CN105613912B

CN105613912B - 一种基于微生物发酵法制备桂圆果脯的方法

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Publication number: CN105613912B
Application number: CN201410667992.3A
Authority: CN
Inventors: 王慧; 储瑞蔼; 葛瑞宏; 李井泉
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2034-11-20
Also published as: CN105613912A

Abstract

本发明涉及一种基于微生物发酵法制备桂圆果脯的方法。本发明以合适的发酵菌种，以桂圆为发酵原材料，获得了基于生物发酵生产工艺的桂圆果脯。该桂圆果脯选料健康，基本不包含食品添加剂，且保质期长，是一种理想的保健品或食品。

Description

一种基于微生物发酵法制备桂圆果脯的方法

技术领域

本发明涉及食品领域，更具体地，本发明涉及一种基于微生物发酵法制备桂圆果脯的方法。

背景技术

果脯是以果蔬为原料，用糖加工而成的食品，传统工艺加工的果脯类食品，通常需要添加酸味剂、甜味剂、色素、香精、防腐剂等添加剂，但口味单一，而且产品营养价值不高，难以满足现代消费者的需求。

鲜桂圆不耐储藏，很容易霉变腐烂，通常经过烘干或者晒干直接加工成果干或者果肉干，产品形式相对单一，且口味不够理想。

因此，本领域有必要开发保质期较长且口味良好的桂圆加工产品，为人们提供安全、健康的新型食品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于微生物发酵法制备桂圆果脯的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备桂圆果脯的方法，所述方法包括：以桂圆干浸提液为发酵培养基，加入去壳鲜桂圆，以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌作为发酵菌株进行发酵，将发酵产物加工为果脯，获得桂圆果脯；其中，所述的桂圆干浸提液中还包括0.1-0.3％(重量比)MgSO₄。

在一个优选例中，接种鲜桂圆之前，经过在开水中漂烫的步骤；漂烫之后进行冷却，在无菌条件下加入到发酵培养基中。

在另一优选例中，所述的发酵菌株中，所述的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的比例为1:2～2:1。

在另一优选例中，所述的桂圆干浸提液如下制备：将桂圆干的果肉与水按照1:3-6的比例，60±5℃浸提4±2小时后过滤，收集滤液，得桂圆干浸提液。

在另一优选例中，所述的发酵菌株的菌液浓度为10⁵～10⁷CFU(较佳地为10⁶CFU)；接种量为5-10％(较佳地为接种量7-9％；更佳地为接种量8-9％)。

在另一优选例中，发酵的温度为25-34℃；较佳地为28-33℃。

在另一优选例中，发酵时间为7-11天；较佳地为8-10天。

在另一优选例中，发酵的初始pH值为6±0.2；较佳地为6±0.1。

在另一优选例中，将发酵产物加工为果脯的方法包括：将鲜桂圆的发酵产物浸糖、沥糖、干燥、灭菌，获得桂圆果脯。

在另一优选例中，在0.08±0.02Mpa、糖液温度55±5℃条件下浸糖，浸糖时间80±20min。

在另一优选例中，在60±5℃条件下干燥，干燥时间16±5小时。

在另一优选例中，灭菌前进行杀菌。

在本发明的另一方面，提供一种桂圆果脯，所述的桂圆果脯由前面任一所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备桂圆果脯的发酵培养基，该培养基包括：桂圆干浸提液以及0.1-0.3％(重量比)MgSO₄。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、一种乳酸菌发酵桂圆果脯制备的工艺流程。

图2、不同营养物质对乳酸菌发酵液酸度的影响。

图3、不同营养物质对乳酸菌发酵液OD₆₀₀值的影响。

图4、不同发酵时间对发酵液酸度的影响。

图5、不同发酵时间对乳酸发酵液还原糖含量的影响

图6、乳酸菌接种量对发酵液酸度的影响(发酵10天)。

图7、乳酸菌接种量对发酵液还原糖含量影响(发酵10天)。

图8、发酵温度对乳酸菌发酵液酸度的影响。

图9、发酵温度对乳酸菌发酵液还原糖含量的影响。

图10、乳酸菌发酵桂圆果脯(常温下存放1年)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，选择了合适的发酵菌种，以桂圆(如桂圆干或鲜桂圆)为发酵原材料，获得了基于生物发酵生产工艺的桂圆果脯。该桂圆果脯选料健康，基本不包含食品添加剂，且保质期长，是一种理想的保健品或食品。

