应用于其它类型果酒生产中产香效果并不明显。所以，从火龙果生长的原生环境中筛选具有产香能力的非酿酒酵母，可为酒香清幽、果香浓郁的高品质火龙果果酒酿造提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株及其应用，从火龙果生长的原生环境中筛选具有产香能力的非酿酒酵母，为酒香清幽、果香浓郁的高品质火龙果果酒酿造提供技术支撑。
本发明是这样实现的：提供一种产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株,该菌株分离筛选自贵州罗甸火龙果枝干上，经DNA序列比对，该菌株与库德里阿兹威式毕赤酵母(Z03M，Pichia kudriavzevii)模式菌株的DNA序列相似性为99％，菌株DNA序列如SEQ IDNO.1所示，保藏编号为：CCTCC NO:2022300，保藏日期为：2022年3月23，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明还提供了一种所述产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株的应用，该应用是在火龙果果酒酿造中接种该菌株以增加火龙果果酒的风味成分。
前述应用中，所酿造火龙果果酒酒度为7.75％vol，所述接种的是该菌株的液态菌剂，所述液态菌剂是将该菌剂的种子液接种到无菌液体培养基中，于28℃培养24-48h；所述火龙果果酒酿造使用火龙果发酵培养基，火龙果发酵培养基是将火龙果剥皮、切块、榨汁、下胶、巴式灭菌、冷却后接种已活化的上述种子液制备而成。
与现有技术相比，本发明在火龙果果酒酿造过程中加入所述库德里阿兹威式毕赤酵母的液体菌剂，可提高发酵速率、增加火龙果果酒中的风味物质(乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯)，尤其增加了丁酸乙酯、乙酸异戊酯的含量，对改善火龙果果酒的品质具有重要意义，具有很好的应用价值。
附图说明
图1是菌株YPD在xx培养基上的菌落形态图(a)和在光学显微镜下的细胞形态图(b)；
图2是基于ITS序列的库德里阿兹威式毕赤酵母Z03M的系统发育树；
图3是火龙果果汁以及该菌株对比自然发酵、商业酵母发酵、该株菌+商业酵母混菌发酵酿造火龙果果酒中挥发性风味物质气相质谱色谱对比图，注：YGZ(火龙果果汁)、ZR(自然发酵)、ZM03、(ZM03菌株发酵)、SY(商业菌种发酵)、HJ(ZM03菌株+商业菌种混合发酵)。
具体实施方式
为使本发明阐述的更为清楚明了，下面结合附图对本发明做进一步详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例提供一种产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株,该菌株分离筛选自贵州罗甸火龙果枝干上，经DNA序列比对，该菌株与库德里阿兹威式毕赤酵母(Z03M，Pichiakudriavzevii)模式菌株的DNA序列相似性为99％，菌株DNA序列如SEQ ID NO.1所示，保藏编号为：CCTCC NO:2022300，保藏日期为：2022年3月23，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
该菌株(库德里阿兹威式毕赤酵母Z03M)的分离方法如下：
(1)YPD培养基分离与显微观察：将火龙果枝干样品加入无菌水置于150r/min振荡培养20min，待稀释后涂布于YPD培养基中，28-30℃培养2-3d。挑出单菌落用划线法纯化3-4次，记录菌落特征，同时挑取菌落制成玻片，置于400×显微镜下观察细胞形态特征。
(2)按照酵母菌基因组DNA提取试剂盒(美国BIOMIGA公司)提取真菌DNA。将DNA测序结果输入美国国家生物技术信息中心NCBI(National Center ofBiotechnologyInformation)数据库进行比对，选取同源性较高的菌株序列作为参照，用MEGA 5.05软件构建菌株系统发育树，进行菌种鉴定。
YPD培养基纯培养为乳白色圆球形凸起、奶油状和边缘完整；显微观察细胞呈卵圆形；以上游引物NL1(5'-GCATATCAATAGCGGAGGAAAAG-3')和下游引物NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')对酵母进行PCR扩增，对扩增产物进行测序。测序结果在NCBI数据库中进行BLASTn分析比对，选取同源性较高的菌株序列作为参照，用MEGA5.0软件进行菌株系统发育树的构建，完成菌种的鉴定。确定其与库德里阿兹威式毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)菌株的相似性为99％。
