CN109463744B - 一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法及其制备的产品和应用 - Google Patents

一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法及其制备的产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法及其制备的产品和应用，该方法包括：(1)制备冠突散囊菌孢子悬液；(2)制备白果粉，添加无机盐，调节pH制备固态发酵培养基；(3)向固态发酵培养基中接种冠突散囊菌孢子悬液，并加入无菌去离子水，调节初始含水量，培养并隔天补加无菌去离子水，发酵后得到冠突散囊菌固态发酵白果粉。本发明以白果粉作为冠突散囊菌固态发酵的基料，经过发酵后，保留了白果粉大部分营养成分和功能成分，有效地降解了白果粉中的银杏酚酸和MPN，由于冠突散囊菌的生长和代谢作用，使发酵后的白果粉中含有大量的冠突散囊菌孢子，洛伐他汀、多糖、α‑淀粉酶、蛋白酶等众多功能保健成分，而且风味明显改善。

Description

一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法及其制备的产品和 应用
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法。
背景技术
白果是银杏果实去除外种皮的部分，包括中种皮、内种皮、胚乳和胚芽，其果仁为可食用部分。成熟的白果呈淡黄色或橙黄色，白果作为食疗、滋补、保健食品已有1000多年的历史。
白果其药用作用最早收载于元文宗时吴瑞的《药用本草》一书。李时珍的《本草纲目》中有载：“白果熟食温肺益气，定喘嗽，缩小便，止白浊。生食降痰，消毒杀虫”。后人以白果为原料烹制的药膳，有祛病健身，止咳定喘的功效。白果中功能成分主要银杏酸、银杏醇、银杏黄酮苷、银杏萜内酯、氢化白果酸、氢化白果亚酸、维生素、钙、磷、铁、钾等，成分丰富。现代医学研究表明，白果具有抗肿瘤、抗癌、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血压、抑菌杀毒等多种功能。
由于白果具有丰富的营养保健功能，1992年我国卫生部将白果列为“药食两用”资源。但是当前白果深加工产品、高附加值产品少。市场上销售的主要是白果干果、白果开心果、白果粉、白果复合粉、白果罐头、白果奶茶、白果汁饮料等初(粗)加工产品，群众接受度低，销售难度大。白果淀粉、白果蛋白、白果油脂、白果多糖等深加工产品还多停留在实验室阶段。白果发酵产品也仅有酿酒酵母发酵白果果酒、乳酸菌发酵白果汁饮料的报道，发酵菌种少，多为液态发酵，且也都处于实验室研究阶段。此外，白果中含有银杏酚酸、MPN等致敏致毒成分，一定程度上给白果食品的安全性蒙上阴影。上述这些因素严重制约了白果产业的发展，造成白果滞销，影响到果农的积极性和经济收入，使这一药食俱佳的食品原料潜力未能很好地发挥。
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是一种有益真菌，属于散囊菌目发菌科散囊属，在茯砖茶的生产过程中是产生“金花”的优势菌，因此俗称为“金花”菌。同时冠突散囊菌也是形成茯砖茶独特品质的主要因素。由于冠突散囊菌的作用，使得茯砖茶的色、香、味不同于其他茶类，发酵后具有多种新增物质，赋予茯砖茶多种功效，如抗氧化、促消化、降脂减肥、抑菌、抗癌等。2016年12月7日，国家卫计委新食品原料受理系统接受了冠突散囊菌(CGMCC NO.8730)新食品原料申请。
冠突散囊菌在生长繁殖的过程中，通过对营养物质的分解利用，将大分子物质分解为小分子物质的同时自身也产生多种分泌物，如色素类、酶类、胆固醇类、多糖、生物碱、洛伐他汀等物质。这些物质具有抑菌、抗过敏、抗氧化、抗辐射、抗紫外、降血脂和抑制肿瘤等重要的生物活性，在食品、医药、农业等领域有着广泛的应用前景。
发明内容
发明目的：针对白果加工业的落后现状及现有白果发酵产品发酵菌种少、多为液态发酵的问题，本发明提供一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法，该方法以白果粉作为发酵基质，经过发酵后，保留了白果粉大部分营养成分和功能成分，有效地降低了银杏酚酸和MPN(4-甲氧基吡哆醇)的含量，提高了白果粉的安全性。由于冠突散囊菌的生长和代谢作用，发酵后所得到的白果粉发酵产品中含有大量的冠突散囊菌孢子，洛伐他汀、多糖、α-淀粉酶、蛋白酶等众多功能保健成分，同时产生香气成分使得白果粉发酵产品的感官性状得到了提升，风味明显改善。
本发明的另一个目的是提供了上述方法制备的冠突散囊菌固态发酵白果粉产品及其应用，该固态发酵白果粉可用作制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的保健食品或药品的原料或配料，丰富白果的产品类型。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法，包括如下步骤：
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液；
(2)将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，添加无机盐，调节初始pH，制备固态发酵培养基，封口灭菌后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的固态发酵培养基中接种步骤(1)制备的冠突散囊菌孢子悬液，并加入无菌去离子水，调节初始含水量，封口后置于恒温恒湿环境中培养，并隔天补加无菌去离子水维持固态发酵培养基含水量，发酵一定时间后得到冠突散囊菌固态发酵白果粉。
其中，步骤(1)所述的活化分离为将在冰箱中保存的冠突散囊菌菌种取出，在PDA平面培养基上划线培养，挑取单菌落，再在PDA平面培养基上进一步划线培养，如此重复2～3次。
其中，步骤(1)所述的制备孢子悬液为将在PDA平面培养基上生长的冠突散囊菌孢子刮下，移入含有玻璃珠的无菌水中，振荡打散孢子团，进行孢子计数，并调节孢子悬液浓度。
作为优选，步骤(2)所述白果粉粒径为20-50目。最优选为粒径30目。
作为优选，步骤(2)所述固态发酵培养基的装料量为7-11g/100mL三角瓶。最优选为固态发酵培养基的装料量为10g/100mL容器。
作为优选，步骤(2)所述的无机盐为硫酸镁和磷酸二氢钾，添加量均为每10g白果粉添加0.3-0.7g，最优选为每10g的白果粉中添加0.4硫酸镁、0.5g磷酸二氢钾。添加方式为将无机盐溶于去离子水中配成无机盐溶液添加，通常可采用100mL容器中加入5mL无机盐混合溶液。
作为优选，步骤(2)所述固态培养基的初始pH为4.0-6.0。最优选为培养基初始pH为5.0。
作为优选，步骤(3)所述加入无菌去离子水调节初始水分含量为使固态发酵培养基中的最终水分含量占培养基总质量的40-60％。最优选为培养基总质量的50％。
作为优选，步骤(3)所述接种的接种量为每10g白果粉接种1-5mL孢子悬液，孢子悬液的浓度为5.0×108cfu/mL。最优选为每10g白果粉接种4mL孢子悬液。
作为优选，步骤(3)所述恒温恒湿环境为温度25-32℃、湿度65-95％。最优选为温度28℃、湿度85％。
作为优选，步骤(3)所述隔天补加无菌去离子水为从发酵开始每间隔1天补加0-5mL。最优选为从发酵开始每间隔1天补加3mL。
作为优选，步骤(3)所述发酵时间为1-7天。最优选为发酵3天。
本发明所述的冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法所制备的冠突散囊菌固态发酵白果粉。
本发明所述的的冠突散囊菌固态发酵白果粉在制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的保健食品或药品的原料或配料中的应用。
