CN114806904A - 一种功能微生物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种功能微生物及其制备方法与应用，所述功能微生物包括从苗家白酸汤中筛选到的马克斯克鲁维酵母菌YK2021‑2、干酪乳杆菌LB20201；所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021‑2、干酪乳杆菌LB20201均进行保藏，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021‑2已于2021年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61737；所述干酪乳杆菌LB20201已于2020年6月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No∶61034；混合用于发酵荞麦酸汤，在提高荞麦酸汤风味的同时；能有效的发挥或强化荞麦原料中的保健功能性成分。

Description

一种功能微生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体是一种功能微生物及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平及健康意识的提高，谷物和全谷物制品受到了我国消费者的关注，其中，荞麦是一种被国际公认的药食兼用的粮食作物，且已被贵州列入优质特色粮食作物，与糯米、小麦、玉米等其他谷物相比，其含有丰富的营养元素，如抗性淀粉、蛋白质、脂肪、膳食纤维等，还有一些功能成分，如多酚类、荞麦糖醇、活性肽等物质。目前，荞麦类的食品已日渐成为市场上一种深受大众欢迎的新型健康食品，其具有风味独特、营养保健价值高的特点(Gusko，2021)，大量研究表明，发酵可提高荞麦的营养价值(黄俊，2019；兰晓勇，2019；Song etal.2020)，如抗氧化活性。微生物发酵引起的生物转化作用得到提高，从而将一定的益生功能给予到传统谷类食品，这是一种高附加值性能食品的加工办法。荞麦中被称为“第七类营养素”的多酚类物质，其主要包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等，具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂等功效，是具有潜在促进健康作用的化合物。
从目前全球市场谷物深加工的发展趋势看，以谷物为主要原材料经过乳酸菌发酵制成各类发酵产品是拓展谷物食品消费渠道的一个重要途径，如一种干酪乳杆菌LB20201及其应用 (CN111676167A)，主要使用单一菌种发酵制备发酵产品，较难达到混合菌类发酵产品的效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种功能微生物及其制备方法与应用，有效的发挥和强化荞麦原料中的保健功能性成分的同时，得到口感酸爽，风味浓郁，有机酸和挥发性风味化合物含量显著提高的荞麦酸汤。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种功能微生物，包括马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201；所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201 均进行保藏，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2(Kluyveromyces marxianus)已于2021年 7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:6173 7；所述干酪乳杆菌LB20201(Lactobacillus casei)已于2020年6月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO∶61034，保藏期限为30年。
进一步的，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2和所述干酪乳杆菌LB20201的体积比为 1:5。
进一步的，马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的筛选方法，包括以下步骤：
对传统发酵白酸汤进行高通量测序，以确定优势微生物；
其后根据测序结果，配制YPD培养基对优势菌株进行分离筛选，得到筛选分离后的优势菌株；
其后将筛选出的优势菌株进行纯化，并在YPD培养基上培养，得到纯化的各优势菌株的单个菌株菌落；
其后在单个菌株菌落中提取样本进行测序，并进行同源性比对，同时进行菌株系统发育树构建；
其后在确定所属的菌株以及系统发育树的前提下，将单菌菌悬液分别接种于糯米米汤中进行发酵，得到白酸汤发酵液；
对得到的白酸汤发酵液进行总酸和pH值的测定，并结合感官评定对菌株发酵性能进行分析，以筛选出传统发酵白酸汤中发酵性能较好的马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2。
进一步的，所述干酪乳杆菌LB20201的筛选方法采用一种干酪乳杆菌LB20201及其应用 (CN111676167A)中的筛选方法。
进一步的，一种功能微生物的制备方法，包括以下步骤：
马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的活化：取冻存于-80℃的马克斯克鲁维酵母菌YK2021- 2，其后接种于YPD琼脂培养基中，马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的体积为100μL，其后在30℃下活化48h；其后挑取活化后的一个单菌落接种于YPD液体培养基中，其后在30℃摇瓶活化18h备用；
干酪乳杆菌LB20201的活化：取冻存于-80℃干酪乳杆菌LB20201，其后接种于MRS琼脂培养基中，干酪乳杆菌LB20201的体积为100μL，其后在37℃活化12h；其后挑取活化后的单菌落接种于MRS肉汤培养基中，其后在37℃下摇瓶活化12h；
按体积比为1:5的比例分别取经过两次活化后的马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2与干酪乳杆菌LB20201混合形成功能微生物。
