CN109288014B - 一种白果冠突散囊菌液态发酵的方法及其制备的产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白果冠突散囊菌液态发酵的方法及其制备的产品和应用，该方法包括：将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液；将白果制成白果果仁，加水磨浆，加入无机盐，制备液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种冠突散囊菌孢子悬液，震荡培养后得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。本发明以白果作为冠突散囊菌液态发酵培养基，经过发酵后，保留了白果大部分营养成分和功能成分，降低了银杏酚酸和MPN的含量。此外，发酵后含有大量的冠突散囊菌孢子，洛伐他汀、多糖、α‑淀粉酶、蛋白酶等众多功能保健成分，而且风味明显改善。其白果发酵产品可用于制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的酵素、饮品等白果产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种白果冠突散囊菌液态发酵的方法及其制备的产品和应用。
背景技术
银杏在中国、日本、朝鲜、韩国、加拿大、新西兰、澳大利亚、美国、法国、俄罗斯等国家和地区均有大量分布。中国的银杏资源主要分布在山东、浙江、安徽、福建、江西、河北、河南、湖北、江苏，湖南、四川、贵州、广西、广东等省的60多个县市。
白果为银杏树的成熟果实。白果除含有淀粉、蛋白质、脂肪、糖类之外，同时含有一定量的维生素、核黄素、胡萝卜素、黄酮类、萜内酯类、生物碱、多糖类、氨基酸、银杏酚酸、银杏果酚、脂固醇以及钙、磷、铁、钾、镁等微量元素成分。古籍记载白果具有益肺气、治咳喘、止带浊、缩小便、平皴皱、护血管、增加血流量等食疗作用和医用效果。现代医学研究表明，白果还具有通畅血管、改善大脑功能、延缓老年人大脑衰老、增强记忆能力、治疗老年痴呆症和脑供血不足等功效。
由于白果具有丰富的营养保健功能，1992年我国卫生部将白果列为“药食两用”资源，，可应用于食品行业。但是当前白果深加工产品、高附加值产品少。市场上销售的主要是白果干果、白果开心果、白果粉、白果复合粉、白果罐头、白果奶茶、白果汁饮料等初(粗)加工产品，群众接受度低，销售难度大。白果淀粉、白果蛋白、白果油脂、白果多糖等深加工产品还多停留在实验室阶段。白果发酵产品也仅有酿酒酵母发酵白果果酒、乳酸菌发酵白果汁饮料的报道，发酵菌种少，且也都处于实验室研究阶段。此外，白果中含有银杏酚酸、MPN等致敏致毒成分，一定程度上给白果食品的安全性蒙上阴影。上述这些因素严重制约了白果产业的发展，造成白果滞销，影响到果农的积极性和经济收入，使这一药食俱佳的食品原料潜力未能很好地发挥。
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是一种有益真菌，属于散囊菌目发菌科散囊属，在茯砖茶的生产过程中是产生“金花”的优势菌，因此俗称为“金花”菌。同时冠突散囊菌也是形成茯砖茶独特品质的主要因素。由于冠突散囊菌的作用，使得茯砖茶的色、香、味不同于其他茶类，发酵后具有多种新增物质，赋予茯砖茶多种功效，如抗氧化、促消化、降脂减肥、抑菌、抗癌等。2016年12月7日，国家卫计委新食品原料受理系统接受了冠突散囊菌(CGMCC NO.8730)新食品原料申请。
冠突散囊菌在生长繁殖的过程中，通过对营养物质的分解利用，将大分子物质分解为小分子物质的同时自身也产生多种分泌物，如色素类、酶类、胆固醇类、多糖、生物碱、洛伐他汀等物质。这些物质具有抑菌、抗过敏、抗氧化、抗辐射、抗紫外、降血脂和抑制肿瘤等重要的生物活性，在食品、医药、农业等领域有着广泛的应用前景。
发明内容
发明目的：针对白果加工业的现状及现有白果发酵产品发酵菌种少的问题，本发明提供一种白果冠突散囊菌液态发酵的方法，该方法将白果磨浆后作为冠突散囊菌液态发酵的出发培养基，经过发酵后，保留了白果大部分营养成分和功能成分，降低了银杏酚酸和MPN(4-甲氧基吡哆醇)的含量，提高了产品的安全性。由于冠突散囊菌的生长和代谢作用，发酵后所得到的液态发酵产品中含有大量的冠突散囊菌孢子，洛伐他汀、多糖、α-淀粉酶、蛋白酶等众多功能保健成分，同时产生香气成分使得发酵产品的感官性状得到了提升。
本发明的另一个目的是提供了上述方法制备的白果冠突散囊菌液态发酵产品及其应用，白果冠突散囊菌液态发酵产品可用于制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的酵素、饮品或其它具有保健功能的食品，丰富白果的产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种白果冠突散囊菌液态发酵的方法，包括如下步骤：
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液；
(2)将白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，加水磨浆，再在白果果仁浆中加入适量的无机盐，制备液体发酵培养基，灭菌后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的液体发酵培养基中接种步骤(1)制备的冠突散囊菌孢子悬液，在一定条件下震荡培养后得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。
其中，步骤(1)所述的活化分离为将在冰箱中保存的冠突散囊菌菌种取出，在PDA平面培养基上划线培养，挑取单菌落，再在PDA平面培养基上进一步划线培养，如此重复2～3次。
其中，步骤(1)所述的制备孢子悬液为将在PDA平面培养基上生长的冠突散囊菌孢子刮下，移入含有玻璃珠的无菌水中，振荡打散孢子团，进行孢子计数，并调节孢子悬液浓度。
作为优选，步骤(2)所述液体培养基中白果的浓度为3-9g(干重)/100mL。
作为优选，步骤(2)所述液体培养基中为无机盐为氯化钙、硫酸镁、硫酸锌和硫酸亚铁，氯化钙的浓度为1-9mg/mL，硫酸镁的浓度为1-9mg/mL，硫酸锌的浓度为1-3mg/mL，硫酸亚铁的浓度为0.5-1.5mg/mL。
最优选，液体培养基中白果的浓度为8g(干重)/100mL，氯化钙的浓度为5mg/mL，硫酸镁的浓度为4mg/mL，硫酸锌的浓度为1.25mg/mL，硫酸亚铁的浓度为0.63mg/mL，在所述条件下，培养所得的冠突散囊菌孢子数能够达到最大值。
作为优选，步骤(2)所述液体培养基初始pH为4-6。通常培养基配制好后的pH在5.8±0.1，因此选择初始pH为自然pH即可。
作为优选，步骤(3)所述接种的接种量为每100mL接种1-5mL孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL。最优选，接种1.7×108cfu/mL孢子悬液3mL。
作为优选，步骤(3)所述的振荡培养为每250毫升摇瓶装液量为50-150mL，于25-32℃、80-180rpm振荡培养2-6天。最优选，摇瓶(250mL)装液量100mL，160rpm，28℃培养3天。
本发明所述的白果冠突散囊菌液态发酵的方法所制备的白果冠突散囊菌液态发酵产品。
本发明所述的白果冠突散囊菌液态发酵产品在制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的酵素、饮品或其它具有保健功能的食品中的应用。
本发明白果冠突散囊菌液态发酵的方法，研究了白果浓度、无机盐种类及浓度等培养基成分，结果为8g/100mL(干重)的白果、5mg/mL的氯化钙、4mg/mL的硫酸镁、1.25mg/mL的硫酸锌和0.63mg/mL硫酸亚铁为最佳培养基成分。其次，优化初始pH、接种量、装液量和发酵时间等培养条件，结果为初始发酵pH为自然pH(5.8±0.1)、接种量为3mL(1.7×108cfu/mL)、250mL摇瓶装液量为100mL，28℃培养3天。