本发明以白果粉作为发酵基质，利用冠突散囊菌作为发酵菌种，经固态发酵制备白果粉真菌发酵产品。一方面，利用冠突散囊菌菌体内强大的酶系统，在发酵过程中有效地降解银杏酚酸、MPN，实现低银杏酚酸、MPN白果粉发酵产品制备。另一方面，冠突散囊菌发酵过程中会分泌很多功能性次级代谢产物，因此，通过冠突散囊菌发酵有望制备保健功能更加强大的白果粉产品，有望深化白果深加工产业链，增加白果附加值，丰富白果深加工产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点
(1)本发明冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法，在冠突散囊菌固态发酵过程中，将白果粉中的大分子营养物质如蛋白质、淀粉、脂肪等分解为更容易被消化吸收的小分子物质如多肽、氨基酸、寡糖、单糖、脂肪酸等，同时产生香气成分使得白果粉的感官性状得到了提升，发酵白果粉有淡淡清香。
(2)本发明冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法，白果粉中的功能性成分银杏黄酮和银杏萜内酯得到较好的保存，但是通过固态发酵，银杏酚酸和MPN得到降解，白果粉的安全性得到提升。
(3)本发明冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法，发酵白果粉中冠突散囊菌孢子数达到了7.2×109cfu/g，含有多糖、洛伐他汀和丰富的游离氨基酸，同时含有α-淀粉酶和蛋白酶两种消化酶，发酵白果粉具有抗氧化能力和降血脂功能。
(4)通过该方法制得的冠突散囊菌固态发酵白果粉可用作制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤功能的保健食品或药品的原料或配料，丰富白果的产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
附图说明
图1为白果粉粒径对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图2为装料量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图3为初始含水量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图4为不同无机盐对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图5为硫酸镁添加量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图6为磷酸二氢钾添加量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图7为初始pH值对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图8为接种量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图9为补水量对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图10为发酵时间对冠突散囊菌孢子数的影响关系图；
图11为发酵过程中多糖含量的变化示意图；
图12为发酵过程中洛伐他汀含量的变化示意图；
图13为发酵过程中总抗氧化能力的变化示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
主要试剂与药品：
白果(大佛指)购于江苏泰兴，冠突散囊菌(Eurotium cristatum CICC 2650)为南京林业大学轻工与食品学院发酵工程实验室保藏(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，也可以采用常规的其它冠突散囊菌。主要试剂与药品均由市售可得。
本发明各实施例中冠突散囊菌的活化和孢子悬液的制备：
活化分离：将在4℃冰箱中保存的菌种取出，在无菌操作台上，划线接种于PDA平面培养基上，28℃，相对湿度85％，恒温恒湿培养。培养3天后，用接种针挑取单菌落，再在PDA平面培养基上进一步划线培养，如此重复2～3次。
孢子悬液的制备：将在PDA平面培养基上生长的冠突散囊菌孢子用接种针刮下，移入含有玻璃珠的无菌水中，在28℃、200rpm振荡60min打散孢子团，用血球计数板进行孢子计数，调节浓度，使得孢子悬液的浓度为5.0×108cfu/mL(实施例中均以此浓度孢子悬液接种)。
孢子数的测定：
固态发酵培养基中孢子数的测定：向培养到需要时间的三角瓶中加适量的无菌水将培养基全部洗出，转移至匀浆机中，最后总体积定容为200mL。用匀浆机将培养基搅拌均匀。将所得匀浆液稀释100倍后，通过血球计数板进行计数。
实施例1
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为5.0×108cfu/mL；
(2)将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，筛分后取粒径30目的白果粉10g装于100mL的三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合溶液，将5mL该无机盐溶液加入三角瓶中的白果粉中，使最终的培养基质中含0.4g硫酸镁、0.5g磷酸二氢钾，调整pH为5.0，八层纱布封口，115℃灭菌20min备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的固态培养基中接种步骤(1)制备的冠突散囊菌孢子悬液，按每10g白果粉接种4mL，再加入适量的无菌水，使培养基质的含水量为50％，封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，第2天补加无菌水3mL，共发酵3天，得到冠突散囊菌固态发酵白果粉。
实施例2
(1)将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为5.0×108cfu/mL；
(2)将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，筛分后取粒径20目的白果粉7g装于100mL的三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合溶液，将5mL该无机盐溶液加入三角瓶中的白果粉中，使最终的培养基质中按10g白果粉计算含0.3g硫酸镁、0.3g磷酸二氢钾，调整pH为4.0，八层纱布封口，115℃灭菌20min备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的固态培养基中接种步骤(1)制备的冠突散囊菌孢子悬液，按每10g白果粉计算接种1mL，再加入适量的无菌水，使培养基质的含水量为40％，封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，第2天补加无菌水1mL，共发酵2天，得到冠突散囊菌固态发酵白果粉。
实施例3
(1)将保存的冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为5.0×108cfu/mL；
(2)将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，筛分后取粒径50目的白果粉11g装于100mL的三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合溶液，将5mL该无机盐溶液加入三角瓶中的白果粉中，使最终的培养基质中按10g白果粉计算含0.7g硫酸镁、0.7g磷酸二氢钾，调整pH为6.0，八层纱布封口，115℃灭菌20min备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的固态培养基中接种步骤(1)制备的冠突散囊菌孢子悬液，按每10g白果粉接种5mL，再加入适量的无菌水，使培养基质的含水量为60％，封口，在25℃，相对湿度95％的恒温恒湿培养箱中培养，第2天和第4天各补加无菌水1mL，共发酵5天，得到冠突散囊菌固态发酵白果粉。