进一步的，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2与干酪乳杆菌LB20201的初始菌液浓度均为1×108CFU/mL。
进一步的，所述功能微生物用于提升发酵过程中荞麦酸汤的功能性成分。
进一步的，荞麦酸汤的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：样品制备
S11、荞麦粉的制备：称取干燥的甜荞麦种子粉碎，其后过80目筛备用；
S12、荞麦培养基的制备：称取步骤S11得到的荞麦粉溶于水中配制成溶液，所述荞麦粉的质量数值为水的体积数值的3％，其后添加70U/g的α-淀粉酶，在70℃下液化10min；其后添加560U/g的糖化酶，在60℃下保温120min；其后取75mL保温后的溶液装于容器中作为样品，在0.1Mpa、115℃条件下进行高压蒸汽灭菌15min；其后取出放置至室温；
S2：发酵
将功能微生物接种于步骤S12得到的荞麦粉液体培养基中，所述功能微生物的体积为所述荞麦粉液体培养基体积的4％，其后在33℃下恒温发酵74h。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将功能微生物应用到荞麦酶解液中进行发酵，结果表明功能微生物发酵荞麦，使荞麦酸汤颜色均匀有光泽，酸爽适口，荞麦风味浓郁。
(2)功能微生物发酵荞麦，使荞麦酸汤中总黄酮和总酚含量增加。研究了功能菌株发酵过程中荞麦酸汤的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS+自由基清除率，结果表明，功能微生物发酵荞麦，使荞麦酸汤的抗氧化活性增加。
(3)功能微生物发酵荞麦，在荞麦酸汤中共检测了苹果酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、乙酸六种有机酸
(4)功能微生物发酵荞麦，荞麦发酵前后共有41种多酚类物质的差异代谢物，功能微生物混菌发酵促进了芹菜素、4-羟基苯甲醛、阿夫儿茶精等物质含量的增加；桑色素、3',4',5,7- 四羟基异黄酮、芍药素葡萄糖苷、飞燕草素、儿茶精、香兰素、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芒柄花苷等黄酮类和酚类物质的次级代谢产物在荞麦培养基中差异极显著。
(5)功能微生物发酵荞麦酸汤，相对于单菌株发酵荞麦酸汤，使荞麦的抗氧化活性增加，功能性成分含量提高，有机酸和挥发性风味化合物含量也明显提高，为功能微生物的应用和荞麦发酵食品的开发提供了一定的理论根据。
说明书附图
图1：荞麦发酵过程中还原糖含量变化图；
图2：荞麦发酵过程中总酸含量变化图；
图3：荞麦发酵过程中荞麦发酵过程中pH值变化图；
图4：荞麦发酵过程中总黄酮含量变化图；
图5：荞麦发酵过程中总酚含量含量变化图；
图6：荞麦发酵过程中抗氧化能力测试图；
图7：荞麦发酵过程中感官得分图；
图8：乳酸菌发酵过程有机酸含量变化图；
图9：酵母菌发酵过程有机酸含量变化图；
图10：混菌发酵过程有机酸含量变化图；
图11：荞麦发酵过程中不同种类挥发性风味物质含量图；
图12：乳酸菌发酵过程中风味物质PCA得分散点图(A)和PLD-DA模型得分散点图(B)；；
图13：乳酸菌发酵过程中风味物质PLS-DA模型置换检验图C；
图14：酵母菌发酵过程中风味物质PCA得分散点图(D)和PLD-DA模型得分散点(E)；
图15：酵母菌发酵过程中风味物质PLS-DA模型置换检验图F；
图16：混菌发酵过程中风味物质PCA得分散点图(G)和PLD-DA模型得分散点(H)；
图17：混菌发酵过程中风味物质PLS-DA模型置换检验图I；
图18：荞麦发酵过程中风味物质差异代谢物热图；
图19：荞麦发酵前后样本PCA得分散点图；
图20：荞麦发酵前后样本OPLS-DA模型得分散点图；
图21：荞麦发酵前后样本OPLS-DA置换检验结果图；
图22：QC样品提取离子流图PART1；
图23：QC样品提取离子流图PART2；
图24：QC样品提取离子流图PART3；
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
一种功能微生物，包括马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201；所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201均进行保藏，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2(Kluyveromycesmarxianus)已于2021年07月05日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：61737；所述干酪乳杆菌LB20201(Lactobacilluscasei)已于2020年6月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO∶61034；所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201苗家白酸汤中筛选到，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2和所述干酪乳杆菌LB20201的体积比为1:5。实施例1：
一种功能微生物发酵荞麦酸汤对其功能提升的方法，包括以下步骤：
S1、样品制备
S11、荞麦粉的制备：称取干燥的甜荞麦种子粉碎，其后过80目筛备用；
S12、荞麦培养基的制备：称取步骤S11得到的荞麦粉溶于水中配制成溶液，所述荞麦粉的质量数值为水的体积数值的3％，其后添加70U/g的α-淀粉酶，在70℃下液化10min；其后添加560U/g的糖化酶，在60℃下保温120min；其后取75mL保温后的溶液装于容器中作为样品，在0.1Mpa、115℃条件下进行高压蒸汽灭菌15min；其后取出放置至室温；
S2、功能微生物的制备
S21、菌株活化：
马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的活化：取冻存于-80℃的马克斯克鲁维酵母菌YK2021- 2，其后接种于YPD琼脂培养基中，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的体积为100μL，其后在30℃下活化48h；其后挑取活化后的一个单菌落接种于YPD液体培养基中，其后在30℃下摇瓶活化18h备用；