本发明利用冠突散囊菌作为发酵菌种，液态发酵白果制备白果真菌发酵产品。一方面，利用冠突散囊菌菌体内强大的酶系统，在发酵过程中有效地降解银杏酚酸、MPN，实现低银杏酚酸、MPN白果产品制备。另一方面，冠突散囊菌发酵过程中分泌很多功能性次级代谢产物，如色素类、酶类、胆固醇类、多糖、生物碱、洛伐他汀等物质，因此，通过冠突散囊菌发酵可制备功能更加强大的白果产品，有望深化白果深加工产业链，增加白果附加值，丰富白果深加工产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明白果冠突散囊菌液态发酵的方法，在冠突散囊菌液态发酵过程中，将白果中的大分子营养物质如蛋白质、淀粉等分解为更容易被消化吸收的小分子物质如多肽、氨基酸、寡糖、单糖等，同时产生香气成分使得发酵液的感官性状得到了提升，发酵液有淡淡清香。
(2)本发明白果冠突散囊菌液态发酵的方法，白果中的功能性成分银杏黄酮和银杏萜内酯得到较好的保存，但是通过液态发酵，银杏酚酸和MPN得到有效的降解，白果的安全性得到提升。
(3)本发明白果冠突散囊菌液态发酵的方法，发酵液中冠突散囊菌孢子数提高了2倍，含有多糖、洛伐他丁和丰富的游离氨基酸，同时含有α-淀粉酶和蛋白酶两种消化酶，发酵液具有抗氧化能力和降血脂功能。
(4)通过该方法制得的白果冠突散囊菌液态发酵产品可用于制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的酵素、饮品或其它具有保健功能的食品，丰富白果的产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
附图说明
图1为白果浓度对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图2为不同无机盐对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图3为硫酸亚铁浓度对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图4为硫酸锌浓度对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图5为氯化钙浓度对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图6为硫酸镁浓度对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图7为最优培养基和培养条件对冠突散囊菌孢子数的影响验证关系图；
图8为初始pH值对冠突散囊菌孢子数的影响影响关系图；
图9为接种量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图10为装液量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图11为发酵时间对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图12为采用本发明实施例1发酵过程冠突散囊菌孢子数变化示意图；
图13为发酵过程中pH值的变化示意图；
图14为发酵过程中多糖含量的变化示意图；
图15为发酵过程中洛伐他汀含量的变化示意图；
图16为发酵过程中总抗氧化能力的变化示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
主要试剂与药品：
白果(大佛指)购于江苏泰兴，冠突散囊菌(Eurotium cristatum CICC 2650)为南京林业大学轻工与食品学院发酵工程实验室保藏(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，也可以采用常规的其它冠突散囊菌。主要试剂与药品均由市售可得。
本发明各实施例中冠突散囊菌的活化分离和孢子悬液的制备：活化分离：将在4℃冰箱中保存的菌种取出，在无菌操作台上，划线接种于PDA平面培养基上，28℃，相对湿度85％，恒温恒湿培养。培养3天后，用接种针挑取单菌落，再在PDA平面培养基上进一步划线培养，如此重复2～3次。
孢子悬液的制备：将在PDA平面培养基上生长的冠突散囊菌孢子用接种针刮下，移入含有玻璃珠的无菌水中，在28℃、200rpm振荡60min打散孢子团，用血球计数板进行孢子计数，调节浓度，使得孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL(实施例中均以此浓度孢子悬液接种)。
发酵液中孢子数的测定：在超净台中，用移液枪吸取1mL发酵液于100mL的锥形瓶中，补加9mL无菌水，在锥形瓶中加入几粒玻璃珠，放于28℃，200rpm的摇床中振荡60min，取出，再稀释50倍后，于显微镜下用血球计数板进行孢子计数。
实施例1
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL；
(2)将白果去骨质中种皮、内种皮后得白果果仁，加水磨浆，调节白果浆浓度为8g(干重)/100mL，取100mL白果浆置于250mL的锥形瓶中，并加入0.5g氯化钙、0.4g硫酸镁、0.125g硫酸锌和0.063g硫酸亚铁作为液体培养基，115℃灭菌20min后备用，pH自然，不调节；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的液体培养基中接种步骤(1)的冠突散囊菌孢子悬液3mL，接种后在160rpm，28℃发酵3天，每天取样测定孢子数，得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。
实施例2
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL；
(2)将白果去骨质中种皮、内种皮后得白果果仁，加水磨浆，调节白果浆浓度为5g(干重)/100mL，取150mL白果浆置于250mL的锥形瓶中，并加入0.75g氯化钙、0.6g硫酸镁、0.195g硫酸锌和0.0945g硫酸亚铁作为液体培养基，115℃灭菌20min后备用，pH自然，不调节；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的液体培养基中接种步骤(1)的冠突散囊菌孢子悬液5mL，接种后在160rpm，28℃发酵3天，每天取样测定孢子数，得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。
实施例3
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL；
(2)将白果去骨质中种皮、内种皮后得白果果仁，加水磨浆，调节白果浆浓度为3g(干重)/100mL，取50mL白果浆置于250mL的锥形瓶中，并加入0.15g氯化钙、0.15g硫酸镁、0.05g硫酸锌和0.025g硫酸亚铁作为液体培养基，调节pH为4.0，115℃灭菌20min后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的液体培养基中接种步骤(1)的冠突散囊菌孢子悬液0.5mL，在160rpm，28℃发酵2天，每天取样测定孢子数，得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。
实施例4
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL；
(2)将白果去骨质中种皮、内种皮后得白果果仁，加水磨浆，调节白果浆浓度为9g(干重)/100mL，取50mL白果浆置于250mL的锥形瓶中，并加入0.35g氯化钙、0.35g硫酸镁、0.1g硫酸锌和0.1g硫酸亚铁作为液体培养基，调节pH为6.0，115℃灭菌20min后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的液体培养基中接种步骤(1)的冠突散囊菌孢子悬液2.5mL，接种后在160rpm，28℃发酵5天，每天取样测定孢子数，得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。