实施例4
(1)将保存的冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为5.0×108cfu/mL；
(2)将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，筛分后取粒径40目的白果粉8g装于100mL的三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合溶液，将5mL该无机盐溶液加入三角瓶中的白果粉中，使最终的培养基质中按10g白果粉计算含0.5g硫酸镁、0.5g磷酸二氢钾，调整pH为6.0，八层纱布封口，115℃灭菌20min备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的固态培养基中接种步骤(1)制备的冠突散囊菌孢子悬液，按每10g白果粉接种3mL，再加入适量的无菌水，使培养基质的含水量为50％，封口，在32℃，相对湿度65％的恒温恒湿培养箱中培养，第2天不补加无菌水，共发酵3天，得到冠突散囊菌固态发酵白果粉。
实施例5
(1)将保存的冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液，孢子悬液的浓度为5.0×108cfu/mL；
(2)将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，筛分后取粒径30目的白果粉10g装于100mL的三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合溶液，将5mL该无机盐溶液加入三角瓶中的白果粉中，使最终的培养基质中按10g白果粉计算含0.5g硫酸镁、0.4g磷酸二氢钾，调整pH为5.0，八层纱布封口，115℃灭菌20min备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的固态培养基中接种步骤(1)制备的冠突散囊菌孢子悬液，按每10g白果粉接种3mL，再加入适量的无菌水，使培养基质的含水量为50％，封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，第2天不补加无菌水，第4天补加2mL无菌水，第6天补加5mL无菌水，共发酵7天，得到冠突散囊菌固态发酵白果粉。
实施例6
采用实施例1相同的发酵方法，不同之处在于发酵1天。
实施例7
采用实施例1相同的发酵方法，不同之处在于发酵7天，其中发酵第2天、第4天、第6天均补加无菌水3mL。
试验例1
白果粉粒径对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响。
将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，经筛分得粒径为20目、30目、40目、50目的白果粉，取各目数的白果粉9g装于100mL的三角瓶中，封口，115℃灭菌20min备用。在超净台中向每个三角瓶中接种3mL的孢子悬液，再加无菌去离子水，使培养基质含水量为50％，八层纱布封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，分别在1、3、5天取样计孢子数。
目数的不同即白果粉颗粒的大小不同导致颗粒的比表面积不同，比表面积的大小会影响菌体对营养物质的吸收。同时，不同目数的白果粉对水分的吸收和维持存在差别。以上原因都会对菌体的生长、孢子的形成产生影响。白果粉中的营养成分主要是淀粉，菌体在利用培养基的营养成分时，会分泌各种酶类，对营养物质进行分解和吸收。颗粒越小，其比表面积越大，比表面积的增加在一定程度上会增加与底物的接触。本试验例1对孢子数的影响，结果如图1所示。
如图1所示，在第1天，不同目数的白果粉的孢子数没有差别；在第3天时，不同目数的白果粉之间的孢子数出现差别，其中20目实验组与其他实验组有明显差别，30目、40目、50目3个实验组中，40目的孢子数最大，但与30目和50目之间的最大孢子数没有显著差别。因此，选用30目的白果粉进行下步发酵。根据实验结果，为达到最大孢子数选择30目的白果粉进行下步的实验优化。
试验例2
白果粉装料量对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响。
取30目的白果粉，分别称取7g、8g、9g、10g、11g于100mL三角瓶中，封口，115℃灭菌20min备用。在超净台中向每个三角瓶中接种3mL的孢子悬液，再加不同量的无菌去离子水，使培养基质含水量为50％，八层纱布封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，分别在1、3、5天取样计孢子数。
装料量的影响结果如图2所示，经过5天的发酵，不同装料量的孢子数出现较为明显的差别。在第1天时，各个实验组的孢子数没有差别；在第3天时，装料量为10g时的孢子数明显多于其他实验组，这种情况也出现在第5天的发酵中。从图2也可以看出发酵到第3天时，随着装料量的增加，孢子数先上升后下降，当装料量为10g时孢子数达到最大，这种情况同样出现在第5天的发酵中。由此可得，在一定的体积内，装料量的增加，菌体可利用的营养成分在增加，孢子数也随之增加。但随着装料量的增加，可利用的氧气在减少，而氧气是微生物生长过程中的一个至关重要的因素，主要体现在以下两点。首先，氧气影响生物呼吸链有关的能量代谢，从而影响微生物的生长；其次，氧气直接参与代谢产物的合成，当氧气含量不足时，相关的代谢产物不能正常合成。因此，当装料量过多时，导致三角瓶内的氧气含量不足，进而影响菌体的生长繁殖，孢子数因此减少。根据上述分析，选择10g的白果粉装料量进行下步实验优化。
试验例3
初始含水量对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响。
每个100mL三角瓶中加入10g、30目的白果粉，封口，115℃灭菌20min备用。在超净台中向每个三角瓶中接种3mL的孢子悬液，再加不同量的无菌去离子水，使培养基质含水量为40％、45％、50％、55％、60％，八层纱布封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，分别在1、3、5天取样计孢子数。
初始含水量影响结果由图3所示，在第1天时，各个实验组之间的孢子数没有差别；发酵到第3天时，随着初始含水量的上升，孢子数先上升后下降。当初始含水量为50％时，孢子数达到最大，且与初始含水量为40％、45％、60％实验组的孢子数有显著差别，但与初始含水量为55％实验组的孢子数没有显著差别。发酵到第5天时，各实验组的孢子数出现不同程度的下降。其中，初始含水量为50％实验组的孢子数下降最为明显，与第3天相比，减少约30％的孢子数。原因可能是在较适的生长情况下，菌体生长快速，营养物质消耗也快，在后期的发酵中，随着营养物质的消耗，有害产物的积累，导致菌体的凋亡相应提前。水在微生物的代谢活动中是不可缺少的，是微生物存在和繁殖的必要条件。首先水是一种最优良的溶剂，可保证几乎一切生化反应的正常进行；其次水能够持各种生物大分子结构的稳定性，同时参与一些重要的生化反应。但是随着固体培养基中含水量的增加，白果粉颗粒间的透气性变差，氧气和代谢废气的传递受阻，气体的交流不再流畅，氧气的供给不足。而氧气是影响微生物生长的主要因素之一，代谢废气的积累等原因使得菌体的生长受到抑制，菌体的凋亡速度大于繁殖速度，孢子数从而减少。为达到最大孢子数，选择50％的初始含水量选择进行下一步实验的优化。
试验例4