干酪乳杆菌LB20201的活化：取冻存于-80℃干酪乳杆菌LB20201，其后接种于MRS琼脂培养基中，干酪乳杆菌LB20201的体积为100μL，其后在37℃活化12h；其后挑取活化后的单菌落接种于MRS肉汤培养基中，其后在37℃下摇瓶活化12h；
所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2与干酪乳杆菌LB20201的初始菌液浓度均为 1×108CFU/mL；
S22、菌株混合：按体积比为1:5的比例取均经过两次活化后的马克斯克鲁维酵母菌 YK2021-2与干酪乳杆菌LB20201混合形成功能微生物；
S3、发酵荞麦酸汤
其后将功能微生物按4％(v:v)接种于荞麦粉液体培养基中，其后在33℃下恒温发酵74h。
实施例2
一种功能微生物发酵荞麦酸汤对其功能提升的方法，包括以下步骤：
S1、样品制备
S11、荞麦粉的制备：称取干燥的甜荞麦种子粉碎，其后过80目筛备用；
S12、荞麦培养基的制备：称取步骤S11得到的3％(m:v)荞麦粉溶于水中，其后添加70U/g的α-淀粉酶，在70℃下液化10min；其后添加560U/g的糖化酶，在60℃下保温120min；其后取75mL装于150ml三角瓶中作为样品，在0.1Mpa、115℃条件下进行高压蒸汽灭菌15min；其后取出放置至室温；
S2、菌株活化
马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的活化：取冻存于-80℃的马克斯克鲁维酵母菌YK2021- 2，其后接种于YPD琼脂培养基中，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的体积为100μL，其后在30℃下活化48h；其后挑取活化后的一个单菌落接种于YPD液体培养基中，其后在30℃下摇瓶活化18h备用；所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2为1×108CFU/mL；
S3、发酵荞麦酸汤
取均经过两次活化后的马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2，其后按4％(v:v)接种于荞麦粉液体培养基中，其后在33℃下恒温发酵74h。
实施例3：
一种功能微生物发酵荞麦酸汤对其功能提升的方法，包括以下步骤：
S1、样品制备
S11、荞麦粉的制备：称取干燥的甜荞麦种子粉碎，其后过80目筛备用；
S12、荞麦培养基的制备：称取步骤S11得到的3％(m:v)荞麦粉溶于水中，其后添加70U/g的α-淀粉酶，在70℃下液化10min；其后添加560U/g的糖化酶，在60℃下保温120min；其后取75mL装于150ml三角瓶中作为样品，在0.1Mpa、115℃条件下进行高压蒸汽灭菌15min；其后取出放置至室温；
S2、菌株活化
干酪乳杆菌LB20201的活化：取冻存于-80℃干酪乳杆菌LB20201，其后接种于MRS琼脂培养基中，干酪乳杆菌LB20201的体积为100μL，其后在37℃活化12h；其后挑取活化后的单菌落接种于MRS肉汤培养基中，其后在37℃下摇瓶活化12h；所述干酪乳杆菌LB20201的初始菌液浓度均为1×108CFU/mL；
S3、发酵荞麦酸汤
取均经过两次活化后的干酪乳杆菌LB20201，其后按4％(v:v)接种于荞麦粉液体培养基中，其后在33℃下恒温发酵74h。
化学组分检测
对实施例中样品发酵过程中的化学组分的测定采用植物MRM广泛靶标代谢组学技术，全面系统的分析荞麦发酵前和接种功能菌株发酵后，发酵液中主要的多酚类物质变化，并对多酚类差异代谢物与抗氧化活性进行Pearson相关性分析，了解抗氧化活性与多酚类物质的相关性。
(1)还原糖、总酸、pH值、总黄酮、总酚含量测定
为了解单一菌种发酵和混合菌种发酵的荞麦水解液中理化指标的差异，测定了荞麦水解液和糯米粉水解液中的总糖、还原糖、总酸、总黄酮、总酚等理化指标，测定结果见表1。
(1.1)总酸(以乳酸计)的测定：参照国标GB/T12456-2008《食品中总酸的测定》(中国食品发酵工业研究院，2008)；pH值：参照国标GB5009.237-2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》(中国食品发酵工业研究院，2016)；还原糖：采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定(刘彩婷等，2020)，还原糖测定结果如图1所示，总酸测定结果如图1所示，pH 测定结果如图3所示。
(1.2)总黄酮的测定
总黄酮含量参照国内殷晓翠(殷晓翠等人于2019年在《食品工业科技》40(12):31-37中发表的文章)和国内Wang Fan(Wang F etal.于2017年在《Food Science AndTechnology International》23(2):119-127中发表的文章)的方法。以芦丁溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线，其回归曲线方程为：Y＝0.0067x-0.0014(R2＝0.999)。样品测定：用移液管精确量取制备好的1.00mL待测样品于10mL容量瓶中，加纯净水定容，按照上述方法，测定吸光度并根据标准曲线计算相应总黄酮的含量，测定结果如图4所示。
(1.3)总酚含量的测定
总酚含量的测定参照国内徐辉艳等(徐辉艳等人于2009年在《食品研究与开发》30(03):126-128中发表的文章)方法建立标准曲线；其回归曲线方程为：Y＝0.0545x-0.0005 (R2＝0.999)。
样品的测定：用移液管精确量取制备好的待测样品溶液0.50mL于50mL容量瓶中，用纯净水定容，按照上述方法，测定其吸光度，并根据标准曲线计算相应总酚的含量；测定结果如图5所示。
表1：荞麦水解液中理化指标
Figure RE-GDA0003643144000000071
由表1可知，在荞麦水解液中检测到少量总酸、总黄酮和总酚。
由图1可知：混菌发酵对还原糖利用率最高，其次为马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2发酵，干酪乳杆菌LB20201发酵对还原糖利用率最低。荞麦酸汤中，在混菌发酵74h时，还原糖含量为3.00mg/mL，干酪乳杆菌LB20201单菌株发酵74h时，还原糖含量为10.29mg/mL；在12～24h时，荞麦培养基中，马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2和混菌发酵还原糖含量显著降低，在该过程中菌株生长代谢活力旺盛，还原糖作为碳源，为菌株生长提供营养物质，36～74h 还原糖含量基本趋于稳定。
