CN114272327B - 一种石斛发酵制品及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石斛发酵制品及其制备方法与应用，所述方法包括以下步骤：采用包括金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨和蜂蜜在内的原料经红曲霉发酵即得。本申请方案通过各原料组分相互影响产生互补及增效的作用，制备的石斛发酵制品抗氧化成分含量高，且抗氧化活性高。
Description
技术领域
本发明属于发酵领域，具体涉及一种石斛发酵制品及其制备方法与应用。
背景技术
石斛是我国常用的著名传统中药材，历史上被奉为疗疾养生圣品，十分珍贵，与人参等齐名同价。石斛种类繁多，有金钗石斛、流苏石斛、铁皮石斛、霍山石斛、球花石斛等，其中最受关注的是铁皮石斛和金钗石斛。金钗石斛又叫扁黄草，是多年生草本植物，具有“软黄金”之称，主要生长在我国南部，如贵州、四川、广西、云南等地，其性微寒，具有滋阴清热、益胃生津而的功效，对口干舌燥、病后虚热等症状具有治疗效果。金钗石斛因适用范围广泛、食用历史久远以及获取方便而得到了广泛的关注，国内外学者们对其的研究集中在组织培养、种植栽培、化学组成、毒理作用、药理作用以及临床疗效的方面。
长期以来，石斛茎是研究的主体，其石斛花为非药用部位，目前也未被列入新食品原料，对于石斛鲜花的研究十分有限。而石斛鲜花作为石斛种植过程中的重要产物之一，花形俏丽、颜色鲜艳，具有较高的观赏价值，其内含有丰富的挥发性化合物，同时富含石斛碱、多糖、氨基酸、黄酮等多种有效成分，且花朵在形态、色泽等方面具有茎杆所不具备的市场开发优势。随着金钗石斛人工种植技术的推广，种植面积的不断加大，金钗石斛鲜花产量较高，石斛鲜花资源也很丰富，其花近年被开发成保健品石斛花茶。但是仍没有对金钗石斛花中的活性成分充分利用。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种石斛发酵制品，通过将金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨和蜂蜜进行发酵，协同增效，达到预料不到的抗氧化效果。
本发明还提出一种具有上述石斛发酵制品的制备方法。
本发明还提出一种具有上述石斛发酵制品的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种石斛发酵制品的制备方法，包括以下步骤：采用包括金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨和蜂蜜在内的原料经红曲霉发酵即得。
在本发明的一些实施方式中，所述金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨和蜂蜜的添加质量比为(1～8)：(1～4)：(1～3)：(1～4)：(1～3)：(1～4)：(1～2)。
在本发明的一些实施方式中，所述金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨和蜂蜜的添加质量比为(3～5)：(2～4)：(2～3)：(3～4)：(1～3)：(2～3)：(1～2)。
在本发明的一些实施方式中，所述培养基中还包括米粉、酵母膏和蛋白胨。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵的温度为25℃～28℃；进一步地，所述发酵的过程为：先进行震荡培养，再静置发酵；更进一步地，所述震荡培养的条件为180～210rpm，2～5d；更进一步地，所述后静置发酵的时间为5-8d。
在本发明的一些实施方式中，所述红曲霉在添加到有金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨和蜂蜜的培养基前先培养成发酵种子液。
在本发明的一些实施方式中，所述红曲霉为红曲霉菌液，所述红曲霉菌液的接种量为所述石斛培养基总体积的5％-16％。
本发明的一些实施方式中，所述红曲霉菌液中菌体浓度为4×106cfu/mL-6×106cfu/mL。
根据本发明的第二方面，提出了一种石斛发酵制品，所述石斛发酵制品采用上述制备方法制得。
根据本发明的第三方面，提出了一种上述石斛发酵制品的应用，所述应用为在制备抗氧化食品中的应用。
一种石斛茶，将石斛发酵制品与茶叶按照(1～3)：(5～8)的质量比混合制得。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备抗氧化药品中的应用。
一种石斛胶囊，将石斛发酵制品进行超微粉碎后制成。
一种石斛咀嚼片或含片，将石斛发酵制品进行超微粉碎后压片制得。
根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方法通过利用金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨及蜂蜜与红曲霉进行共同发酵培养，通过红曲霉将金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、黄芪、刺梨和红芪的有效成分进行吸收转化；然后静止一段时间，以使活性物质累积，培养得到的石斛发酵制品为固体状，颜色粉红到深红色，抗氧化成分含量高，且抗氧化活性高。本申请方案各原料组分相互影响产生互补及增效的作用，得到的石斛发酵制品具有显著的抗氧化效果。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明测试例中的多酚标准曲线图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明所用红曲霉为红曲霉(Monascus anka)菌株3.4577，购自中国普通微生物菌种保藏中心。
孢子悬液的制备：将市购的菌种用无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠和无菌水的无菌三角瓶中，充分振荡，得到孢子悬液。
种子液的制备：
(1)种子培养基：麦芽糖4g，蛋白胨9g，酵母膏4g，葡萄糖21g，加水定容至1000mL，pH自然。121℃灭菌20min，冷却待用。
(2)将孢子悬液按10％(v/v)接种于装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，30℃，180r/min振荡培养48～72h至菌体浓度为5×106cfu/mL，制备得到发酵种子液。
本申请方案所采用的金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪和刺梨均为市购所得。
实施例1
本实施例制备了一种石斛发酵制品，按照以下制备方法制备得到：
(1)原料预处理：分别称取干燥的金钗石斛花50份、铁皮石斛花35份、铁皮石斛25份、黄芪18份、刺梨25份和红芪40份，粉碎后过200目筛。
(2)将步骤(1)所得的预处理后的原料加入米粉100份，蛋白胨20份，酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜10份，得到发酵培养基。
(3)在发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀。在33℃下，180rpm振荡培养培养3天，转入25-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