菌种

现有技术中，乳酸菌常被应用于制备酸奶、酸豆奶等。其中，最多的是酸奶，在饮料市场占很大份额。然而，目前尚未发现应用乳酸菌进行桂圆加工的工艺及产品。

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌均为益生菌，两者混合发酵比单独发酵效果要好，因为保加利亚乳杆菌能够分解酪蛋白，游离出的氨基酸为嗜热链球菌的生长提供了营养物质，而嗜热链球菌产生的甲酸，能够促进保加利亚乳杆菌的生长。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这种互惠共生的相互作用能够发酵提高产酸速率，减弱后酸化程度，并且使发酵产品的风味更佳。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌能够利用葡萄糖和乳糖。

生产工艺

在以往的技术中，制作果脯以腌制为主，并添加酸味剂、甜味剂、色素、香精、防腐剂等添加剂，添加剂多，难以满足人们越来越高的对生命健康的要求。因此，本发明人考察了多种多样的方法，以期开拓出新型果脯加工工艺。

在优化果脯的生产工艺的过程中，本发明人出乎意料地发现以桂圆干浸提物为发酵培养基，以鲜桂圆为发酵材料，利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合物作为发酵菌株，可以获得口感良好的桂圆果脯。并且，在相对较低的温度(约28-33℃)下发酵，口感及外观更为理想。

本发明的制备桂圆果脯的方法包括：以桂圆干浸提液为发酵培养基，加入去壳鲜桂圆，以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌作为发酵菌株进行发酵，将发酵产物加工为果脯，获得桂圆果脯。

作为本发明的优选方式，所述的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的比例为1:2～2:1；更优选的是两者等量混合。其它与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌具有类似的发酵性能的菌株也可应用于本发明中。

关于混合菌株的初始接种量，本发明研究后发现，乳酸菌发酵液酸度先随着接种量的增加而增加，接种量为8％时酸度达到最大值。接种量达到10％时，产酸量开始降低。而12％或更高的接种量对应的乳酸酸度反而最低，原因可能是接种量过大，使得前期生长过快、培养液黏度增加，菌体早衰，造成发酵后劲不足，影响产酸量及转化率。因此，作为本发明的优选方式，所述的发酵菌种的接种量为4-12％；较佳地为8-10％。

关于发酵的温度，微生物与所有生物体一样，为提高体内酶的活性需要保证环境温度在菌体生长的最适温度范围，而酶对环境温度很敏感，因而需要严格有效地控制温度，使其适于菌体生长和目标产物的合成。通常酶反应速率随着发酵温度的升高而增大，此时菌体生长代谢旺盛，缩短了生产周期。但是酶本身又容易因为温度过高而失去活性，表现为菌体容易衰老，发酵周期缩短，而影响乳酸最终产量。本发明人研究发现，当用于发酵法生产桂圆果脯时，发酵的温度为25-34℃；较佳地为28-33℃。该温度条件显著低于乳酸菌的最适发酵温度，但是当用于制备桂圆果脯时，该温度条件下获得的产物是最为理想的。

乳酸发酵桂圆果脯的颜色随着发酵时间的进行，颜色逐渐变深。作为本发明的优选方式，发酵时间为7-11天；较佳地为8-10天。在该时间范围内，获得的桂圆果脯的口感和外观较为良好。

桂圆果脯产品

本发明还提供了应用所述的制备桂圆果脯的方法制备获得的桂圆果脯，以及由该桂圆果脯经加工获得的可食用(或服用)的加工产品。

本发明的桂圆果脯可被制备成食品、保健品。利用乳酸菌发酵桂圆制备的果脯感官优良：酸甜口味、口感柔和，咀嚼性好，产品透明或半透明，品质稳定，保质期长，不添加色素、香精及防腐剂。

本发明的桂圆果脯是现代生物工程技术与中医药理论相结合的产物。其不但保持了桂圆中原有的植物粗多糖、黄酮等功效成分，还含有有机酸(乳酸)等营养物质，风味好，营养价值高。并且，本发明的桂圆果脯保质期长，无需防腐剂就可常温保存1年以上，环保健康。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1材料与方法

1.1材料与试剂

市售桂圆干；保加利亚乳杆菌(菌株编号CICC 6098)、嗜热链球菌(菌株编号CICC6219)均由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供，培养温度均为37℃；鲜桂圆、白砂糖均为市售；柠檬酸AC(食品级)、羧甲基纤维素钠CMC(食品级)，上海福乐食品贸易有限公司。

MRS培养基(种子培养基)(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉10.0，酵母粉5.0，葡萄糖20.0，硫酸镁0.1，醋酸钠5.0，柠檬酸铵2.0，磷酸氢二钾2.0，硫酸锰0.05，吐温801.0(PH6.2±0.2)