无机盐种类及含量对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响。
取10g、30目的白果粉装入100mL三角瓶中。配制不同浓度的氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锌溶液，各取5毫升加入三角瓶中的白果粉中，使培养基质中分别含0.5g氯化钙、0.5g硫酸镁、0.5g磷酸二氢钾、0.1g硫酸亚铁、0.2g硫酸锌，对照组加5毫升去离子水，封口，115℃灭菌20min备用。在超净台中向每个三角瓶中接种3mL的孢子悬液，再加无菌去离子水，使培养基质含水量为50％，八层纱布封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，分别在1、3、5天取样计孢子数。
无机盐种类影响结果由图4可知，在第1天时，各个实验组的孢子数没有差别，原因是菌种在接触到新鲜培养基中后，在刚开始一段时间内，菌体的代谢系统需要适应新环境，孢子数没有出现明显差别。在第3天时，实验组的孢子数出现差别。其中，硫酸镁和磷酸二氢钾实验组的孢子数与对照组(不含任何无机盐)相比都具有显著差别，且为促进孢子数增加的作用，钾离子能够稳定细胞内环境，磷酸盐能够调节培养基pH，同时也可为微生物的生长提供必要的磷元素。氯化钙和硫酸亚铁实验组的孢子数相对于对照组没有显著差别。硫酸锌与对照组相比较，对孢子数的产生具有抑制作用，锌元素是微生物重要的微量元素，是酶的激活剂。但不同的微生物在不同的培养状态下对其需求量不同。在第5天时，各实验组的孢子数相比于第3天开始减少。除了硫酸锌组，其他实验组的孢子数与对照组相比具有显著差别。可能在后期的发酵中，无机盐对于微生物的生长具有一定的维持作用。考虑达到最大孢子数的需要，选择对硫酸镁和磷酸二氢钾的添加量进行优化。
采用无机盐种类影响相同的实验方法，对硫酸镁和磷酸二氢钾的添加量进行优化，每10g白果粉中硫酸镁添加量分别为0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g；再在每10g白果粉中硫酸镁最优添加量下，考察磷酸二氢钾的添加量分别为0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g的情况。
硫酸镁添加量的影响结果如图5所示，在第1天时种子处于生长延滞期，为生长繁殖合成相关的酶类，因此孢子数在该时期没有显著差别。在第3天时，孢子数随着硫酸镁添加量的增加先上升后下降，当添加量为0.4g时孢子数达到最大，与添加量为0.3g、0.6g、0.7g有显著差别，但与添加量为0.5g没有显著差别。其他实验组间的孢子数都具有显著差别。在第5天时的孢子数与第3天类似，不同处是硫酸镁添加量为0.3g和0.7g时没有显著性差别，0.4g、0.5g、0.6g实验组间的孢子数没有显著差别。对于本实验而言，硫酸镁的添加量在0.4～0.6g范围内对孢子数的增加具有促进作用，在0.6～0.7g具有抑制作用。考虑到达到最大孢子数的同时节约药品，因此每10g白果粉硫酸镁的添加量为0.4g。
在每10g白果粉硫酸镁的添加量为0.4g情况下，磷酸二氢钾添加量的影响结果如图6所示，在第1天时，各实验组的孢子数没有显著差别；在第3天时，孢子数随着磷酸二氢钾添加量的增加，先上升后下降。当磷酸二氢钾的添加量在0.3～0.5g时，孢子数随着磷酸二氢钾含量的增加而增加，当磷酸二氢钾的添加量在0.5～0.7g时，孢子数随着磷酸二氢钾含量的增加而降低，磷酸二氢钾的添加量为0.5g时，孢子数达到最大。磷酸二氢钾添加量为0.4g和0.7g时孢子数没有显著差别，其他实验组间的孢子数都具有显著差别。在第5天时，各实验组的孢子数出现下降，当磷酸二氢钾添加量为0.4g时的孢子数与其他实验组的孢子数具有显著差别，随着发酵的进行，高添加量的磷酸二氢钾实验组之间的孢子数减少较少且有接近的趋势，是在发酵后期高添加量的磷酸二氢钾调节生存环境的能力更好。磷酸二氢钾在微生物的培养中是一种优良的无机盐，可为微生物同时提供2种需求量最大的元素，钾离子能够联合钠离子维持细胞内的渗透压，对菌体的正常新陈代谢具有重要意义，磷酸根离子能够调节培养基中的酸碱平衡，使培养基内的处于一个较为适宜的水平，同时也能够为菌体的生长提供磷元素。为获得最大的孢子数，10g的白果粉中磷酸二氢钾添加量为0.5g。
试验例5
初始pH对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响。
取10g、30目的白果粉装入100mL三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合无机盐溶液，各取5mL加入三角瓶中的白果粉中，使培养基质中含0.4g硫酸镁和0.5g磷酸二氢钾，将培养基的初始pH分别调节为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，封口，115℃灭菌20min备用。在超净台中向每个三角瓶中接种3mL的孢子悬液，再加无菌去离子水，使最终培养基质含水量为50％，八层纱布封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，分别在1、3、5天取样计孢子数。pH是影响微生物生长的主要外界因素之一，正常存活的微生物细胞内的pH是相当稳定的，但是pH还是会对细胞产生各种影响，会对营养物质的离化程度产生影响，从而影响微生物对营养的吸收利用；影响环境中有害物质形成，以及影响菌体各种酶的活性等。
由图7所示，在第1天，实验组间的孢子数没有显著差别，此时的菌种处于延滞期。在第3天，孢子数随着pH的上升先增大后减小，在pH＝5时孢子数达到最大。pH在4至5范围时，孢子数随着pH的增大而增大；pH在5至6时孢子数随着pH的增大大而减小。pH＝5时的孢子数与其他实验组的孢子数有显著差别；pH为5.5和6时，该两组的孢子数没有显著差别，与其他实验组具有明显差别。在第5天时，各实验组的孢子数开始减少，pH＝5的实验组的孢子数最大且与其他实验组的孢子数具有明显差别。以上可以看出，培养基的pH＝5时菌体处于一个较为适宜的酸碱范围内，孢子数相比于其他组数量更多。
试验例6
接种量对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响。
取10g、30目的白果粉装入100mL三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合无机盐溶液，取5mL加入三角瓶中的白果粉中，使培养基质中含0.4g硫酸镁和0.5g磷酸二氢钾，培养基的初始pH为5.0，封口，115℃灭菌20min备用。在超净台中向每个三角瓶中分别接种1mL、2mL、3mL、4mL和5mL的孢子悬液，再分别加入无菌去离子水，使最终培养基质含水量均为50％，八层纱布封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养，分别在1、3、5天取样计孢子数。
接种量的影响结果如图8所示，在第1天时，由于接种量的不同，致使在发酵最初阶段的孢子数出现差异。在第3天时，随着接种量的增加，孢子数也在增加，但接种量为4mL和5mL时，两实验组的孢子数没有显著差异，与其他实验组的孢子数存在显著差异。在第5天时，各实验组间的孢子数差异显著。对于本实验而言，接种量在一定范围内加大可以显著提高孢子数。但是随着接种量的加大，在一定的体积空间内的氧气不能满足细胞生长的需要，相关产物的合成受到影响。因此随着接种量的加大孢子数不会成线性增加，接种量为4mL时最合适。
试验例7
补水量对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响。