由图2可知：荞麦发酵过程中混菌发酵总酸含量明显低于干酪乳杆菌LB20201单菌株发酵。但在发酵0～12h时，与干酪乳杆菌LB20201单菌株发酵相比，混菌发酵促进总酸含量的增加；36～74h时，混菌发酵体系中总酸含量低于干酪乳杆菌LB20201单菌株发酵。pH值变化趋势与总酸变化趋势相似，干酪乳杆菌LB20201单菌株发酵的荞麦酸汤中pH值最低；荞麦中的糖类为干酪乳杆菌LB20201的生长提供了大量的营养物质，促进干酪乳杆菌LB20201的代谢，使得荞麦酸汤中总酸含量明显增加。
由图4可知：荞麦液体培养基中总黄酮含量为10.96μg/mL，功能微生物马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201单菌株发酵和混菌发酵后，总黄酮含量分别为9.31μg/mL、 10.86μg/mL、11.05μg/mL。干酪乳杆菌LB20201发酵体系中，总黄酮含量在发酵过程中呈波动变化，在12h和36h时增加，是干酪乳杆菌LB20201发酵过程中，将大分子类黄酮物质分解为小分子黄酮类物质，小分子黄酮类物质被发酵体系的酶作用，进一步分解为黄酮类从次级代谢产物，所以导致总黄酮含量在发酵过程中呈波动变化。
由图5可知：荞麦发酵前总酚含量为1.18μg/mL，通过乳酸、马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2 单菌株发酵和混菌发酵后，总酚含量分别为：1.24μg/mL、1.21μg/mL、1.32μg/mL。荞麦发酵后，总酚含量提高，是总黄酮在微生物的作用下被分解代谢为一些酚类物质。谷物中微生物代谢可以产生多酚，使发酵过程中总酚含量增加。酚类物质在发酵液中，能被水解和氧化，导致功能微生物在发酵过程中，总酚含量呈波动变化。在发酵74h，混菌发酵体系中总酚含量高于单菌株发酵。这与丁玉峰等(参照丁玉峰等人于2021年在《食品科学》1-14中发表的文章)研究表明葡萄酵素在发酵过程中，微生物促进了酚类物质发释放，总酚含量呈波动变化结果基本一致。
(2)抗氧化能力的测定
(2.1)DPPH自由基清除能力
1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力测定参照梁鑫等(梁鑫等人于2021年在《食品与发酵工业》47(07):175-182中发表的文章)方法；
羟基自由基清除能力
羟基自由基清除能力参照梁鑫等方法(梁鑫等人于，2021年在《食品与发酵工业》47(07):175-182中发表的文章)；
(2.2)ABTS+自由基清除能力
ABTS+自由基清除能力参照Dulong等(Dulong etal.于2018年在《FoodChemistry》 262(5):21-29中发表的文章)方法；
抗氧化能力的测定结果如图2所示。
由图6可知：荞麦液体培养基中DPPH为44.18％，发酵74h后，DPPH自由基清除率显著提高，马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201、混菌发酵样品中DPPH自由基清除力分别为83.57％、85.27％、85.40％，其中干酪乳杆菌LB20201发酵和混菌发酵液中DPPH自由基清除率相近，高于马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2发酵。荞麦中蛋白质占 8.51％～18.87％(参照陈雅君于2017年在华南理工大学完成的硕士学位论文)，荞麦中多酚、多肽是发酵产物发挥抗氧化活性重要的物质基础，因此是马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2单菌株发酵时对荞麦中蛋白质代谢有所提高。
由图6可知：荞麦发酵后羟基自由基清除率(-OH)提高，荞麦发液体培养基中羟基自由基清除率为71.11％，发酵74h后分别为86.80％(马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2发酵)、83.11％ (干酪乳杆菌LB20201发酵)、85.42％(混菌发酵)；马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2发酵和混菌发酵的羟基自由基清除率明显高于干酪乳杆菌LB20201发酵。
由图6可知：发酵74h时，马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201、混菌发酵液中，ABTS+自由基清除率分别为90.46％、86.59％、94.09％；混菌发酵液中ABTS+自由基清除率高于马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2和干酪乳杆菌LB20201发酵。
综上：功能微生物发酵荞麦，可使荞麦抗氧化活性提高，其中混菌发酵对抗氧化活性的增加优于单菌株发酵。
(3)荞麦发酵过程中有机酸含量测定
参照王洪林(王洪琳等人于2020年在《中国酿造》39(06):196-203中发表的文章)的方法，建立草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸等有机酸峰面积与浓度关系的标准曲线，其回归曲线方程详见表2，测定结果见图8-图10所示。
表2：
序号 名称 回归方程 决定系数
1 草酸 y＝22273x+55.067 0.9978
2 酒石酸 y＝3000.4x+14.49 0.9979
3 苹果酸 y＝1404.9x+5.8238 0.9942
4 乳酸 y＝1093.3x+3.8524 0.9958
5 乙酸 y＝1093x+7.8 0.9980
6 琥珀酸 y＝1059.3x+3.0381 0.9985
由图8可知：荞麦在发酵开始时，乙酸含量显著增加，发酵开始时，菌株活力旺盛，干酪乳杆菌LB20201主要通过糖酵解途径产乙酸，其次柠檬酸盐循环中也可产少量乙酸；在荞麦酸汤中，干酪乳杆菌LB20201通过柠檬酸盐循环主要将琥珀酸代谢为酒石酸，因此发酵液中酒石酸在发酵0～24h时随发酵时间延长期含量增加，苹果酸和琥珀酸含量降低，24h时酒石酸、苹果酸、琥珀酸含量分别为0.17mg/mL、0.009mg/mL、0.006mg/mL。在24～60h时，苹果酸、琥珀酸、酒石酸含量趋于平稳。60h后酒石酸含量降低，可能是发酵后期干酪乳杆菌LB20201处于衰亡期，菌株代谢活力降低，缺乏琥珀酸水解酶，酒石酸在其他酶的作用下代谢为其他物质。乳酸含量在发酵74h时达13.25mg/mL。