实施例5
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL；
(2)将白果去骨质中种皮、内种皮后得白果果仁，加水磨浆，调节白果浆浓度为3g(干重)/100mL，取150mL白果浆置于250mL的锥形瓶中，并加入0.1g氯化钙、0.1g硫酸镁、0.1g硫酸锌和0.05g硫酸亚铁作为液体培养基，调节pH为4.0，115℃灭菌20min后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的液体培养基中接种步骤(1)的冠突散囊菌孢子悬液1mL，接种后在180rpm，32℃发酵6天，每天取样测定孢子数，得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。
实施例6
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108cfu/mL；
(2)将白果去骨质中种皮、内种皮后得白果果仁，加水磨浆，调节白果浆浓度为9g(干重)/100mL，取150mL白果浆置于250mL的锥形瓶中，并加入0.9g氯化钙、0.9g硫酸镁、0.3g硫酸锌和0.15g硫酸亚铁作为液体培养基，调节pH为4.0，115℃灭菌20min后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的液体培养基中接种步骤(1)的冠突散囊菌孢子悬液5mL，接种后在80rpm，25℃发酵2天，每天取样测定孢子数，得到白果冠突散囊菌液态发酵产品。
试验例1
白果浓度对冠突散囊菌液态发酵孢子数的影响。
采用实施例1的方法，不加无机盐，调节白果浆浓度为3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g(干重)/100mL，250mL的锥形瓶中装100mL不同浓度的白果浆，每组3个平行。pH自然，不调节。115℃灭菌20min，冷却后在超净工作台中接种孢子悬液2mL，160rpm，28℃条件下培养，每天取样测定孢子数。选取孢子数最大的白果浆浓度进行下步实验优化。
微生物在生长过程中必须从外界环境中摄取对其生命活动必需的能量和营养物质。白果的主要营养物质是淀粉、蛋白质和脂肪，同时还含有多种微量元素。可满足微生物生长的基本所需。但在一定的生长条件下，微生物需要的营养物质应在适当的浓度范围内。本试验例1对孢子数的影响，结果如图1所示。
如图1所示为白果浓度优化发酵进程曲线，当白果浓度为3g/100mL时，在6天的发酵过程中，孢子数一直在增加。当白果浓度为4g/100mL时，在第5天孢子数达到最大。当白果浓度为6～9g/100mL时，孢子数都在第4天达到最大，其中8g/100mL的孢子数最大，并从9g/100mL时最大孢子数出现下降。同时，各组的孢子数从第5天开始下降。出现此类现象的原因是，当培养基中的白果在低浓度范围时，营养物质浓度过低，因此菌体生长缓慢。随着白果浓度的增加，在相同的发酵时间内，孢子数也随之在增加，并且达到最大孢子数所用的时间也在缩短。当白果浓度过高时，使得培养基的渗透压过高，菌体可利用的自由水含量减少，使菌体的代谢强度下降，生长变缓。随着发酵的进行，培养基中的营养物质逐渐被消耗，菌体的代谢物又使得生长环境恶化，菌体和孢子开始衰亡，孢子数从而不断下降。在本实验中，当白果浓度为8g/100mL时，孢子数可以达到最大，因此选择8g/100mL浓度作为最佳白果浓度。
试验例2
白果酶解对冠突散囊菌液态发酵孢子数的影响。
采用试验例1的方法，调节白果浆浓度为8g(干重)/100mL，pH自然，不调节。选取α-淀粉酶、糖化酶、木瓜蛋白酶做3因素5水平的响应面实验如表1-3所示。将三种酶按照表1实验设计所需要的量加到白果浆中在30℃酶解2小时。酶解结束后取100mL酶解白果浆置于250mL锥形瓶中，每组3个平行，115℃灭菌20min，冷却后在超净工作台中接种孢子悬液3mL，160rpm，28℃条件下培养，每天取样测定孢子数。
表1.响应面试验因素水平
表2.响应面预测结果
表3.响应面实验结果
由表3可得，虚拟误差显著，模型不显著，说明添加的三种酶酶解白果对冠突散囊菌的生长没有影响。可能的原因是在发酵前白果经过高温灭菌，其中的大分子物质如淀粉和蛋白已经部分水解。接种后，菌体自身产生的各种消化酶已经能够满足使用，不需要额外添加其他消化酶对白果进行水解。
试验例3
无机盐种类及浓度对对白果冠突散囊菌液态发酵孢子数的影响。
无机盐对于微生物的生长具有十分重要的营养功能，可以作为细胞内一般分子成分和生理调节物质。Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、K+、Zn2+等离子对冠突散囊菌的生长都有影响。因此，本试验例综合考虑了实验的目的和食品中允许添加的食品添加剂的种类，选择了氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锌6种无机盐考察其对冠突散囊菌生长的影响。
采用实施例1的方法，调节白果浆浓度为8g(干重)/100mL，pH自然，不调节。分别向白果浆中添加氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠，使其终浓度为0.5(g/mL，％)；添加硫酸亚铁使其终浓度为0.1(g/mL，％)；添加硫酸锌使其终浓度为0.2(g/mL，％)，形成不同的试验组。对照组不加任何无机盐。取100mL液体培养基装入250mL摇瓶中，每组3个平行，115℃灭菌20min，冷却后在超净工作台中接种孢子悬液3mL，160rpm，28℃条件下培养。实验结果如图2所示。
如图2，各实验组的孢子数变化趋势类似，在第3天之前逐步上升，从第4天开始下降。其中，氯化钠和磷酸二氢钾两实验组与对照组相比，最大孢子数没有显著差别。其余实验组与对照组相比，最大孢子数都有显著提高。为进一步寻求无机盐的最适浓度，分别对硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钙、硫酸镁的浓度进行优化。
按相同的方法向白果浆中添加硫酸亚铁使其终浓度(g/mL，％)为0.05、0.075、0.1、0.125和0.15，添加硫酸锌使其终浓度(g/mL，％)为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3，添加氯化钙使其终浓度(g/mL，％)为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9，添加硫酸镁使其终浓度(g/mL，％)为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9。对照组为不加任何无机盐。首先对硫酸亚铁浓度进行了优化。铁元素对于几乎是所有活细胞必不可少的元素，是微生物体内过氧化氢酶、过氧化物酶、铁硫蛋白、细胞色素、细胞色素氧化酶等的重要组成成分。同时，铁作为电子载体在细胞内氧化还原反应电子传递链中起着极为重要的作用。当铁元素的含量不足时，将影响酶的合成，从而使有机物释放的电子不能顺利地传递给最终电子受体，进而影响微生物的生长代谢过程。
实验结果如图3所示。在所有浓度硫酸亚铁实验组中，孢子数在前3天都具有上升的趋势。除对照组，其他实验组在第3、4天时孢子数保持稳定。在第4天之后，所有实验组的孢子数开始降低。其中，当硫酸亚铁的浓度在0.05％时，孢子数与对照组的数量相比没有显著区别。当浓度在0.075％时，孢子数显著上升且为所有实验组中的最大孢子数。随着硫酸亚铁浓度的增加，最大孢子数逐渐下降，当硫酸亚铁的浓度达到0.15％时，与对照组相比没有显著差别。随着硫酸亚铁浓度的增加，孢子数的变化趋势类似于钟罩形的形式。实验结果说明，硫酸亚铁在0.05～0.075％较低浓度范围时对孢子数的增加具有促进作用，当浓度超过0.075％时对孢子数的增长出现抑制作用。随着硫酸亚铁浓度的增加，抑制作用趋于平缓。本实验结果表面，当铁离子浓度在低浓度范围时对微生物冠突散囊菌的生长具有明显的促进作用。