1.2仪器与设备

Multiskan Spectrum酶标仪、LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器、HDL净化工作台、DHP-9162型电热恒温培养箱、DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱、电子天平、精密pH计等。

1.3分析方法

1.3.1活菌数的测定：平板计数法；

1.3.2可溶性固形物含量测定：手持糖度计；

1.3.3发酵液pH值测定：精密pH计；

1.3.4酸度测定：NaOH滴定法(以乳酸计)；

1.3.5菌液OD600值：600nm处测定OD值；

1.3.6还原糖浓度测定：发酵液中残糖浓度的测定采用DNS法。

1.4感官评价方法

乳酸发酵桂圆果脯感官评价方法如表1所示。

表 1

注：口感，出现异味者为0分，其余按酸甜度、筋度、桂圆风味保持度在1～50分之间评分；色泽，被认为尚有商品价值者为合格分12分，其余按色泽深浅程度在13～20分之间评分；外观，质地糜烂者为0分，其余按其果形饱满程度在1～30分之间评分。

1.5工艺说明

1.5.1乳酸菌发酵剂的制备

分别自菌种保藏斜面(保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌)刮取一环生长良好的菌体，接入50ml液体种子培养基中，37℃静置培养15h，进行菌种活化。以10％(v/v)的接种量，将已活化好的种子培养液接入100ml生产培养基中，37℃静置培养15h后，分别得到保加利亚乳杆菌发酵剂和嗜热链球菌发酵剂，将两种菌等比例混合，即为乳酸菌发酵剂。

1.5.2乳酸菌发酵剂菌液浓度测定

将两种乳酸菌发酵剂分别作10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10稀释。取10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8稀释倍数的菌液涂布平板，37℃静置培养24hrs，测量菌落数，计算菌液浓度。

1.5.3生产培养基(发酵培养基)的制备

将桂圆干的果肉与水按照1:4比例，60℃热水浸提4hrs后过滤，收集滤液。按照表2中的用量分别添加MgSO₄、CaCl₂、蜂蜜和L-Cys，然后90℃灭菌15min作为生产培养基，冷却后分别接入5％(v/v)菌种，培养24hrs、48hrs，测定酸度及OD600值。

表 2

1.5.4乳酸菌发酵桂圆果脯制备工艺流程

乳酸菌发酵桂圆果脯制备的工艺流程如图1所示。

分别取一定量的乳酸菌发酵剂(10^-6CFU)于经灭菌的装有100mL生产培养基的三角瓶中。将去壳鲜桂圆(加入10个)在沸水中漂烫1min，冷却，在无菌条件下加入到生产培养基中进行发酵。发酵结束后将乳酸菌发酵桂圆经真空度为0.08Mpa、糖液温度55℃条件下浸糖时间80min，沥糖，再在60℃条件下干燥16h左右，包装、辐照杀菌后即得乳酸菌发酵桂圆果脯。

1.5.5发酵工艺研究

在确定生产培养基条件基础上，研究乳酸发酵工艺条件包括发酵时间、接种量、发酵温度对乳酸菌发酵桂圆及其果脯的影响。

1.5.5.1发酵时间

分别取一定量的乳酸菌发酵剂(10^-6CFU)于装有100mL生产培养基的三角瓶中，将去核去壳的鲜桂圆开水漂烫1min后，冷却，在无菌条件下放入上述培养瓶中进行发酵。37℃条件下静置发酵，每天测量发酵液的PH值、酸度、OD600值及还原糖含量，对乳酸发酵桂圆果脯进行感官评价。考察不同发酵时间对发酵液及发酵桂圆果脯的影响。

1.5.5.2接种量

分别取1mL、3mL、5mL、8mL、10mL、12mL、15mL的乳酸菌发酵剂(10^-6CFU)于经灭菌装有100mL生产培养基的三角瓶中，即接种量(按照体积计)1％，3％，5％，8％，10％，12％，15％。将去壳鲜桂圆开水漂烫1min后无菌放入上述培养瓶中进行发酵。37℃条件下静置发酵，发酵一定时间后，测定发酵液的PH值、酸度、OD₆₀₀值及还原糖含量，对乳酸发酵桂圆果脯进行感官评价。确定最佳接种量。考察不同接种量对发酵液及发酵桂圆果脯的影响。