取10g、30目的白果粉装入100mL三角瓶中。配制硫酸镁、磷酸二氢钾混合无机盐溶液，取5mL加入三角瓶中的白果粉中，使培养基质中含0.4g硫酸镁和0.5g磷酸二氢钾，培养基的初始pH为5.0，封口，115℃灭菌20min备用。在超净台中向每个三角瓶中分别接种4mL的孢子悬液，再加无菌去离子水，使最终培养基质含水量为50％，八层纱布封口，在28℃，相对湿度85％的恒温恒湿培养箱中培养7天，在此期间分别于第2、4、6天分别补加无菌水0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，在1、3、5天取样计孢子数。
微生物在生长过程中，需要足够的水分以进行与生命活动相关的生物化学反应，而在固态发酵过程中，初始培养基的含水量是一定的，在培养过程中由于微生物的利用、水分的挥发作用会导致培养基含水量的下降，因此需要补水。补水的影响结果如图9所示，在前2天各实验组的孢子数差别不大；在第3天时，随着补水量的增加孢子数先增加后下降，补水量在0～3mL时，随着补水量的增加，孢子数随之增加，补水量在3～5mL时，随着补水量的增加，孢子数逐渐减少。第4天之后各实验组的孢子数开始减少。当补水量为3mL时，孢子数在第4天达到最大，因此隔天补水量为3mL，最佳发酵时间时3天。
试验例8
发酵时间对冠突散囊菌固态发酵白果粉孢子数的影响
采用上述试验例1-7确定的最佳培养基成分和培养条件(即实施例1的方法，发酵7天，在发酵第2天、第4天、第6天均补加无菌水3mL)，考察冠突散囊菌固态发酵白果粉的时间进程曲线。在7天的发酵过程中孢子数的变化如图10所示。孢子数在前2天变化较为平缓，此时的菌体处于生长繁殖期，孢子数产生较少。在3～4天时，菌体成熟，开始产生大量孢子，因此在该时期孢子数快速增加。在5～7天时孢子数缓慢减少，渐趋稳定，在该时期因为营养成分和生存环境的变化，致使菌体开始衰亡。第4天的孢子数在7天的发酵中数量最多，但与第3天相比，没有显著性差别，因此为获得最大的孢子数，同时节约时间成本，可在第3天收获。
试验例9
1、发酵过程中理化成分的测定
(1)多糖含量的测定
A、标准曲线的绘制：称取葡萄糖标准品10mg于250mL容量瓶中加水，定容，吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，各加入5％的苯酚1.0mL，浓硫酸5.0mL，摇匀冷却，室温放置20min后于490nm处测吸光值，以2.0mL蒸馏水按相同显色操作作为空白，横坐标为多糖含量，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线。
B、样品提取：称取发酵物2.0g置于250mL锥形瓶中，加水80mL左右，于沸水浴上加热2h，冷却至室温后于100mL的容量瓶中，定容，3000rpm，离心5min，取上清液供沉淀多糖。
C、沉淀粗多糖：准确吸取上述上清液2.0mL加18mL无水乙醇，混匀，于4℃冰箱静置4h，以5000rpm离心5min，弃去上清液。沉淀用80％(体积分数)乙醇溶液洗涤数次，离心、弃上清液，反复操作3～4次。残渣用水溶解并定容至10.0mL，混匀后，为样品处理液。
D、样品测定：取1mL样品处理液于25mL的比色管中，加入1mL 50g/L的苯酚，混匀，加入浓硫酸5mL，摇匀冷却，室温放置20min，于490nm处测吸光值。
E、结果计算：按标准曲线中的公式，带入吸光值计算多糖含量。
(2)洛伐他汀含量的测定
A、洛伐他汀标准曲线的绘制：
精密称取2mg洛伐他汀标准品于10mL的容量瓶中，用色谱甲醇溶液定容，超声处理10min使之完全溶解，配制成浓度为0.2mg/mL的标准溶液。分别量取标准溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL的稀释溶液。吸取上述稀释溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤注入小瓶中待用，以洛伐他汀浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制洛伐他汀标准曲线。
B、固体发酵物中洛伐他汀的提取：发酵产物在40℃烘干，磨粉。称取0.5g粉溶于3mL甲醇中，超声处理20min，40℃水浴过夜，4000rpm离心10min。上清过0.22μm膜，待测。
C、洛伐他汀的测定：色谱条件为C18色谱柱(型号为：SinoChrom ODS-BP5μm,4.6mm×250mm)，流动相为甲醇∶水＝80∶20(v/v)，检测波长为238nm，流速1.0mL/min，进样量20μL。
(3)总抗氧化能力的测定
总抗氧化能力的测定按照总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(比色法)的说明进行操作，具体操作如下。
样品提取：准确称取固态发酵物1g，按重量(g)∶体积(mL)＝1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10％的匀浆，超声粉碎机处理5min。2500rpm，离心10min，取上清液待测。测定：按下表进行
表1.总抗氧化能力测定操作表
Figure BDA0001845512670000131
Figure BDA0001845512670000141
单位定义及计算公式：
定义：在37℃时，每分钟每毫升反应液使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。
计算公式：
总抗氧化能力(单位/每毫升试样)＝(测定OD值-对照OD值)×10/3×(反应液总量/取样量)×稀释倍数
2、发酵前后主要物质成分的测定
(1)脂肪含量的测定
参照GB 5009-2016，索氏提取法测定，具体操作如下。
试样处理：称取混匀后的试样(包括发酵前和发酵后)称量10g，准确至0.001g，置于蒸发皿中，蒸干后，在电热鼓风干燥箱中干燥，取出，研细，全部移入滤纸并包好。抽提：将滤纸放入索氏抽提器内，连接实验仪器，加入石油醚至瓶内容积的三分之二处，85℃水浴加热7h。
称量：取下接收瓶，回收石油醚，待接收瓶内溶剂剩余1～2mL时在水浴上蒸干，再于100±5℃干燥1h，放干燥器内冷却30min后称量。重复以上操作直至恒重(直至两次称量的差不超过2mg)。
结果分析：脂肪含量按下式计算
X＝(m1-m0)/m2×100
式中，
X———试样中脂肪的含量，单位为克每百克(g/100g)；
m1———恒重后接收瓶和脂肪的含量，单位为克(g)；
m0———接收瓶的质量，单位为克(g)；
m2———试样的质量，单位为克(g)；
100———换算系数。
计算结果表示到小数点后一位。
(2)氨基酸种类的测定
参照GB 5009.124-2016中的方法进行测定，具体步骤如下。
标准溶液配制：混合氨基酸标准储备液(1μmol/mL)：分别准确称取单个氨基酸标准品(精确至0.00001g)于同一个50mL烧杯中，用8.3mL 6mol/L盐酸溶液溶解，精确转移至250mL容量瓶中，用水定容，混匀。
混合氨基酸标准工作液(100nmol/mL)：准确吸取混合氨基酸标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，加0.2mol/L的pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至刻度，混匀，为标准氨基酸工作液。
分析步骤：
A、取样与水解：称取发酵物1.0g在水解管内加15mL 6mol/L盐酸溶液。继续向瓶内加入苯酚3滴。将安培瓶放入冷冻剂中，冷冻5min，然后充入氮气，在充氮气状态下封口。将已封口的安培瓶放在110±1℃的水解炉内，水解22h后，取出，冷却至室温。打开安培瓶，将水解液过滤至50mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一个50mL容量瓶内，定容，混匀。准确吸取1.0mL滤液至25mL试管内，40℃干燥，干燥后残留物用2mL水溶解，再干燥，最后蒸干。在试管中加入2.0mL pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液混匀，0.22μm滤膜过膜，为样品测定液，待用。