其次优化硫酸锌浓度。锌元素在微生物的生命代谢活动中起着重要的调节作用。锌离子可作为蛋白质的组成成分，鳌合在氨基酸链中形成锌指结构。同时，还可以作为催化辅助因子，影响多种酶的催化活性，如RNA/DNA聚合酶、碱性磷酸酶、乙醇脱氢酶、异构酶、氨基肽酶等，涉及糖类、脂类和蛋白质的合成与降解。然而，高浓度的锌离子会对菌体产生严重的毒害作用。与其他金属离子竞争蛋白的结合位点，从而使蛋白失活。还可形成羟基自由基，破坏蛋白、脂类和DNA的结构。不同的菌种对锌离子的需求量和耐受力不同，进而出现不同的反应现象，浓度过高时可能会出现抑制现象。
实验结果如图4，在前3天各个实验组的孢子数都在迅速上升。相对于对照组，其他实验组在第3天和第4天孢子数维持在一个较为稳定的状态。第4天之后，孢子数开始快速下降。其中，当硫酸锌的浓度在0.1～0.15％的范围内时，随着浓度的上升最大孢子数也在上升。当硫酸锌的浓度在0.15～0.3％范围时，随着浓度的上升最大孢子数在逐渐下降。当硫酸锌的浓度分别为0.1％和0.3％时，最大孢子数近似相等。由此可知，对于本实验而言，硫酸锌的浓度在一定范围内可以促进菌体的生长，当浓度大于0.1％时，会抑制菌体的生长。
第三，氯化钙浓度优化：钙离子是细胞内广泛存在的信号物质，几乎参与调控机体内所有的生物学功能，包括细胞增殖和凋亡、细胞分裂和分化、能量代谢、蛋白质磷酸化和去磷酸化修饰、基因表达和调控等。然而，当细胞内的钙离子浓度过高时，生理生化反应过程将会发生改变，进而使蛋白质的表达出现异常并发生一系列代谢紊乱，使细胞的活性降低，甚至引起细胞坏死和凋亡。
实验结果如图5，可以看出，前3天各实验组的孢子数都在快速上升，实验组0.7％和0.9％的最大孢子数在第4天达到最大值，其余组在第3天达到最大孢子数。其中，当氯化钙的浓度在0.1～0.5％时，随着浓度的增加，最大孢子数也在增加。当氯化钙的浓度在0.5～0.9％时，随着浓度的增加，最大孢子数在逐渐减小。当氯化钙的浓度分别为0.1％和0.9％时以及0.3％和0.7％时，最大孢子数近似相等，没有差别。但高浓度的氯化钙在第4天才能达到最大孢子数。上述结果说明，对于本实验而言，低浓度的氯化钙可以促进菌体的生长，高浓度的氯化钙会抑制菌体的生长。
第四，硫酸镁浓度优化。镁离子是生物体内含量较多的一种金属元素，具有许多重要的生理功能。镁离子是许多酶的激活剂，同时在能量转移过程中起辅助作用；镁离子还能提高一些抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力。实验结果如图6。
在前3天各实验组的孢子数都在上升，趋势相同，且都在第3天达到最大孢子数。从第4天起，各实验组的孢子数开始下降。整体呈现出先上升后下降的变化趋势。其中，当硫酸镁的浓度在0.1～0.5％时，随着浓度的增加，孢子数也在增加；当硫酸镁的浓度在0.5～0.9％，随着浓度的增加，孢子数在逐渐下降。当硫酸镁的浓度为0.9％时，孢子数与对照组相同。上述的结果表明，对于本实验而言，低浓度的硫酸镁能够促进菌体的生长；高浓度的硫酸镁会抑制菌体的生长活动。同时也说明镁离子的存在影响了菌体的新陈代谢水平。
上述单因素实验结果表明硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钙、硫酸镁对冠突散囊菌生长代谢有影响，并确定了各自的较适宜浓度范围。但是不同的无机盐添加在同一培养基中时，可能会有交互作用。为此，因此，基于单因素实验结果设计了四因素三水平的正交试验，实验结果如表4-5。正交试验结果显示，影响孢子数的主次因素依次分别为硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钙、硫酸镁，最佳浓度依次为0.063％、0.125％、0.5％、0.4％。
表4.因素水平表
表5.正交试验结果
为此，对正交实验确定的最优条件的优化组进行验证，结果如图7所示。
其中，优化组的最大孢子数比实验组D1C1A1B1的最大孢子数略高，但没有显著差别。又因为优化组中氯化钙的浓度为0.5％，而实验组中氯化钙的浓度为0.4％，故选择实验组D1C1A1B1为最终的优方案，即硫酸亚铁、氯化钙、硫酸锌、硫酸镁的浓度分别为0.063％、0.4％、0.125％、0.4％。
试验例4
初始pH值对白果冠突散囊菌液态发酵孢子数的影响。
采用实施例1的方法，不同之处在于：将初始pH调为4、4.5、5、5.5、6，每组重复3次，封口，115℃高压灭菌20min，取出冷却至室温，在超净台中用移液枪在每个锥形瓶接种3mL(1.7×108cfu/mL)孢子悬液，160rpm，28℃条件下连续培养6天，每天取样测定孢子数。
不同种类的微生物在其生长过程中所需的最适生长pH不尽相同，即使是同一种微生物在不同的生长阶段和不同的生理、生化过程中，所需的最适pH也不相同。pH对细胞活性既有直接影响，也有间接影响。如可影响培养基中营养物质的离子化程度，从而使微生物对营养物质的吸收受到影响，影响环境中有害物质的生成，从而影响代谢反应中各种酶的活性。本实验分别选取pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0进行。实验结果如图8所示。
实验结果表明，在不同的pH值下，孢子数的变化趋势大体相同，经历先上升、再稳定最后下降的趋势。当pH＝4时，最大孢子数与其他实验组相比有显著差别；当初始pH在4.5～6.0时，最大孢子数没有显著差别。又因为培养基配制好后的pH在5.8±0.1，因此选择初始pH为自然pH。
试验例5
接种量对白果冠突散囊菌液态发酵孢子数的影响。
采用实施例1的方法，不同之处在于：用移液枪在每个摇瓶分别接种1mL、2mL、3mL、4mL、5mL(1.7×108cfu/mL)孢子悬液。每组做三个平行，160rpm，28℃条件下连续培养6天，每天取样测定孢子数。
不同的菌种的发酵接种量一般不同，通常是细菌为1～5％、酵母菌5～10％、霉菌7～15％，有时接种量能够达到20～25％。但是相同的菌种在不同的培养基中又有不同的情况。接种量的大小对发酵有着重要的影响。接种量过小时，有时会影响菌体的培养时间，降低生产效率；采用较大的接种量虽然可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但是接种量过大时容易引起溶氧不足，影响产物合成，而且会过多移入代谢废物。合适的接种量，可以使菌体获得较为合适的生长繁殖速度，同时能够避免被杂菌污染，获得最大的生产效率。
实验结果如图9所示。各实验组孢子数的变化趋势类似，先上升、再稳定、随后减少，且都在第3天达到最大孢子数。其中，当接种量在1～3％范围时，随着接种量的变大，最大孢子数也在增大；当接种量在3～5％范围时，随着接种量的加大，最大孢子数逐渐减小。接种量为3％时最大孢子数达到最大，但与4％的接种量的最大孢子数没有显著差别。因此，选择3％的接种量为最优接种量。
试验例6
装液量对白果冠突散囊菌液态发酵孢子数的影响。
采用实施例1的方法，不同之处在于：改变摇瓶装液量，使得每个三角瓶的装液量分别为50mL、75mL、100mL、125mL和150mL，每组做三个平行，160rpm，28℃条件下培养6天，每天取样测定孢子数。
装液量的大小直接决定了菌种可利用的营养物质的多少。当装液量过小时，菌种可利用的营养物质就偏少，菌种的繁殖空间也相对减少，进而使菌种的生长繁殖受到限制。当装液量过大时，空气所占的空间就减少，液体中的溶氧含量减少，因此菌种可利用的氧气含量不足，满足不了菌种的生长需求，同样会使菌体的生长受到限制。
摇瓶装液量的影响结果如图10所示，不同装液量的孢子数变化趋势近似相同，但是最大孢子数又有明显的不同。其中，当装液量在50～100mL范围内时，随着装液量的上升，最大孢子数也在上升；当装液量在100～150mL范围内变化时，随着装液量的上升，最大孢子数在逐渐下降。装液量为100mL和125mL时，最大孢子数基本相同；装液量为75mL和150mL时，最大孢子数也基本相同。因此，选择的装液量为100mL。
试验例7
发酵时间对白果冠突散囊菌液态发酵孢子数的影响。