1.5.5.3发酵温度

取8mL乳酸菌发酵剂(10^-6CFU)于灭菌装有100mL生产培养基的三角瓶中，即接种量8％，将去壳鲜桂圆开水漂烫1min后无菌放入上述培养瓶中，分别于25℃、30℃、37℃及42℃条件下静置发酵。发酵一定时间后，测定发酵液的PH值、酸度、OD600值及还原糖含量，对乳酸发酵桂圆果脯进行感官评价。考察发酵温度对发酵的影响，确定适宜的发酵温度。

1.5.5.4正交实验

在单因素实验的基础上，确定以发酵初始PH值、发酵时间、接种量和发酵温度为因素的L9(3⁴)正交试验。以发酵液酸度和桂圆果脯感官评价为指标，确定乳酸发酵桂圆工艺最佳条件，正交试验因素水平表如表3所示。

表3、正交实验因素水平表

1.6保质期试验

将乳酸菌发酵桂圆果脯37℃下放置三个月，常温条件下放置一年，同时以4℃冰箱中存放的样品作为空白对照。考察乳酸菌发酵果脯在一年保质期内的感官品质。

实施例1、培养基的配制

1、乳酸菌发酵剂菌液浓度优化

将稀释倍数为10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8的菌液取100μl涂布平板，37℃静置培养24hrs后，以稀释倍数为10^-5的平板进行菌落计数，菌落数为20个，计算菌液浓度：

20个/100μl×10⁵＝20个/0.1mL×10⁵＝2×10⁶个/mL。

2、生产培养基中营养物质添加

在乳酸菌培养时，在生产培养基中添加Mg²⁺和Ca²⁺等元素阳离子，以满足其代谢的需要。不同微生物所需要的离子不同以及它们的最适浓度也不同。如前1.5.3中记载配制生产培养基，观察添加不同营养物质的影响。

如图2所示，酸度指标中，添加1.5％蜂蜜、0.2％MgSO₄、0.1％MgSO₄+0.1％CaCl₂的乳酸菌发酵液较空白组显著高。

如图3所示，添加0.2％MgSO₄、0.1％MgSO₄+0.1％CaCl₂的乳酸菌发酵液的OD₆₀₀值较空白组显著高，其它组OD₆₀₀值较空白组低。根据乳酸发酵液各项指标可可以看出添加MgSO₄和CaCl₂两种无机盐成分可以加速乳酸发酵反应，其中MgSO₄效果最为理想。

通过生产培养基培养条件对乳酸发酵液PH值、OD₆₀₀值的影响研究，确定以桂圆汁作为生产培养基，添加0.2％(重量比)MgSO₄·7H₂O，初始PH值6.0-6.5，不额外添加碳源。

实施例2、发酵工艺优化

1、发酵时间的选择

如前述1.5.5.1记载的方案进行实验，考察不同发酵时间对发酵液及发酵桂圆果脯的影响。

如图4所示，不同接种量的乳酸发酵液酸度随着发酵时间的变化趋势基本一致。在发酵前10天内，酸度随着发酵时间的增加而增加，发酵10天以后，酸度趋于稳定。

如图5所示，不同接种量的乳酸发酵液还原糖含量随时间变化大体呈现相似的趋势。在发酵前期随着发酵时间的延长，还原糖含量逐渐降低，原因可能是乳酸菌利用生产培养基中的碳源进行发酵致使乳酸发酵液中的还原糖量减少。发酵时间超过10天后，还原糖含量出现了升高，原因可能是乳酸发酵过程中产生的酶对桂圆果肉发生了分解作用，致使果肉中的糖溶解到乳酸发酵液中，随着发酵的进行，越来越多的桂圆果肉中的糖分及其他成分被溶解在了发酵液中，因此可根据还原糖量的变化对发酵时间进行控制，即应在还原糖量升高前停止发酵。

同时，考察在不同的发酵时间，桂圆果脯的感官评价，结果如表4。

表4、乳酸发酵时间对桂圆果脯感官影响

选取接种量为5％的桂圆发酵果脯为研究对象，对不同发酵时间制备的乳酸发酵桂圆果脯进行感官评价，其结果如表3所示。乳酸发酵桂圆果脯的颜色随着发酵时间的进行，颜色逐渐变深。原因可能是，乳酸菌发酵过程中产生的氨基酸与发酵液中的糖元发生美拉德反应，且随着时间的延长，积累的产物逐渐增多，颜色逐渐加深。

因此，发酵时间控制在9-10天是较为理想的。

2、接种量的选择

如前面1.5.5.2记载的方案考察乳酸菌的接种量对于发酵过程及发酵产物的影响。

结果如图6所示，乳酸菌发酵液酸度先随着接种量的增加而增加，接种量为8％时酸度达到最大值。接种量达到10％时，产酸量开始降低。而12％和15％的接种量对应的乳酸酸度反而最低，原因可能是接种量过大，使得前期生长过快、培养液黏度增加，菌体早衰，造成发酵后劲不足，影响产酸量及转化率。因此选择8％的接种量作为乳酸菌发酵最适宜接种量。