由图9可知：马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2单菌株发酵过程中乳酸含量随发酵时间而降低(0～60h)，与马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2在发酵过程中代谢的醇类物质结合为酯类有关。乙酸在荞麦酸汤(马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2发酵)中变化趋势：在发酵开始时 (0～24h)，随发酵时间的延长乙酸含量增加，24～36h乙酸含量趋于稳定，在发酵48h时乙酸含量降低，后到发酵结束乙酸含量增加。发酵过程中，马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2大量代谢乙酸、乙醇等，乙酸与醇类物质结合为酯类，24～36h时马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2代谢的乙酸与发酵液中消耗的乙酸含量相近，因此该时间段发酵液中乙酸含量趋于稳定，后乙酸大量消耗，使乙酸含量降低。48h后乙酸含量增加，是马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2处于发酵后期，大量马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2细胞凋亡，使细胞内的营养物质以及酶类大量溶出，使乙酸含量增加，酒石酸、琥珀酸、苹果酸等含量降低。
由图10可知：混菌发酵过程中前60h乙酸变化趋势与干酪乳杆菌LB20201发酵过程中变化趋势基本一致，在60h后乙酸含量与马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2发酵相似，含量增加。乳酸含量明显低于干酪乳杆菌LB20201单菌发酵，是混菌发酵菌株间存在营养竞争，经混菌发酵液中各成分组成更加复杂，影响菌株的代谢，或者代谢物间相互反应生成其他化合物。混菌中(12～60h)酒石酸含量与苹果酸含量成相反趋势，发酵60～74h琥珀酸、酒石酸、苹果酸含量降低，是后发酵中大量风味物质的生成促使其含量降低。混菌发酵荞麦中的有机酸含量显著提高。
(4)GC-MS对挥发性风味化合物测定
功能微生物应用到荞麦培养基中发酵，对荞麦酸汤中挥发性风味化合物的影响，本实验通过HS-SPME-GC-MS测定了荞麦酸汤中的挥发性风味物质。荞麦酸汤中共检测到8类挥发性有机化合物，共65种，其中包括18种醇类、13种酯类、11种酸类、13种醛类、5种酮类、2种吡嗪类、1种呋喃类和2种其他化合物，功能微生物混菌和单菌株发酵体系中，不同种类挥发性物质的浓度随发酵时间的变化如图7所示；同时通过构建PLS模型对荞麦发酵过程中主要挥发性风味物质进行分析，具体分析结果见图12-图17。
样品处理方法
顶空固相微萃取(Head Space-Solid Phase Microextraction，HS-SPEM)：取8.0mL待测样品置于20mL顶空瓶中，并加入2.5g氯化钠、5μL内标(2-辛醇，浓度为26.76μg/L)，将老化后的50/30μmCAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于60℃吸附30min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250℃解吸3min，同时启动仪器采集数据。
GC-MS测定：采用色谱柱为SH-Rtx-Wax毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为高纯氦气(流速2mL·min-1)，采用电子轰击电离(EI)离子源，离子源温度230℃，电子能量70eV，扫描范围35～350amu。
程序升温条件：色谱柱初温40℃，保持3min，以4℃·min-1速率升温至150℃，保持2min，再以8℃·min-1速率升温至230℃，保持6min，不分流进样。
挥发性风味化合物鉴定
描述香气成分的鉴定通过：(1)与NIST17s，NIST17-1，NIST17-2.SmartDatabase中的标准质谱图进行比对；(2)与标准品的香气特征进行比对；(3)与标准品的保留指数(RI)进行比对，没有标准品的，与文献报道的RIL进行比对，其中RI的计算方法参照改进后的Kovats 方法计算(参照Cates V E etal，于1963年在《Journal of Chromatography》11(4):472-478中发表的文章)。
风味化合物定量分析
内标法定量：通过自动积分程序得到每个色谱峰的面积，计算内标物的峰面积和样品中各组分的峰面积比值，从而定量出各个风味成分的含量，每组样品测定六次取平均值。
计算公式：
Figure RE-GDA0003643144000000111
其中，Ci为待测组分i的质量浓度(μg/L)；WS为加入内标s的浓度(μg/L)；Ai和As分别为待测组分i和内标化合物s的峰面积；V为待测样品的体积(L)；f为待测组分i对内标s的相对质量校正因子(本实验中各待测组分i的相对校正因子均为1)。
由图11可知：检测到的65种挥发性化合物数量与姜莹(参照姜莹于2017年在贵州大学完成是硕士学位论文)研究的荞麦酒中结果一致，显著高于其他荞麦发酵食品中的挥发性风味化合物(参照张素云等人于2015年在《食品工业科技》36(08):222-234中发表的文章；Wang A etal.于2012年在《Flavour And Fragrance Journal》27(1):47-53发表的文章)。荞麦酸汤中总酯类浓度为342.93μg/L。由图12-图17可知，荞麦酸汤中，功能菌株混菌发酵体系的酯类、醇类、酸类、醛类化合物在含量均明显高于单菌株发酵，整体来看，这四类化合物是荞麦酸汤中检测到最丰富的挥发性有机化合物；由图12-图17可知：通过PCA可知，在荞麦酸汤中，功能微生物马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2和干酪乳杆菌LB20201单菌株发酵，以及混菌发酵的全部样本中，各组间均能很好的区分，表明各组间代谢物有较好的差异性。PLS模型表明功能微生物单菌株和混菌在荞麦发酵过程中，各样本均位于95％置信区间内，样本间区分非常显著。在荞麦酸汤中，功能微生物干酪乳杆菌LB20201、马克斯克鲁维酵母菌 YK2021-2、以及混菌发酵组的PLS模型置换检验R2X、R2Y、Q2分别为(0.952，0.990，0.977)、 (0.981，0.990，0.985)、(0.983，0.969，0.960)。说明PLS模型构建成功，具有很高的拟合度和预测能力，可以很好的解释在荞麦发培养基中，功能微生物发酵过程中的代谢差异；基于PLS模型分析结果，将VIP值大于1，p值小于0.05的代谢物作为荞麦发酵过程中的差异代谢物，结果共鉴定出11种差异代谢物，其中醇类3种，醛类4种，酸类2种，酯类2 种，结果详见图18。与荞麦培养基相比，功能微生物发酵，使荞麦酸汤中酯类、醇类、醛类风味物质含量显著增加，极大的提高了荞麦酸汤的风味。