采用实施例1的方法，160rpm，28℃条件下连续培养数天，每隔24h测定一次孢子数，每个小组做三个平行。
实验结果如图11所示，在第3天孢子数达到最大。前1天为菌体生长期中的延滞期，由于刚接种到新鲜的培养液中，孢子需要时间进行萌发，在这期间孢子数相对减少。在第2、3天为菌体繁殖的指数期，经过一段时间的生长，菌体成熟，并产生大量孢子。孢子数在第3、4天时没有显著性差别，稳定在一定的水平，该时期为稳定期。从第5天起孢子数下降明显，这一时期为衰退期，由于生存环境的恶化，菌体开始死亡，前期的孢子在萌发成菌体后，也因为环境的改变而死亡。总体表现为孢子数的减少。因此，从获得最大孢子数考虑，最佳发酵时间为3天。
试验例8
优化前后对比
采用实施例1的方法作为优化后试验，实验培养基和培养条件采用优化后的最佳培养基和培养条件。对照组为实施例1的发酵方法中不加不添加任何无机盐作为优化前的试验，160rpm，28℃条件下连续培养6天，每天取样测定孢子数。
实验结果如图12所示，经过优化后，最大孢子数约为优化前的2倍。最大孢子数提高的同时，也将达到最大孢子数的发酵时间提前。
试验例9
1、发酵过程中理化成分的测定
(1)pH的测定
用pH计直接测定发酵液的pH。
(2)多糖含量的测定
标准曲线的绘制：称取葡萄糖标准品10mg于250mL容量瓶中加水，定容，吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，各加入5％的苯酚1.0mL，浓硫酸5.0mL，摇匀冷却，室温放置20min后于490nm处测吸光值，以2.0mL蒸馏水按相同显色操作作为空白，横坐标为多糖含量，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线。
A、样品处理：取2mL发酵上清液于50mL的离心管中，加无水乙醇18mL，混匀，于4℃冰箱静置4h，5000rpm离心5min，弃上清，残渣用80％的乙醇溶液洗涤，离心后弃去上清，反复3次，残渣用蒸馏水溶解，定容至10mL。
B、样品测定：取1mL样品处理液于25mL的比色管中，按标准曲线的绘制过程加入苯酚、浓硫酸和吸光值测定。
C、结果计算：按标准曲线中的公式，带入吸光值计算多糖含量。
(3)洛伐他汀含量的测定
洛伐他汀标准曲线的绘制：
(1)标准溶液的制备：精密称取2mg洛伐他汀标准品于10mL的容量瓶中，用色谱甲醇溶液定容，超声处理10min使之完全溶解，配制成浓度为0.2mg/mL的标准溶液。
(2)分别量取标准溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL的稀释溶液。
(3)吸取上述稀释溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤注入小瓶中待用，以洛伐他汀浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制洛伐他汀标准曲线。
发酵液中洛伐他汀的提取：发酵液3mL与色谱级甲醇等体积混合，超声处理30min，4000rpm，离心10min，取上清，过膜，即为洛伐他汀提取液。
洛伐他汀的测定：色谱条件为C18色谱柱(型号为：SinoChrom ODS-BP 5μm,4.6mm×250mm)，温度25℃，流动相为甲醇∶水＝80∶20(v/v)，检测波长为238nm，流速1.0mL/min，进样量20μL。
(4)总抗氧化能力的测定
总抗氧化能力的测定按照总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(比色法)的说明进行操作，具体操作如下。
样品制备：取5mL发酵液3500rpm，离心10min。取上清待测。
测定：按下表进行
表6.总抗氧化能力测定操作表
单位定义及计算公式：
定义：在37℃时，每分钟每毫升反应液使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。
计算公式：
总抗氧化能力(单位/每毫升试样)＝(测定OD值-对照OD值)×10/3×(反应液总量/取样量)×稀释倍数
2、发酵前后主要物质成分的测定
(1)可滴定酸的测定
采用氢氧化钠中和滴定法。吸取5mL混合均匀的样品液和20mL蒸馏水于100mL三角瓶中，滴加0.5mL酚酞乙醇作为滴定指示剂，混匀。用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行滴定至微红色，保持1min内颜色不消失为止，记录消耗NaOH标准液的体积V(mL)，酸度＝V×10。
(2)脂肪含量的测定
参照GB 5009-2016，索氏提取法测定，具体操作如下。
试样处理：称取混匀后的试样(包括发酵前和发酵后)称量10g，准确至0.001g，置于蒸发皿中，蒸干后，在电热鼓风干燥箱中干燥，取出，研细，全部移入滤纸并包好。抽提：将滤纸放入索氏抽提器内，连接实验仪器，加入石油醚至瓶内容积的三分之二处，85℃水浴加热7h。
称量：取下接收瓶，回收石油醚，待接收瓶内溶剂剩余1～2mL时在水浴上蒸干，再于100℃±5℃干燥1h，放干燥器内冷却30min后称量。重复以上操作直至恒重(直至两次称量的差不超过2mg)。
结果分析：脂肪含量按下式计算
X＝(m1-m0)/m2×100
式中，
X———试样中脂肪的含量，单位为克每百克(g/100g)；
m1———恒重后接收瓶和脂肪的含量，单位为克(g)；
m0———接收瓶的质量，单位为克(g)；
m2———试样的质量，单位为克(g)；
100———换算系数。
计算结果表示到小数点后一位。
(3)氨基酸种类的测定
参照GB 5009.124-2016中的方法进行测定，具体步骤如下。
标准溶液配制：混合氨基酸标准储备液(1μmol/mL)：分别准确称取单个氨基酸标准品(精确至0.00001g)于同一个50mL烧杯中，用8.3mL 6mol/L盐酸溶液溶解，精确转移至250mL容量瓶中，用水定容，混匀。
混合氨基酸标准工作液(100nmol/mL)：准确吸取混合氨基酸标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，加0.2mol/L的pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至刻度，混匀，为标准氨基酸工作液。
分析步骤：
A、取样与水解：用移液枪吸取2mL发酵液于安培瓶中，在瓶内加15mL 6mol/L盐酸溶液。继续向瓶内加入苯酚3滴。将安培瓶放入冷冻剂中，冷冻5min，然后充入氮气，在充氮气状态下封口。将已封口的安培瓶放在110℃±1℃的水解炉内，水解22h后，取出，冷却至室温。打开安培瓶，将水解液过滤至50mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一个50mL容量瓶内，定容，混匀。准确吸取1.0mL滤液至25mL试管内，40℃干燥，干燥后残留物用2mL水溶解，再干燥，最后蒸干。在试管中加入2.0mL pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液混匀，0.22μm滤膜过膜，为样品测定液，待用。
B、测定条件：使用混合氨基酸标准工作液注入氨基酸自动分析仪，色谱参考条件为：
色谱柱：磺酸型阳离子树脂，检测波长：570nm和440nm
C、试样的测定
将标准工作液和样品测定液以同体积注入分析仪器中，通过峰面积计算样品样品液中氨基酸的浓度。
(4)还原糖的测定
参照GB 5009.7-2016中的铁氰化钾法进行测定，具体操作如下。
试样制备：发酵液40mL，8000rpm，离心10min。取上清，备用。
试样溶液的测定：
氧化过程：吸取发酵液上清液5mL于50mL离心管中，再加入同体积碱性K3[Fe(CN)6]溶液，混合后立刻将离心管放入沸水中，20min后取出立即用冰水混合物迅速冷却。
滴定步骤：将氧化后的发酵液倒入100mL三角瓶中，再加入25mL乙酸盐溶液和5mL10％KI溶液，混匀，立刻用0.1mol/L Na2S2O3溶液进行滴定，再加1mL淀粉溶液，接着滴定直至溶液蓝色消失，记下消耗Na2S2O3溶液体积(V1)。