B、测定条件：使用混合氨基酸标准工作液注入氨基酸自动分析仪，色谱参考条件为：
色谱柱：磺酸型阳离子树脂，检测波长：570nm和440nm
C、试样的测定
将标准工作液和样品测定液以同体积注入分析仪器中，通过峰面积计算样品样品液中氨基酸的浓度。
(3)还原糖的测定
参照GB 5009.7-2016中的铁氰化钾法进行测定，具体操作如下。
试样制备：称取试样5g溶于40mL去离子水中，振荡提取后，8000rpm，离心10min。取上清，备用。
试样溶液的测定：
氧化过程：吸取试样5mL于50mL离心管中，再加入同体积碱性K3[Fe(CN)6]溶液，混合后立刻将离心管放入沸水中，20min后取出立即用冰水混合物迅速冷却。
滴定步骤：将氧化后的试样倒入100mL三角瓶中，再加入25mL乙酸盐溶液和5mL10％KI溶液，混匀，立刻用0.1mol/L Na2S2O3溶液进行滴定，再加1mL淀粉溶液，接着滴定直至溶液蓝色消失，记下消耗Na2S2O3溶液体积(V1)。
空白试验：吸取去离子水5mL，按上述步骤操作，记下消耗的Na2S2O3溶液体积(V0)。
结果分析：查表可得试样中还原糖的质量分数。所消耗K3[Fe(CN)6]溶液得体积(V3)按下式计算:
V3＝(V0-V1)×c/0.1
式中:
V3———氧化试样中还原糖所用0.1mol/L K3[Fe(CN)6]溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V0———滴定去离子水所用0.1mol/L Na2S2O3溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V1———滴定试样所用0.1mol/L Na2S2O3溶液的体积，单位为毫升(mL)；
c———所用Na2S2O3溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。
计算结果保留小数点后两位。
(4)总糖含量的测定
参照GB/T 15672-2009进行测定。具体操作如下。
取样：称取0.25g发酵物或白果粉原料于锥形瓶中，精确到0.001g。
水解：在锥形瓶中加入5mL水和15mL浓盐酸，装上冷流回流装置，置于100℃水浴中3h。冷却至室温后过滤，再用蒸馏水洗涤残渣，合并滤液及洗液，用水定容至250mL。此溶液为样品测试液。
标准曲线的绘制：葡萄糖标准液的配制：将葡萄糖105℃烘干至恒重，称取葡萄糖0.1g，用水溶解于1000mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，置于4℃冰箱保存，两周有效。吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的葡萄糖标准液置于10mL具塞试管用蒸馏水补至1.0mL，向试液中加入1.0mL的5％苯酚溶液，然后快速加入5mL的硫酸(与液面垂直，不与试管壁接触，使之与反应液充分混合)，然后将试管置于30℃水浴锅中反应20min，在490nm处测吸光值。绘制标准曲线。
测定：调整水解液浓度，使其吸光值在标准曲线范围内，按照绘制标准曲线的步骤测定试样液的吸光值。
结果计算：根据测定的吸光值，标准曲线计算出总糖含量。
(5)总黄酮含量测定
标准曲线的绘制：用芦丁标准品配制成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048、0.056、0.064、0.072mg/mL，各取0.5mL，加0.3mL5％亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL，放置6min，加入4％氢氧化钠溶液4mL，70％乙醇4.5mL，混合均匀后放置20min，在510nm波长处测吸光值。以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品制备：称取发酵物或白果粉原料1g，用70％的乙醇作为提取溶剂，料液比为1:10。加入搅拌转子，在油浴锅中70℃提取60min，提取2次。
测定：取0.5mL待测样品，加0.3mL 5％亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL，放置6min，加入4％氢氧化钠溶液4mL，70％乙醇4.5mL，混合均匀后放置20min，在510nm下检测以芦丁为标准品比对，结果表示为mg芦丁/mL提取物。
(6)萜内酯含量的测定
标准曲线的绘制：准确配置1.42mg/mL银杏内酯A标准溶液10mL，吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于25mL比色管中，各加70％乙醇溶液至1.0mL，然后加入0.4mL碱性羟胺溶液(13.9％盐酸羟胺水溶液+3.5mol/LNaOH溶液(1∶2)混合，现用现配)，反应5min后加入3mol/L HCI溶液0.4mL，6％FeCl3溶液0.2mL，混合均匀，再加入70％乙醇溶液5mL，摇匀后，517mn测吸光值。
试样制备：称取1g发酵物或白果粉原料，70％乙醇溶液作为提取溶剂，料液比为1:10。加入搅拌转子，70℃提取60min。
1.0mL待测样品，加入0.4mL碱性羟胺溶液(13.9％盐酸羟胺水溶液+3.5mol/LNaOH溶液(1:2)混合，现用现配)，反应5min后加入3mol/L HCI溶液0.4mL，6％FeCl3溶液0.2mL，混合均匀，再加入70％乙醇溶液5mL，摇匀后，517mn检测。
(7)α-淀粉酶活力测定
参照GB/T 5521-2008进行α-粉酶活力测定，具体步骤如下。
操作步骤：
分光光度计及其空白调整：2mL CaCl2溶液加到10mL碘稀液中，加入适量水V0稀释，混匀，20℃水浴保温20min，随后比色，使吸光度为0。
底物溶液的校准：吸取5.0mLβ-极限糊精溶液和15mL CaCl2溶液混匀。取2.0mL混合液，加入5倍体积碘稀液和适量水，混匀，置于20℃水浴中，保温20min，570nm处测吸光度，调整加水量使吸光值在0.55～0.60范围内。记下此时的加水量，并用它调整空白溶液的加水量。
α-淀粉酶的提取：取3g发酵物溶于30毫升去离子水中，充分振荡提取，5000rpm/min，离心10min，取上清，待用。
活性测定：α-淀粉酶提取液和β-极限糊精溶液30℃水浴10min，取5.0mLβ-极限糊精溶液和15.0mL酶提取液于三角瓶中，混匀，加液时，计录时间。吸取10.0mL稀碘液于各个50mL三角瓶中，加V0mL水，摇匀，20℃水浴，每5min进行下列操作：
a)吸取2.0mL混合液到一个盛有稀碘液和V0mL水的试管中，摇匀，20℃水浴。
b)测吸光值。
结果计算：试样中的α-淀粉酶活性按下式计算
A＝500×f×b
式中：
A——α-淀粉酶活性，以U计；
f——酶提取液的稀释倍数；
b——lgD对t曲线的斜率的绝对值；
500——系数
(8)蛋白酶活力测定
参照SB/T 10317-1999中的福林法进行蛋白酶活力测定，具体步骤如下。
标准曲线的绘制，按下表2：
表2.不同浓度的酪氨酸溶液
Figure BDA0001845512670000181
测定步骤：取6支比色管编号按表加入各试剂溶液。摇匀，40℃保温20min，在660nm处测吸光值。测三次，取平均值。以1号管为对照组。以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线。
样品液的制备：取3g发酵物溶于30毫升去离子水中，充分振荡提取，5000rpm，离心10min，取上清，待用。
样品测定：试管3支，编号1,2,3，每管内加入样品液1mL，其余步骤按国标中的方法进行操作。
计算：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生lμg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品酶活力单位＝A×4×N/10