实施例2库德里阿兹威式毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)在实验室小型火龙果果酒酿造中的产香研究
实验室小型火龙果果酒酿造时，接种该菌株于火龙果发酵培养基中，通过测量酒精度和残糖量监测发酵终点，利用气相色谱质谱仪检测最终发酵液中挥发性风味物质含量，具体方案如下：
1.火龙果的选择及预处理，选择九分熟、无虫害、无腐烂的火龙果为原料，剥皮捣碎成果浆备用。
2.发酵培养基的制备：在上述果浆中添加0.4％果胶酶、0.0125％焦亚硫酸钠，搅拌均匀后置于50℃水浴2h；果浆酶解后于5000r/min条件下离心10min，获得火龙果清汁；用白砂糖将火龙果清汁糖度调至24°Bx，65℃巴氏杀菌20min。
3.实验室小型火龙果果酒酿造实验：将所述库德里阿兹威式毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)接入20mL的麦芽汁培养基，于28℃静置培养过夜。用血球计数板计数后按照接种量1×106cells/mL接种至火龙果发酵培养基中，置于28℃进行密闭培养，每24h取样测酒精度和残糖量。
4.发酵液中风味物质的检测：
顶空条件：吸取10mL火龙果果酒发酵液样品加氯化钠饱和，装入顶空进样瓶中于35℃下孵化2min，利用萃取头(50/30μm PDMS/DVB/CAR)振荡(250r/min)萃取30min；于180℃下解吸5min后进样。
气相色谱质谱条件：色谱柱为DB-WAS(30m×0.25mm×0.25μm，AgilentTechnologies Ltd.，Santa Clara，CA，USA)、进样口温度240℃、温度程序为40℃以1℃/min升高至45℃(保持2min)，以3℃/min升高至85℃(保持2min)，以3℃/min升高至120℃(保持3min)，以3℃/min升高至200℃，以5℃/min升到230℃。FID检测器检测温度为250℃、氦气流速0.8mL/min，进样方式为不分流进样。
该菌株发酵周期为7天，最终火龙果果酒酒度为7.75％vol，残糖量为14.07°Bx。
实施例3对照商业酵母菌在实验室小型火龙果果酒酿造中的风味物质研究
实验室小型火龙果果酒酿造时，接种商业酵母菌于火龙果发酵培养基中，通过酒精度和残糖量监测发酵终点，利用气相色谱质谱仪检测最终成品中风味物质种类，具体方案如实施例2所述。
该商业酵母菌菌株发酵周期为7天，最终发酵液酒度为20％vol，残糖量为7.43°Bx。相较于该对照菌株，库德里阿兹威式毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)发酵速率适宜，发酵过程中产生的风味物质种类较多，适用于低度火龙果果酒酿造。
实施例4对照商业酵母菌+ZM03菌株在实验室小型火龙果果酒酿造中的风味物质研究
实验室小型火龙果果酒酿造时，按比例1:1接种商业酵母菌、ZM03菌株于火龙果发酵培养基中，通过酒精度和残糖量监测发酵终点，利用气相色谱质谱仪检测最终发酵液中风味物质种类，具体方案如实施例2所述。
该混菌发酵周期为7天，最终发酵液酒度为11.5％vol，残糖量为11.2°Bx。相较于该菌株单独发酵，库德里阿兹威式毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)与商业酵母混合发酵速率适宜，发酵过程中产生的风味物质种类最多，适用于低度火龙果果酒酿造。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株，其特征在于：该菌株分离筛选自贵州罗甸火龙果枝干上，经DNA序列比对，该菌株与库德里阿兹威式毕赤酵母(Z03M，Pichiakudriavzevii)模式菌株的DNA序列相似性为99％，菌株DNA序列如SEQ ID NO.1所示，保藏编号为：CCTCC NO:2022300，保藏日期为：2022年3月23，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
2.权利要求1所述产酯香型库德里阿兹威式毕赤酵母菌株的应用，其特征在于：该应用是在火龙果果酒酿造中接种该菌株以增加火龙果果酒的风味成分。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所酿造火龙果果酒酒度为7.75％vol，所述接种的是该菌株的液态菌剂，所述液态菌剂是将该菌剂的种子液接种到无菌液体培养基中，于28℃培养24-48h；所述火龙果果酒酿造使用火龙果发酵培养基，火龙果发酵培养基是将火龙果剥皮、切块、榨汁、下胶、巴式灭菌、冷却后接种已活化的上述种子液制备而成。
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