空白试验：吸取空白液5mL，按上述步骤操作，记下消耗的Na2S2O3溶液体积(V0)。
结果分析：查表可得试样中还原糖的质量分数。所消耗K3[Fe(CN)6]溶液得体积(V3)按下式计算:
V3＝(V0-V1)×c/0.1
式中:
V3———氧化发酵液中还原糖所用0.1mol/L K3[Fe(CN)6]溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V0———滴定空白液所用0.1mol/L Na2S2O3溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V1———滴定发酵液所用0.1mol/L Na2S2O3溶液的体积，单位为毫升(mL)；
c———所用Na2S2O3溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。
计算结果保留小数点后两位。
(5)总糖含量的测定
参照GB/T 15672-2009进行测定。具体操作如下。
取样：用移液枪吸取1mL试样于250mL三角瓶中。
水解：在三角瓶中加入5mL水和15mL浓盐酸，沸水浴回流3h。冷却定容至250mL。此溶液为样品测试液。
标准曲线的绘制：葡萄糖标准液的配制：将葡萄糖105℃烘干至恒重，称取葡萄糖0.1g，用水溶解于1000mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，置于4℃冰箱保存，两周有效。吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的葡萄糖标准液置于10mL具塞试管用蒸馏水补至1.0mL，向试液中加入1.0mL的5％苯酚溶液，然后快速加入5mL的硫酸(与液面垂直，不与试管壁接触，使之与反应液充分混合)，然后将试管置于30℃水浴锅中反应20min，在490nm处测吸光值。绘制标准曲线。
测定：调整水解液浓度，使其吸光值在标准曲线范围内，按照绘制标准曲线的步骤测定试样液的吸光值。
结果计算：根据测定的吸光值，标准曲线计算出总糖含量。
(6)总黄酮含量测定
标准曲线的绘制：用芦丁标准品配制成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048、0.056、0.064、0.072mg/mL，各取0.5mL，加0.3mL5％亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL，放置6min，加入4％氢氧化钠溶液4mL，70％乙醇4.5mL，混合均匀后放置20min，在510nm波长处测吸光值。以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品制备：发酵液1mL，加9mL 70％乙醇，70℃油浴锅搅拌提取60min。
测定：取0.5mL待测样品，加0.3mL 5％亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL，放置6min，加入4％氢氧化钠溶液4mL，70％乙醇4.5mL，混合均匀后放置20min，在510nm下检测以芦丁为标准品比对，结果表示为mg芦丁/mL提取物。
(7)萜内酯含量的测定
标准曲线的绘制：准确配置1.42mg/mL银杏内酯A标准溶液10mL，吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于25mL比色管中，各加70％乙醇溶液至1.0mL，然后加入0.4mL碱性羟胺溶液(13.9％盐酸羟胺水溶液+3.5mol/LNaOH溶液(1∶2)混合，现用现配)，反应5min后加入3mol/L HCI溶液0.4mL，6％FeCl3溶液0.2mL，混合均匀，再加入70％乙醇溶液5mL，摇匀后，517mn测吸光值。
样品制备：发酵液1mL，加9mL 70％乙醇，70℃油浴锅搅拌提取60min。
1.0mL待测样品，加入0.4mL碱性羟胺溶液(13.9％盐酸羟胺水溶液+3.5mol/LNaOH溶液(1:2)混合，现用现配)，反应5min后加入3mol/L HCI溶液0.4mL，6％FeCl3溶液0.2mL，混合均匀，再加入70％乙醇溶液5mL，摇匀后，517mn检测。
(8)α-淀粉酶活力测定
参照GB/T 5521-2008进行α-粉酶活力测定，具体步骤如下。
操作步骤：
分光光度计及其空白调整：2mL CaCl2溶液加到10mL碘稀液中，加入适量水V0稀释，混匀，20℃水浴保温20min，随后比色，使吸光度为0。
底物溶液的校准：吸取5.0mLβ-极限糊精溶液和15mL CaCl2溶液混匀。取2.0mL混合液，加入5倍体积碘稀液和适量水，混匀，置于20℃水浴中，保温20min，570nm处测吸光度，调整加水量使吸光值在0.55～0.60范围内。记下此时的加水量，并用它调整空白溶液的加水量。
α-淀粉酶的提取：取30mL发酵液，5000rpm，离心10min，取上清，待用。
活性测定：α-淀粉酶提取液和β-极限糊精溶液30℃水浴10min，取5.0mLβ-极限糊精溶液和15.0mL酶提取液于三角瓶中，混匀，加液时，计录时间。吸取10.0mL稀碘液于各个50mL三角瓶中，加V0mL水，摇匀，20℃水浴，每5min进行下列操作：
a)吸取2.0mL混合液到一个盛有稀碘液和V0mL水的试管中，摇匀，20℃水浴。
b)测吸光值。
结果计算：试样中的α-淀粉酶活性按下式计算
A＝500×f×b
式中：
A——α-淀粉酶活性，以U计；
f——酶提取液的稀释倍数；
b——lgD对t曲线的斜率的绝对值；
500——系数
(9)蛋白酶活力测定
参照SB/T 10317-1999进行蛋白酶活力测定，具体步骤如下。
标准曲线的绘制，按下表：
表7.不同浓度的酪氨酸溶液
测定步骤：取6支比色管编号按表加入各试剂溶液。摇匀，40℃保温20min，在660nm处测吸光值。测三次，取平均值。以1号管为对照组。以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线。
样品液的制备：吸取发酵液30mL，5000rpm，离心10min，取上清，待用。
样品测定：试管3支，编号1,2,3，每管内加入样品液1mL，其余步骤按国标中的方法进行操作。
计算：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生lμg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品酶活力单位＝A×4×N/10
A——由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；
4——4毫升反应液取出1mL测定(即4倍)；
N——酶液稀释的倍数；
(10)白果MPN及其葡萄糖苷衍生物含量的测定
HPLC法测定，具体步骤如下。
检测条件的建立：
色谱柱：SinoChrom ODS-BP(5μm，10×150mm)。流动相A：含5mM戊烷磺酸钠的5mM磷酸钾溶液(pH2.5)，流动相B：乙腈。梯度洗脱：0min，流动相比例为A 96％，B 4％；0～10min，流动相比例为A 92％，B 8％；10～15min，流动相比例为A90％，B 10％；15～20min，流动相比例为A 92％，B 8％；20～40min，流动相比例为A 96％，B 4％。柱温30℃；保留时间：40min。流速：1mL/min。检测条件：荧光发射波长395nm，激发波长295nm。
MPN标准曲线的建立：
准确称取0.02g MPN标准品，加入少量超纯水溶解后转移到100mL容量瓶中，再继续加超纯水定容到100mL，制备成0.2g/L MPN标准液。将标准液稀释成2mg/L，进样体积为：0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、100.0(单位：μL)，用HPLC检测各组浓度下的峰面积，根据峰面积与含量的线性关系，绘制标准曲线。
MPN葡萄糖苷衍生物(MPNG)标准曲线的建立：