如图7所示，接种量在5％-10％范围内，接种量为8％时的还原糖含量最低，表明此时乳酸菌发酵最快，对碳源利用率最高。

同时，考察在不同的接种量条件下，桂圆果脯的感官评价，结果如表5。

表5、乳酸发酵桂圆果脯感官评价结果

如表5所示，乳酸发酵桂圆10天后制备的果脯颜色随着接种量的增加而逐渐加深。接种量为8％时的酸甜适中、口感较好，颜色可以接受。

3、发酵温度的选择

如前面1.5.5.3记载的方案考察乳酸菌的发酵温度对于发酵过程及发酵产物的影响。

如图8所示，接种量为8％，发酵10天后，乳酸菌发酵液酸度在发酵温度为30℃达到最高值。同时，发酵温度为30℃时，发酵液残糖量即还原糖含量最低，如图9。

根据以上结果可知，温度为30℃时，菌体生长最快，最先达到稳定期；温度为25℃和37℃时，较30℃时生长缓慢，稳定期滞后，产酸速率降低。而温度为42℃时，菌体提前进入衰老期，可能是温度太高，导致菌体自溶速度加快。

同时，考察在不同的发酵温度条件下，桂圆果脯的感官评价，结果如表6。

表6、乳酸发酵桂圆果脯感官评价结果

注：+越多，表明产品外观、色泽、口味越好。

如表6所示，乳酸发酵桂圆果脯在发酵温度为25℃和30℃时，颜色较好，呈现深红色。温度37℃时颜色加深，发酵温度为42℃时的乳酸发酵桂圆呈现黑色。原因可能是温度越高美拉德反应程度越高。

4、正交试验

单因素实验中感官评价结果表明，在本实验设计的条件范围内，酸度值越高，乳酸菌发酵桂圆果脯的产品感官质量越好。因此，设计正交试验(如前述1.5.5.4)，以酸度作为评价指标，实验结果如表7所示。

表7、乳酸发酵桂圆正交试验结果

由表7的因素及差值大小看出，以感官评价为指标，影响乳酸发酵桂圆的因素主次顺序为：发酵温度>发酵时间>发酵初始PH值>接种量。乳酸发酵条件正交试验得到的最优组合是A₃B₃C₃D₁，即接种量9％，发酵时间10天，发酵温度32℃，发酵初始PH值6.00。

表8、正交方差分析表

由表8方差分析结果可以看出，因素B发酵时间和因素C发酵温度的差异在α＝0.05水平上是显著的，这个结果表明发酵时间和发酵温度对试验结果也有重要影响。按照最优组合条件制备桂圆发酵果脯感官较好，深红色有光泽、酸甜适口、耐咀嚼，产品为透明或半透明。

5、乳酸菌发酵桂圆果脯保质期试验

如前面1.6提供的方案进行桂圆果脯保质期试验，结果如表9、图10所示。

表 9

可见，本发明的工艺制备的桂圆果脯可以常温保存1年以上，低温冷藏则保质期更长。

综上，乳酸菌发酵桂圆果脯相对传统果脯营养价值高，产品感官品质优良，口感好，无需添加防腐剂、色素等添加剂，天然健康，稳定性好，保质期长。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种制备桂圆果脯的方法，其特征在于，所述方法包括：以桂圆干浸提液为发酵培养基，加入去壳鲜桂圆，以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌作为发酵菌株进行发酵，将发酵产物加工为果脯，获得桂圆果脯；所述的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的比例为1:2～2:1；

其中，所述的桂圆干浸提液如下制备：将桂圆干的果肉与水按照1:3-6的比例，60±5℃浸提4±2小时后过滤，收集滤液，得桂圆干浸提液；所述的桂圆干浸提液中还包括按照重量比0.1-0.3％MgSO₄；

其中，发酵时间为8-10天；发酵温度为25-33℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵菌株中，所述的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等比例混合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵菌株的菌液浓度为10⁵～10⁷CFU；接种量为5-10％(v/v)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵的温度为28-33℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵时间为9-10天。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵的初始pH值为6±0.2。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵的初始pH值为6±0.1。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将发酵产物加工为果脯的方法包括：将鲜桂圆的发酵产物浸糖、沥糖、干燥、灭菌，获得桂圆果脯。