(5)感官评定
为考察功能菌株应用到荞麦培养基中发酵，对荞麦酸汤感官品质的影响。本研究由15名感官评价人员组成，分别对荞麦酸汤中的色泽、内部形态、滋味和香气四个组分进行评定，采用百分制，具体的感官评价标准见表3，详细荞麦发酵过程中感官得分见图7。
表3荞麦酸汤感官评定指标
Figure RE-GDA0003643144000000121
由图7可知，功能菌株在荞麦培养基中，乳酸菌单菌株发酵感官评分最低，在发酵0～60h 时，随发酵时间的延长，感官评分升高，60～74h时，感官评分降低。因为乳酸菌单菌株发酵过程中，随发酵时间的延长，乳酸菌代谢产有机酸大量积累，发酵后期荞麦酸汤中酸甜比例失调，导致感官得分降低。酵母菌单菌株发酵后期，酒精发酵味较重，混菌发酵后期生成酯类化合物，使荞麦酸汤感官得分最高。
(6)荞麦中抗氧化成分分析
代谢物提取
将待测样本涡旋30s后，其后在4℃、12000rpm条件下离心15min；取上清1000μL于EP 管中，氮吹干燥；其后加入500μL50％甲醇复溶(含内标)；其后涡旋30s，其后冰水浴超声15min；其后在4℃、12000rpm条件下离心15min；取上清液，经0.22微孔滤膜过滤，用提取液稀释上清液5倍，其后涡旋30s，取至2mL进样瓶，每个样本各取60μL混合成QC样本；在-80℃条件下储存直到上机检测。
UHPLC-MS/MS分析
使用EXIONLCSystem(SCIEX)超高效液相色谱仪，通过WatersUPLC液相色谱柱(ACQUITYUPLCHSST31.8μm×2.1×100mm)对目标化合物进行色谱分离；液相色谱A相为含0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；用洗脱梯度进行如下分析：0～0.5min，98％A；0.5～10min，98％～50％A；10～13min，50％～5％A；13.1～15min，5％～98％A。流速为0.4mL·min-1，柱温箱温度为40℃，自动进样器温度为4℃，进样体积为2μL。
SciexQTrap6500质谱仪器参数：使用装备Ion Drive Turbo VESI离子源的SCIEX6500QTRAP+三重四极杆质谱仪，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析；离子源参数如下：离子喷雾电压:+5500/-4500V,帘幕气体:35psi,温度:400℃，气体1:60psi，气体2:60psi， DP:±100V。
(7)荞麦发酵前后多酚类成分分析
样品提取离子色谱图(extracted ion chromatograms，EICs)如图22-图24所示，可看出本发明所采用的分析方法使所有目标化合物均呈现出对称的色谱峰，很好地实现了各个目标化合物的色谱分离。
由图19可知，荞麦发酵前后样品之间出现明显区分，表明PCA可以清楚地区分荞麦发酵前后两组，且各组之间具有良好的可靠性。图20的正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal Partial least squares Discriminant Analysis，OPLS-DA)展示了荞麦样本组间和组内的的差异，从OPLS-DA得分图的结果可以看出，两组样本区分非常显著。荞麦的BCN组对BYM组 OPLS-DA模型的置换检验结果如图21所示，荞麦发酵前后样品的OPLS-DA模型中R2X、 R2Y、Q2的值分别为0.966、0.999、0.897，该值接近于1，说明该型具有良好的稳健性，模型拟合较好，不存在过拟合现象，OPLS-DA模型可以很好地解释荞麦发酵前后两组样本之间的差异。以VIP≥1.0和p<0.05为标准进行筛选，得到荞麦发酵前后两组样品中共有41种多酚类物质的差异代谢物，荞麦发酵前后主要多酚类物质差异代谢物见表4；
功能微生物混菌发酵促进了芹菜素、4-羟基苯甲醛、阿夫儿茶精等物质含量的增加，芹菜素主要通过肉桂酰辅酶A在酶的作用下生成4’,5,7-三羟基黄酮，然后再进一步被代谢为芹菜素，阿夫儿茶精主要通过亮氨酸分解代谢生成。功能微生物混菌发酵过程中使花青素、槲皮素、儿茶素、3,4,5,7-四羟基异黄酮含量降低，一方面可能是花青素在发酵过程中可被分解为槲皮素、儿茶素、表儿茶素等，而槲皮素、儿茶素、表儿茶素等物质在荞麦酸汤中，可能被进一步分解代谢，导致在功能微生物发酵后含量降低；另一方面是发酵过程中，功能菌株的呼吸作用使发酵体系中温度升高，酚类化合物性质不是很稳定，当环境温度升高时，酚类化合物极易分解。此外，荞麦酸汤的抗氧化活性也主要与多酚黄酮类物质密切相关，TingtingSong 等(Song etal.人于2020年在《Journal Of Food Science AndTechnology-Mysore》31(2):44-53中发表的文章)研究表明，谷物发酵可以产生更多的生物活性化合物和抗氧化剂，Bajalan等人 (Bajalan etal.人于2016年在《Industrial CropsAnd Products》87(3):255-260中发表的文章)证明，不同的酚醛含量是决定黄酮提取物抗氧化能力的主要因素，研究发现总酚醛化合物和抗氧化活性之间存在线性关系(参照Corral-Aguayo etal.于2008年在《Journal Of Agricultural And Food Chemistry》56(22):10498-10504中发表的文章；Gunaratne etal.人于2013年在《Food Chemistry》138(3):1153-1161中发表的文章)。赵晓娟等(参照赵晓娟等，人于2014年在《食品科学》35(13):122-126中发表的文章)研究发现苦荞纳豆酱中总黄酮、总酚与抗氧化活性有显著相关性。
表4：荞麦发酵前后主要多酚类物质差异代谢物表