将MPNG标品和MPN标品(2mg/L)1：1体积比混合，进样体积为：0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、100.0(单位：μL)，用HPLC检测各组浓度下的峰面积，根据峰面积与含量的线性关系，绘制出标准曲线。
样品制备：取发酵液5mL，10000rpm，离心10min。取上清液过0.45μm水系滤膜待液相检测。
(11)银杏酚酸含量的测定
采用RP-HPLC测定，以总银杏酚酸对照品定性，白果新酸对照品定量(外标法)，计算银杏酚酸含量。
检测条件的建立：
色谱柱：Agilent Zorbax XDB C 18 150mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇-1％冰醋酸溶液(90:10，v/v)；检测波长：310nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min
定量对照品溶液的制备(白果新酸)及标准曲线的绘制：
准确称取白果新酸对照品适量，用甲醇溶解、定容，配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL白果新酸标准溶液，摇匀，过0.45μm的有机滤膜，待测。用HPLC检测各浓度下的峰面积，根据峰面积与白果新酸含量的线性关系，绘制标准曲线。
总银杏酸定性对照品溶液的制备：
称取总银杏酸定性对照品适量，用甲醇溶解、定容，配制成0.2mg/mL总银杏酸定性对照品溶液，摇匀，过0.45μm的有机滤膜，待测。
样品处理及测定：称取发酵样品3mL，3mL石油醚为萃取剂，超声提取60min。收集石油醚层，旋转蒸发除掉石油醚，用色谱甲醇溶解、定容，摇匀，过0.45μm的有机滤膜，待测。
(12)香气成分的测定
样品前处理：样品6mL加入到20mL顶空瓶中，密封，插入老化的萃取针，60℃水浴，顶空萃取45min，进样，解析3min。
色谱条件：色谱柱为DB-5MS(30mm×0.25mm，0.25μm)；进样口温度250℃；升温程序：35℃保持3min，以10℃/min升至110℃，保持5min，再以5℃/min升至150℃，保持3min，最后以7℃/min升至230℃，保持5min；载气(He)：流速1.00mL/min，压力53.5kPa，进样口温度250℃，进样量1μL；进样口不分流。
质谱条件：离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离方式：EI+，电子能量70EV；检测器电压：1965V；扫描质量范围：20～400au。
(13)淀粉含量测定
参照GB 5009.9-2016进行淀粉含量的测定，具体步骤如下。
试样制备：称取2g试样(精确到0.001g)，剩余步骤按国标进行操作。
试样溶液测定：
吸取5.00mL碱性酒石酸铜甲液和同体积碱性酒石酸铜乙液，置于150mL三角瓶中，加水10mL，再加入比预测体积少1mL的试样溶液至三角瓶中，2min加热至沸腾，保持沸腾并以每2秒一滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。同法做3组平行，得出平均消耗体积。结果按式(1)计算。
试剂空白测定：按国标进行测定。
式(1)：X＝45×(A1-A2)/mv
式中：
X———试样中淀粉的含量,单位为克每百克(g/100g)；
45———系数；
A1———测定用试样中水解液葡萄糖质量，单位为毫克(mg)；
A2———试剂空白中葡萄糖质量，单位为毫克(mg)；
m———称取试样质量,单位为克(g)；
V———测定用试样水解液体积，单位为毫升(mL)；
(14)蛋白质含量的测定
参照GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法进行蛋白质的测定。
试样处理：称取液体试样10g，移入100mL定氮瓶中，加入0.4g CuSO4、6g K2SO4及20mL浓硫酸，摇匀后缓慢加热，碳化，无泡沫后，保持液体微沸，待液体是蓝绿色并清澈透明后，再加热60min。冷却后加入20mL蒸馏水，随后移入100mL容量瓶中，定容，混匀，备用。同时做试剂空白试验。
测定：向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入6粒小玻璃珠，加4滴甲基红乙醇溶液及3毫升硫酸，使水呈酸性，加热，使水保持沸腾。向接受瓶内加入10.0mL硼酸溶液及2滴A混合指示剂吸取5.0mL试样液加入反应室中。将10.0mL NaOH溶液注入反应室中，并立即水封。夹紧，蒸馏10min。用少量水清洗冷凝管下端，取下蒸馏液接收瓶。快速用硫酸标准滴定溶液滴定至终点，用A混合指示液，滴定至灰蓝色。同时做试剂空白。
结果计算：
X＝(V1-V2)×C×140×F/(m×V3)
式中:
X———试样中蛋白质的含量，单位为克每百克(g/100g)；
V1———试液消耗硫酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；
V2———试剂空白消耗硫酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；
c———硫酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
140———换算系数；
m———试样的质量，单位为克(g)；
V3———吸取消化液的体积，单位为毫升(mL)；
F———氮换算为蛋白质的系数。
试验例10
采用试验例9的各个检测方法，对实施例1的方法发酵7天的发酵过程中(1-7天)理化成分的测定，以及发酵前后主要物质成分的测定。
(1)pH的测定
在发酵过程中的pH变化如图13可知，经过发酵后，培养基的pH下降。原因是：培养基的基质是白果粉，其主要成分是淀粉、蛋白和脂肪。在微生物的作用下，糖类被发酵和氧化产生有机酸，脂肪也会被水解成有机酸，蛋白质同样会被水解成各类氨基酸，由于以上各种原因，使得培养基的pH在发酵过程中逐渐下降。
(2)粗多糖含量的测定
结果如图14所示，在发酵过程中，多糖含量在逐渐减少。由于本实验是以白果为底物进行发酵优化，白果的主要物质成分是淀粉。因此在菌种的生长过程中糖类物质作为碳源被消耗，导致多糖含量的减少。
(3)洛伐他汀含量的测定
洛伐他汀具有降血脂、抗动脉粥样硬化、对心肌细胞和内皮细胞的保护作用、抗炎作用、抗癌作用、降低骨质疏松和骨折危险的能力、预防老年卒中和痴呆风险的作用、对肾脏的免疫调节作用、对呼吸道合胞体病毒抑制作用。
实验结果如图15所示，在7天的发酵进程中，前两天没有产生洛伐他汀，此时的菌体正在产生诱导酶或合成有关的中间代谢物以进行生长繁殖，未产生次级代谢产物。在3～4天时，此时菌体处在生长稳定期，菌体在此时以初级代谢产物为前体，通过复杂的次级代谢途径合成各种有用的次级代谢产物[110]，洛伐他汀在此时开始生成。第4天之后，营养物质已耗尽，菌体产生的有害代谢产物不断的积累，使得生存条件不断恶化，菌体步入衰亡期。
(4)总抗氧化能力的测定
实验结果如图16所示，可以看出在7天的发酵过程中，总抗氧化能力呈现出先上升后下降的趋势。其中，在1～5天，随着发酵的进行，总抗氧化能力逐渐上升；在第5天之后开始下降。机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度有着密切的联系，该体系包括酶促和非酶促两个体系[111]。菌体在第4天左右处在一个稳定的阶段，菌体在此时大量合成各类次级代谢产物，因此，总抗氧化能力处于一个较高的水平。其后，随着发酵的进行，菌体开始衰弱、死亡，总抗氧化能力因此下降。
(5)香气成分的测定
发酵前后的风味物质是众多成分共同作用的结果，而不是仅靠某一种物质起作用。在众多的风味物质中，不是每一种物质都对最终的风味具有影响，而且每种物质的含量不同，当其含量超过一定数值时才能被人察觉到。