A——由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；
4——4毫升反应液取出1mL测定(即4倍)；
N——酶液稀释的倍数；
(9)白果银杏毒MPN及其葡萄糖苷衍生物含量的测定
HPLC法测定，具体步骤如下。
检测条件的建立：
色谱柱：SinoChrom ODS-BP(5μm，10×150mm)。流动相A：含5mM戊烷磺酸钠的5mM磷酸钾溶液(pH2.5)，流动相B：乙腈。梯度洗脱：0min，流动相比例为A 96％，B 4％；0～10min，流动相比例为A 92％，B 8％；10～15min，流动相比例为A 90％，B 10％；15～20min，流动相比例为A 92％，B 8％；20～40min，流动相比例为A 96％，B 4％。柱温30℃；保留时间：40min。流速：1mL/min。检测条件：荧光发射波长395nm，激发波长295nm。
MPN标准曲线的建立：
准确称取0.02g MPN标准品，加入少量超纯水溶解后转移到100mL容量瓶中，再继续加超纯水定容到100mL，制备成0.2g/L MPN标准液。将标准液稀释成2mg/L，进样体积为：0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、100.0(单位：μL)，用HPLC检测各组浓度下的峰面积，根据峰面积与含量的线性关系，绘制标准曲线。
MPN葡萄糖苷衍生物(MPNG)标准曲线的建立：
将MPNG标品和MPN标品(2mg/L)1：1体积比混合，进样体积为：0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、100.0(单位：μL)，用HPLC检测各组浓度下的峰面积，根据峰面积与含量的线性关系，绘制出标准曲线。
样品制备：准确称取25mg试样(发酵前后)，置于5mL离心管中，加入2mL超纯水混匀，置于70℃水浴锅中提取30min，偶尔震荡。10000r/min，10min，离心2次。取上清液过0.45μm水系滤膜待液相检测。
(10)银杏酚酸含量的测定
采用RP-HPLC测定，以总银杏酚酸对照品定性，白果新酸对照品定量(外标法)，计算银杏酚酸含量。
检测条件的建立：
色谱柱：Agilent Zorbax XDB C 18 150mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇-1％冰醋酸溶液(90:10，v/v)；检测波长：310nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min
定量对照品溶液的制备(白果新酸)及标准曲线的绘制：
准确称取白果新酸对照品适量，用甲醇溶解、定容，配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL白果新酸标准溶液，摇匀，过0.45μm的有机滤膜，待测。用HPLC检测各浓度下的峰面积，根据峰面积与白果新酸含量的线性关系，绘制标准曲线。
总银杏酸定性对照品溶液的制备：
称取总银杏酸定性对照品适量，用甲醇溶解、定容，配制成0.2mg/mL总银杏酸定性对照品溶液，摇匀，过0.45μm的有机滤膜，待测。
样品处理及测定：称取发酵样品3g，石油醚为萃取剂，萃取温度75℃在回流装置中，回流6h。将含有待测银杏酸的石油醚旋转蒸发，用色谱甲醇溶解、定容，摇匀，过0.45μm的有机滤膜，待测。
(11)香气成分的测定
样品前处理：1g样品放入70℃的恒温水浴锅中，在顶空瓶中顶空吸附45min。萃取头解析3min，用气相色谱－质谱联用仪测定。
色谱条件：色谱柱为DB-5MS(30mm×0.25mm，0.25μm)；进样口温度250℃；升温程序：35℃保持3min，以10℃/min升至110℃，保持5min，再以5℃/min升至150℃，保持3min，最后以7℃/min升至230℃，保持5min；载气(He)：流速1.00mL/min，压力53.5kPa，进样口温度250℃，进样量1μL；进样口不分流。
质谱条件：离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离方式：EI+，电子能量70EV；检测器电压：1965V；扫描质量范围：20～400au。
(12)淀粉含量测定
参照GB 5009.9-2016进行淀粉含量的测定，具体步骤如下。
试样制备：称取2g试样(精确到0.001g)，剩余步骤按国标进行操作。
试样溶液测定：
吸取5.00mL碱性酒石酸铜甲液和同体积碱性酒石酸铜乙液，置于150mL三角瓶中，加水10mL，再加入比预测体积少1mL的试样溶液至三角瓶中，2min加热至沸腾，保持沸腾并以每2秒一滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。同法做3组平行，得出平均消耗体积。结果按式(1)计算。
试剂空白测定：按国标进行测定。
式(1)：X＝45×(A1-A2)/mv
式中：
X———试样中淀粉的含量,单位为克每百克(g/100g)；
45———系数；
A1———测定用试样中水解液葡萄糖质量，单位为毫克(mg)；
A2———试剂空白中葡萄糖质量，单位为毫克(mg)；
m———称取试样质量,单位为克(g)；
V———测定用试样水解液体积，单位为毫升(mL)；
(13)蛋白质含量的测定
参照GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法进行蛋白质的测定。
试样处理：称取充分混匀的固体试样1g，移入100mL定氮瓶中，加入0.4g CuSO4、6gK2SO4及20mL浓硫酸，摇匀后缓慢加热，碳化，无泡沫后，保持液体微沸，待液体是蓝绿色并清澈透明后，再加热60min。冷却后加入20mL蒸馏水，随后移入100mL容量瓶中，定容，混匀，备用。同时做试剂空白试验。
测定：向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入6粒小玻璃珠，加4滴甲基红乙醇溶液及3毫升硫酸，使水呈酸性，加热，使水保持沸腾。向接受瓶内加入10.0mL硼酸溶液及2滴混合指示剂吸取5.0mL试样液加入反应室中。将10.0mL NaOH溶液注入反应室中，并立即水封。夹紧，蒸馏10min。用少量水清洗冷凝管下端，取下蒸馏液接收瓶。快速用硫酸标准滴定溶液滴定至终点，用混合指示液，滴定至灰蓝色。同时做试剂空白。
结果计算：
X＝(V1-V2)×C×140×F/(m×V3)
式中:
X———试样中蛋白质的含量，单位为克每百克(g/100g)；
V1———试液消耗硫酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；
V2———试剂空白消耗硫酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；
c———硫酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
140———换算系数；
m———试样的质量，单位为克(g)；
V3———吸取消化液的体积，单位为毫升(mL)；
F———氮换算为蛋白质的系数。
试验例10
采用试验例9的各个检测方法，对试验例8(即实施例1方法)中发酵过程中(1-7天，其中发酵第2天、第4天、第6天均补加无菌水3mL)理化成分的测定，以及发酵前后主要物质成分的测定。
(1)粗多糖含量的测定
多糖含量的变化结果如图11所示，在7天的发酵过程中，总体趋势为先上升后下降。在第1～2天时多糖含量上升到最大值124mg/g，由于在前期菌体已分泌大量的各种酶类以对培养基的成分进行分解利用，因此经过一段时间的作用，培养基中的淀粉被水解，所以多糖含量也得到增加。其后，随着微生物生长繁殖的需要，各类营养成分不断被利用，多糖含量随之减少。在6～7天时多糖含量基本不变，其中第7天的多糖含量略高于第6天，此时的菌体已处于衰亡期，大量菌体死亡，真菌细胞壁的主要成分是多糖，因此多糖含量略有回升。