Figure RE-GDA0003643144000000141
Figure RE-GDA0003643144000000151
Figure RE-GDA0003643144000000161
数据处理
所有质谱数据采集及目标化合物定量分析工作，均通过SCIEX Analyst WorkStation Software(Version1.6.3)来完成。使用MSconventer软件将质谱原始转成TXT格式。再使用R 程序包结合自建数据库完成提峰、注释等工作。使用SIMCA-P14.1软件对数据进行中心化 (CTR)格式化处理，然后进行自动建模分析。通过 MetaboAnalyst4.0(https://www.metaboanalyst.ca)进行代谢通路的构建。用Excel2020软件试验数据进行制图，多重比较(Duncan氏新复极差检测)相关统计利用SPSS17.0(注：所有附图中的BCN表示空白实验，未接菌的荞麦米粉培养基；BY表示接种马克斯克鲁维酵母YK2021- 2，BL表示接种干酪乳杆菌LB20201，BY:L表示二者混菌发酵，其后缀数字12、36、60表发酵时间h)。
表5：主要实验试剂
Figure RE-GDA0003643144000000171
Figure RE-GDA0003643144000000181
表6：主要实验仪器
仪器 公司
MJ-160B-II恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂
BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
XL-06A小型粉碎机 上海致凯粉体机械制造有限公司
ZQPL-200恒温摇床 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司
PHS-3CpH计 上海虹谊仪器仪表有限公司等
pectraMaxiD3多功能酶标仪 美谷分子仪器(上海)有限公司
ECLIPSE-E200显微镜 Nikon公司
1260高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司
ExionLCAD超高效液相 Sciex公司
QTrap6500+高灵敏度质谱 Sciex公司
HeraeusFresco17离心机 赛默飞世尔科技公司
TQ8040气相色谱-质谱联用仪 岛津企业管理(中国)有限公司
综上，功能微生物应用到荞麦中，使荞麦酸汤口感酸爽，风味浓郁，有机酸和挥发性风味化合物含量明显增加，混菌发酵结果优于单菌株发酵；功能微生物发酵荞麦，使荞麦的抗氧化活性增加，功能性成分含量提高，为功能微生物的应用和荞麦发酵食品的开发提供了一定的理论根据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 贵州大学
<120> 一种功能微生物及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 696
<212> DNA
<213> 马克斯克鲁维酵母菌（YK2021-2）(Kluyveromyces marxianus)
<400> 2
gcgtgctcga gtatgatgat agattgctgg gggatcgtct gaacaaggcc tgcgcttaat 60
tgcgcggcca gttcttgatt ctctgctatc agttttctat ttctcatcct aaacacaatg 120
gagttttttc tctatgaact acttccctgg agagctcgtc tctccagtgg acataaacac 180
aaacaatatt ttgtattatg aaaaactatt atactataaa atttaatatt caaaactttc 240
aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaattgcg atatgtattg 300
tgaattgcag attttcgtga atcatcaaat ctttgaacgc acattgcgcc ctctggtatt 360
ccagggggca tgcctgtttg agcgtcattt ctctctcaaa cctttgggtt tggtagtgag 420
tgatactcgt ctcgggttaa cttgaaagtg gctagccgtt gccatctgcg tgagcagggc 480
tgcgtgtcaa gtctatggac tcgactcttg cacatctacg tcttaggttt gcgccaattc 540
gtggtaagct tgggtcaaag agactcatag gtgttataaa gactcgctgg tgtttgtctc 600
cttgaggcat acggctttaa ccaaaactct caaagtttga cctcaaatca ggtaggagta 660
cccgctgaac ttaagcatat caataagccg gaggaa 696
<210> 2
<211> 1033
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌（LB20201）(Lactobacillus casei)
<400> 2
aaccatgatc taggctgttt ttttcatctt gtcacttaac ggctcctcct aaagggttac 60
gccaccggct tcgggtgtta caaactctca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg 120
ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg cgattactag cgattccgac ttcgtgtagg 180
cgagttgcag cctacagtcc gaactgagaa tggctttaag agattagctt gacctcgcgg 240
tctcgcaact cgttgtacca tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat 300
gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctt actagagtgc 360