发酵前后的香气成分含量如表8所示。在发酵前，香气成分物质共检测到32种，含有烷烃类、醛类、酯类、醇类、醚类、酮类和酸类等，主要是烷烃类化合物，酮类、酸类、醛类和酯类物质含量较少。其中醇类物质有6种(12.29％)，酮类物质有2种(1.38％)，醛类物质有1种(1.82％)，酯类物质有3种(16.21％)，烷烃类物质有14种(34.78％)，酸类物质有2种(5.27％)。在发酵后，香气成分物质共检测到32种，主要是醇类、醛类和酯类。其中，醇类物质有6种(19.72％)，酮类物质有2种(7.29％)，醛类物质有5种(7.02％)，酯类物质有2种(6.54％)，烷烃类物质有13种(15.19％)，酸类3种(4.75％)。发酵之后，醇类物质的相对含量增加了60.46％。烷烃类物质含量明显减少，相比于发酵之前，减少37.74％。
酯类化合物是一种重要的风味物质，对风味影响很大。酯类化合物主要是通过脂肪酸水解和分子较小的酸、醇类合成及微生物代谢产生。酮类化合物也是一类重要的风味物质，对风味的影响也很大。酮类化合物产生的主要途径是通过不饱和脂肪酸氧化和氨基酸降解及微生物代谢等作用生成的。醇类化合物的风味阈值高，对风味的影响虽然不大，但是从综合效果上来看，仍然具有一定的影响。在微生物的作用下，烷烃类化合物的含量减少，醇类和酯类化合物的含量增加。在冠突散囊菌的作用下，香气成分发生明显的改变。经过发酵之后，香气更加浓郁，伴有淡淡的橘香味，愉悦可人。
表8.发酵前后香气成分的变化
(6)氨基酸种类的测定
氨基酸是蛋白质的基本结构单位，是合成蛋白质的原料，是食品、饲料的重要营养成分，氨基酸对机体生长和组织更新有积极作用。在医学上具有重要作用，在一定程度上预防克山病、大骨节病的发生，能够防病治病，也可作为营养型化妆品的有效成分同时也是合成药物、表面活性剂、其他工业产品的原料。
由表9可知，在发酵后，总氨基酸含量上升了60.62％。其中，天冬氨酸增加了11.73倍，苏氨酸增加了0.92倍，丝氨酸增加了1.34倍，谷氨酸增加1.36倍，甘氨酸增加了2.64倍，丙氨酸减少2.1％，半胱氨酸增加了5.43倍，缬氨酸增加了1.04倍，异亮氨酸增加了2.82倍，亮氨酸增加了10.18倍，酪氨酸增加了10.93倍，苯丙氨酸增加了2.21倍，组氨酸增加了0.59倍，赖氨酸增加了3.1倍，精氨酸减少了0.71倍，脯氨酸减少了0.72倍。
谷氨酸和天冬氨酸是小肠上皮细胞的重要能量来源，可通过脱羧基或转氨基等作用转化为其他营养物质，在维持动物的生长性能和肠道正常功能、信号通路、缓解氧化应激、基因的表达调控、神经调节等方面均发挥着重要的作用。苏氨酸是动物所需的必需氨基酸。苏氨酸可转变成丝氨酸、甘氨酸、丁酰CoA、琥珀酰CoA等。苏氨酸能够维持平衡动物体内氨基酸的平衡，还能促进机体内蛋白质的合成，增强动物的免疫功能，有利于肠道健康。异亮氨酸是动物的必需氨基酸，在食品中能增强食品的质量，均衡各种氨基酸的比例，提高营养价值；在医药方面能够治疗脑昏迷、代谢综合征、肥胖症、糖尿病和肝硬化等。亮氨酸能够起到刺激非乳腺组织蛋白、乳蛋白的合成作用。赖氨酸是动物的必需氨基酸，有促进机体生长发育、参与能量代谢、促进矿物质吸收和骨骼生长、增强免疫功能、治疗单纯疱疹病毒感染、减轻焦虑等功能。在动物机体内苯丙氨酸经苯丙氨酸羟化酶作用而转变成酪氨酸，而该过程是不可逆的，酪氨酸在机体内可进一步代谢合成多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素或合成黑色素等。色氨酸通过肝脏发挥作用，主要在肝脏中进行分解代谢，可以作为合成组织蛋白质的原料，同时调控蛋白质的沉积和代谢。缬氨酸既是蛋白质合成的底物，又是合成过程的调节因子，介导细胞信号传导通路的调节；同时也是重要的供能物质。
通过上述的总结得知测得的必需氨基酸的含量均上升。在非必需氨基酸中，丙氨酸、精氨酸和脯氨酸的含量有不同程度的减少。发酵之后，氨基酸含量更高，营养价值更加丰富。
表9.发酵前后氨基酸种类的变化
(7)其他成分的测定
表10.其他营养成分含量变化
如表10所示，经过发酵作用后，由于菌体在生长过程中会分泌各种酶类来帮助菌体吸收利用所需的营养物质，如糖类、蛋白、脂肪等；同时菌体也会产生各种次级代谢产物。最终使得发酵液中的营养物质减少，酶类含量上升。其中，酸度上升2倍，总糖减少28.13％，淀粉减少61.67％，蛋白质减少41.89％，脂肪减少11.54％，还原糖减少95.42％，总黄酮减少11.43％，萜内酯减少2.48％，银杏毒减少40.15％，酚酸全部降解，游离氨基酸含量增加2倍，蛋白酶活力为23U/mL，α-淀粉酶活力为11.3％。
发酵之后，营养物质成分发生改变，增加了氨基酸含量和消化酶的含量，有效保留了白果中的功能性成分，致毒致敏成分下降明显。
综合上述各个试验例，本发明的冠突散囊菌在以8％(g/mL)的白果粉、0.063％(g/mL)的硫酸亚铁、0.125％(g/mL)的硫酸锌和0.5％(g/mL)的氯化钙和0.4％(g/mL)的硫酸镁组成的液体培养基中，摇瓶(250mL)装液量100mL、自然pH、接种1.7×108cfu/mL孢子悬液3mL、28℃培养3天。孢子数能够达到最大值。
通过试验发现多糖、洛伐他汀、总抗氧化能力随着发酵的进行，呈现动态变化。其中，多糖在发酵过程中作为碳源被消耗，含量随着发酵的进行在逐渐减少，在第3天时含量为1.4mg/L；洛伐他汀的含量在第4天达到最大值，为32.97μg/mL；总抗氧化能力在第5天达到最大值为63单位/mL。
酸度、总糖、淀粉、蛋白质、脂肪、还原糖、总黄酮、萜内酯、总游离氨基酸、银杏毒、银杏酚酸、蛋白酶、α-淀粉酶、香气成分等在发酵结束后都有明显的变化。其中，酸度为30，上升2倍；总糖含量为46mg/mL，减少28.13％；淀粉为23mg/mL，减少61.67％蛋白质含量为4.3mg/mL，减少41.89％；脂肪为2.3mg/mL，减少11.54％；还原糖为0.07mg/mL，减少95.42％；总黄酮31μg/mL，减少11.43％；萜内酯15.7μg/mL，减少2.48％；银杏毒减少40.15％；总游离氨基酸增加1.65倍；蛋白酶活力为23U/mL；α-淀粉酶活力为11.3％。发酵结束后芳香性成分以醇类、酯类物质为主。
Claims (5)
1.一种白果冠突散囊菌液态发酵的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液；
（2）将白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，加水磨浆，再在白果果仁浆中加入无机盐，制备液体发酵培养基，灭菌后备用；
（3）在无菌条件下向步骤（2）制得的液体发酵培养基中接种步骤（1）制备的冠突散囊菌孢子悬液，振荡培养后得到白果冠突散囊菌液态发酵产品；
步骤（2）培养基中无机盐为氯化钙、硫酸镁、硫酸锌和硫酸亚铁，氯化钙的浓度为4-5mg/mL，硫酸镁的浓度为4 mg/mL，硫酸锌的浓度为1.25mg/mL，硫酸亚铁的浓度为0.63 mg/mL；培养基中白果的浓度为8g干重/100 mL；培养基初始pH为5.8±0.1；
步骤（3）所述接种的接种量为每100 mL接种3 mL孢子悬液，孢子悬液的浓度为1.7×108 cfu/mL；振荡培养为每250mL摇瓶装液量为100 mL，于28 ℃、160 rpm振荡培养3天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的活化分离为将保存的冠突散囊菌菌种取出，在PDA平面培养基上划线培养，挑取单菌落，再在PDA平面培养基上进一步划线培养，重复2~3次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的制备孢子悬液为将在PDA平面培养基上生长的冠突散囊菌孢子刮下，移入含有玻璃珠的无菌水中，振荡打散孢子团，进行孢子计数，并调节孢子悬液浓度。
4.一种权利要求1-3所述的白果冠突散囊菌液态发酵的方法所制备的白果冠突散囊菌液态发酵产品。
5.一种权利要求4所述的白果冠突散囊菌液态发酵产品在制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的酵素、饮品或其它具有保健功能的食品中的应用。
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