(2)洛伐他汀含量的测定
洛伐他汀在7天的发酵过程中含量的变化趋势如图12所示，在前2天，菌体在新鲜培养基中还处于适应期，在该时期菌种主要合成一些分解或催化有关底物的酶或辅酶。第3天时，经过一段时间的适应后，菌体大量繁殖，一些微生物已开始合成一些次级代谢产物。第4天时，洛伐他汀的含量达到最大，此时的菌体已处于稳定期，在该时期菌体通过复杂的次级代谢途径合成各种次级代谢产物，洛伐他汀的含量得以增加。第5天之后，菌体已处于衰亡期，培养基中的生长限制因子已耗尽，营养物的比例已失调，有害代谢产物不断积累，菌体的生长环境越来越差，细胞内的新陈代谢出现紊乱，分解代谢大于合成代谢，从而导致菌体大量死亡。洛伐他汀在衰亡期可能用作营养物质被利用，同时菌体的死亡也导致洛伐他丁的分泌量减少，因此洛伐他汀的含量不断降低。
(3)总抗氧化能力的测定
机体抗氧化防御体系有酶促和非酶促两个体系，在酶促体系中有各种酶类如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)，非酶促反应体系中主要是维生素、氨基酸和金属蛋白质。在发酵的初始阶段由于菌体为能适应新环境，需要合成相关的分解或催化有关底物的酶或辅酶，因此会消耗维生素和氨基酸等营养成分，从而使非酶促体系中的物质含量减少，对于机体的抗氧化体系而言，总抗氧化能力相对减弱。
如图13所示，从第2天后总抗氧化能力快速上升，在这一时期，菌体大量合成各类种酶类，用于生长繁殖的需要。在3～4天时菌体处于稳定期，开始合成各类次级代谢产物，使得总抗氧化能力进一步提高。从第5天起，由于菌体已处于衰亡期，菌体开始凋亡和自溶，前期又积累了大量有害物质，如酸、醇、毒素和H2O2等，使总抗氧化能力下降。
(4)香气成分的测定
发酵前后的风味物质是众多成分共同作用的结果，而不是仅靠某一种物质起作用。固态发酵前后，主要香气成分含量如表3所示。在发酵前共检测到香气成分物质40种。其中，烷烃24种(69.56％)、醇类6种(4.28％)、酮类1种(1.37％)、醛类6种(4.99％)、酯类1种(9.71％)、醚类1种(0.56％)和酸类1种(2.01％)。在发酵后共检测到香气成分物质共28种。其中，醇类6种(59.01％)、酮类1种(1.52％)、醛类3种(22.87％)、酯类3种(39.22％)、醚类2种(0.68％)、烷烃类14种(15.19％)、烯烃类3种(3.11％)。在发酵之后，烷烃类化合物含量减少，醇类、醛类和酯类化合物含量增加。可能的原因是烷烃类化合物作为能源被利用，经过微生物的作用转化成醇类、醛类和酯类化合物。
表3.发酵前后香气成分的变化
Figure BDA0001845512670000231
Figure BDA0001845512670000241
(5)氨基酸种类的测定
氨基酸是蛋白质的基本结构单位，是合成蛋白质的原料，是食品、饲料的重要营养成分，氨基酸对机体生长和组织更新有积极作用。在医学上具有重要作用，在一定程度上预防克山病、大骨节病的发生，能够防病治病，也可作为营养型化妆品的有效成分同时也是合成药物、表面活性剂、其他工业产品的原料。
由表4可知，总氨基酸含量上升了约2.37倍。其中，天冬氨酸减少了0.6倍，苏氨酸增加了1.22倍，丝氨酸增加了0.97倍，谷氨酸增加了4.56倍，甘氨酸增加了0.73倍，丙氨酸增加了4.11倍，半胱氨酸减少了0.02倍，缬氨酸增加了1.08倍，甲硫氨酸减少了0.32倍，异亮氨酸增加了0.62倍，亮氨酸减少了0.04倍，酪氨酸减少了0.35倍，组氨酸增加了0.32倍，赖氨酸增加了0.34倍，精氨酸增加了17.74倍，脯氨酸增加了6.98倍。其中，各类检测到的必需氨基酸含量除苏氨酸相对含量下降外(所占百分比上升)，其他必需氨基酸的相对含量都有不同程度的上升。
表4.发酵前后氨基酸种类的变化
Figure BDA0001845512670000251
(6)其他成分的测定
表5.其他营养成分含量变化
Figure BDA0001845512670000252
Figure BDA0001845512670000261
由表5可知，在发酵之后，总糖含量减少7.67％，淀粉含量减少6.38％，蛋白含量减少4.55％，脂肪含量减少6.06％，酚酸含量减少44.79％，总黄酮含量减少2.58％，萜内酯含量减少16.67％，还原糖含量减少9.17％，银杏毒含量减少3.86％，总游离氨基酸含量增加82.32％，蛋白酶活力为63U/g，α-淀粉酶活力为5.4U/g。由于菌体生长繁殖的需要，淀粉、蛋白、脂肪等营养成分的含量有不同程度的降低，但经过发酵之后总游离氨基酸含量上升，大分子转变为小分子后更利于机体对营养成分的吸收。
氨基酸是细胞生长、修复、维护和更新所需的重要营养物质，其含量的上升有利于菌体的生长。活性成分总黄酮和萜内酯的含量变化不大，黄酮类化合物具备多种生物活性和药理作用，如抗氧化、解毒消炎、抗癌、提高免疫力；银杏萜内酯能够抑制血小板聚集、保护神经元，发酵之后较好的保留了白果中的功能性成分。银杏酚酸和银杏毒下降显著，银杏酚酸具有致敏性、胚胎毒性及免疫毒性作用，两者含量的下降使得发酵物更加安全。同时增加了蛋白酶和α-淀粉酶，使得营养价值进一步提升。
综合上述各个试验例，本发明的冠突散囊菌在过30目白果粉10g、50％初始含水量、5％(w/w)硫酸镁、4％(w/w)磷酸二氢钾、初始pH5.0、接种量4mL(5.0×106cfu/mL)、隔天补水3mL、发酵时间为3天。孢子数能够达到最大值。
通过试验发现白果粉经冠突散囊菌固态发酵后，多糖含量、洛伐他汀含量、总抗氧化能力呈动态变化。其中，多糖含量先上升后下降，在发酵第2天达到最大值为124mg/g。洛伐他汀含量先上升后下降，在第4天达到最大值为54.1μg/g，在其后开始下降。总抗氧化能力同样是先上升后下降，不同点在于前2天的总抗氧化能力为0，在第4天总抗氧化能力达到最大为82单位/g。
对比发酵前后，总糖含量减少7.67％，淀粉含量减少6.38％，蛋白含量减少4.55％，脂肪含量减少6.06％，酚酸含量减少44.79％，总黄酮含量减少2.58％，萜内酯含量减少16.67％，还原糖含量减少9.17％，银杏毒含量减少3.86％，总游离氨基酸含量增加82.32％，蛋白酶活力为63U/g，α-淀粉酶活力为5.4U/g。

Claims (3)

1.一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将冠突散囊菌活化分离，并制备孢子悬液；
（2）将干燥后的白果去骨质中种皮、内种皮后，得白果果仁，磨成白果粉，添加无机盐，调节pH制备固态发酵培养基，封口灭菌后备用；
（3）在无菌条件下向步骤（2）制得的固态发酵培养基中接种步骤（1）制备的冠突散囊菌孢子悬液，并加入无菌去离子水，调节初始含水量，封口后置于恒温恒湿环境中培养，并隔天补加无菌去离子水维持固态发酵培养基含水量，发酵后得到冠突散囊菌固态发酵白果粉；
步骤（2）所述的无机盐为硫酸镁和磷酸二氢钾，添加量均为每10 g白果粉添加0.3-0.7g；白果粉粒径为20-50目；固态发酵培养基的装料量为7-11 g/100 mL容器；固态培养基的初始pH调节为4.0-6.0；
步骤（3）所述加入无菌去离子水调节初始水分含量为使固态发酵培养基中的最终水分含量占培养基总质量的40-60 %；所述接种的接种量为每10 g白果粉接种1-5 mL孢子悬液，孢子悬液的浓度为5.0×108 cfu/mL；所述恒温恒湿环境为温度25-32 ℃、湿度65-95 %，所述隔天补加无菌去离子水为从发酵开始每间隔1天补加0-5 mL，所述发酵时间为发酵1-7天。
2.一种权利要求1所述的冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法所制备的冠突散囊菌固态发酵白果粉。
3.一种权利要求2所述的冠突散囊菌固态发酵白果粉在制备具有调节血脂、调节免疫、抗氧化的保健食品或药品的原料中的应用。
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