ccaactaaat gctggcaact agtcataagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 420
tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc attttgcccc cgaaggggaa 480
acctgatctc tcaggtgatc aaaagatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc 540
gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcaac 600
cttgcggtcg tactccccag gcggaatgct taatgcgtta gctgcggcac tgaagggcgg 660
aaaccctcca acacctagca ttcatcgttt acggcatgga ctaccagggt atctaatcct 720
gttcgctacc catgctttcg agcctcagcg tcagttacag accagacagc cgccttcgcc 780
actggtggtc ttccatatat ctacgcattt caccgctaca catggagttc cactgtcctc 840
ttctgcactc aagtttccca gtttccgatg cgcttcctcg gttaagccga gggctttccc 900
atcagactta aaaaaccgcc tgcgctcgct ttacgcccaa taaatccgga taacgcttgc 960
cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg aagtaacccg ggctttctgg ttggataccg 1020
tcacgccgac aaa 1033

Claims (7)

1.一种功能微生物，其特征在于：包括马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2、干酪乳杆菌LB20201；所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2(Kluyveromyces marxianus)已于2021年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：6173 7；所述干酪乳杆菌LB20201(Lactobacillus casei)已于2020年6月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No∶61034。
2.根据权利要求1所述的一种功能微生物，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2和所述干酪乳杆菌LB20201的体积比为1:5。
3.根据权利要求1所述的一种功能微生物，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的筛选方法，包括以下步骤：
对传统发酵白酸汤进行高通量测序，以确定优势微生物；
其后根据测序结果，配制YPD培养基对优势菌株进行分离筛选，得到筛选分离后的优势菌株；
其后将筛选出的优势菌株进行纯化，并在YPD培养基上培养，得到纯化的各优势菌株的单个菌株菌落；
其后在单个菌株菌落中提取样本进行测序，并进行同源性比对，同时进行菌株系统发育树构建；
其后在确定所属的菌株以及系统发育树的前提下，将单菌菌悬液分别接种于糯米米汤中进行发酵，得到白酸汤发酵液；
对得到的白酸汤发酵液进行总酸和pH值的测定，并结合感官评定对菌株发酵性能进行分析，以筛选出传统发酵白酸汤中发酵性能较好的马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2。
4.一种功能微生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的活化：取冻存于-80℃的马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2，其后接种于YPD琼脂培养基中，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2的体积为100μL，其后在30℃下活化48h；其后挑取活化后的一个单菌落接种于YPD液体培养基中，其后在30℃下摇瓶活化18h备用；
干酪乳杆菌LB20201的活化：取冻存于-80℃干酪乳杆菌LB20201，其后接种于MRS琼脂培养基中，干酪乳杆菌LB20201的体积为100μL，其后在37℃活化12h；其后挑取活化后的单菌落接种于MRS肉汤培养基中，其后在37℃下摇瓶活化12h；
按体积比为1:5的比例分别取马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2与干酪乳杆菌LB20201混合形成功能微生物，所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2与干酪乳杆菌LB20201均经过两次活化。
5.根据权利要求4所述的一种功能微生物的制备方法，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母菌YK2021-2与干酪乳杆菌LB20201的初始菌液浓度均为1×108CFU/mL。
6.一种功能微生物的应用，其特征在于：所述功能微生物用于提升发酵过程中荞麦酸汤的功能性成分。
7.根据权利要求6所述的一种功能微生物的制备方法，其特征在于：荞麦酸汤的制备方法，包括以下步骤：
S1：样品制备
S11、荞麦粉的制备：称取干燥的荞麦种子粉碎，其后过80目筛备用；
S12、荞麦培养基的制备：称取步骤S11得到的荞麦粉溶于水中配制成溶液，所述荞麦粉的质量数值为水的体积数值的3％，其后添加70U/g的α-淀粉酶，在70℃下液化10min；其后添加560U/g的糖化酶，在60℃下保温120min；其后取75mL保温后的溶液装于容器中作为样品，在0.1Mpa、115℃条件下进行高压蒸汽灭菌15min；其后取出放置至室温；
S2：发酵
将权利要求4所述的功能微生物接种于步骤S12得到的荞麦粉液体培养基中，所述功能微生物的体积为所述荞麦粉液体培养基体积的4％，其后在33℃下恒温发酵74h。
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