实施例2
本实施例制备了一种石斛发酵制品，按照以下制备方法制备得到：
(1)原料预处理：分别称取干燥的金钗石斛花35份、铁皮石斛花50份、铁皮石斛30份、黄芪18份、刺梨25份和红芪40份，粉碎后过200目筛。
(2)将步骤(1)所得的预处理后的原料加入米粉100份，蛋白胨20份，酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜10份，得到发酵培养基。
(3)在发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀。在33℃下，180rpm振荡培养培养3天，转入25-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
实施例3
本实施例制备了一种石斛发酵制品，按照以下制备方法制备得到：
(1)原料预处理：分别称取干燥的金钗石斛花40份、铁皮石斛花40份、铁皮石斛25份、黄芪15份、刺梨20份和红芪45份，粉碎后过200目筛。
(2)将步骤(1)所得的预处理后的原料加入米粉100份，蛋白胨20份，酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜10份，得到发酵培养基。
(3)在发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀。在33℃下，180rpm振荡培养培养3天，转入25-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
实施例4
本实施例制备了一种石斛发酵制品，按照以下制备方法制备得到：
(1)原料预处理：分别称取干燥的金钗石斛花85份、铁皮石斛25份、黄芪18份、刺梨25份和红芪40份，粉碎后过200目筛。
(2)将步骤(1)所得的预处理后的原料加入米粉100份，蛋白胨20份，酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜10份，得到发酵培养基。
(3)在发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀。在33℃下，180rpm振荡培养培养3天，转入25-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
实施例5
本实施例制备了一种石斛发酵制品，按照以下制备方法制备得到：
(1)原料预处理：分别称取干燥的铁皮石斛花85份、铁皮石斛25份、黄芪18份、刺梨25份和红芪40份，粉碎后过200目筛。
(2)将步骤(1)所得的预处理后的原料加入米粉100份，蛋白胨20份，酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜10份，得到发酵培养基。
(3)在发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀。在33℃下，180rpm振荡培养培养3天，转入25-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
实施例6
本实施例制备了一种石斛发酵制品，按照以下制备方法制备得到：
(1)原料预处理：分别称取干燥的金钗石斛花50份、铁皮石斛花35份、黄芪18份、刺梨25份和红芪40份，粉碎后过200目筛。
(2)将步骤(1)所得的预处理后的原料加入米粉100份，蛋白胨20份，酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜10份，得到发酵培养基。
(3)在发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀。在33℃下，180rpm振荡培养培养3天，转入25-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
实施例7
本实施例制备了一种石斛发酵制品，按照以下制备方法制备得到：
(1)原料预处理：分别称取干燥的金钗石斛花50份、铁皮石斛花35份、铁皮石斛25份、黄芪18份、刺梨25份粉碎后过200目筛。
(2)将步骤(1)所得的预处理后的原料加入米粉100份，蛋白胨20份，酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜10份，得到发酵培养基。
(3)在发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀。在33℃下，180rpm振荡培养培养3天，转入25-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
对比例1
本对比例制备了一种石斛发酵制品，与实施例1的区别仅在于，发酵原料中不包括金钗石斛花和铁皮石斛花。
对比例2
本对比例制备了一种石斛发酵制品，与实施例1的区别仅在于，发酵原料中不包括黄芪。
对比例3
本对比例制备了一种石斛发酵制品，与实施例1的区别仅在于，发酵原料中不包括刺梨。
对比例4
本对比例制备了一种石斛发酵制品，与实施例1的区别仅在于，发酵原料中不包括刺梨和黄芪。
对比例5
本对比例制备了一种石斛发酵制品，与实施例1的区别仅在于，发酵原料中不包括蜂蜜。
对比例6
本对比例制备了一种发酵制品，与实施例1的区别仅在于，发酵原料中不包括金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、刺梨、黄芪和红芪。
试验例
1、莫纳可林K的含量测定
(1)样品制备
分别称取实施例1-7和对比例1-6制备的石斛发酵制品1g，加入70％乙醇40mL，超声细胞破碎提取3次，每次30min，合并滤液，浓缩定容至100mL为样品提取液。
(2)测试方法：将实施例1-7和对比例1-6的样品提取液过有机微孔滤膜，滤液经HPLC分析。具体分析条件为：紫外检测器的高效液相色谱系统，检测波长232nm，柱温30℃，C18色谱柱。所用的流动相为：A-pH2.5超纯水(磷酸调pH)，B-乙腈，流速为1.0mL/min，进样量10μL。检测条件：45％pH2.5超纯水，55％乙腈。分析时间为50min。
表1
实验结果如表1所示，从表中可以看出，本申请方案实施例1制备的石斛发酵制品的莫纳可林K的含量明显更高。
2、多酚含量测定
(1)样品制备
分别称取实施例1-7和对比例1-6制备的石斛发酵制品1g，加入70％乙醇40mL，超声细胞破碎提取3次，每次30min，合并滤液，浓缩定容至100mL为样品提取液。
(2)标准曲线的制备
准确称取0.1g没食子酸，用蒸馏水配制得到质量浓度为1000mg/L的没食子酸标准储备液，分别取标准储备液0、1.25、2.5、5、10、20、40mL于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配制质量浓度为0、12.5、25、50、100、200和400mg/L的系列标准溶液。检测方法与待测样品的一致，以吸光度(y)为纵坐标，溶液中没食子酸浓度(x)为横坐标，进行回归分析，得出的标准曲线如图1所示，y＝0.003x+0.078，相关系数R2＝0.996，含量以没食子酸当量计，单位mg/g。
(2)样品测定与计算：
稀释后的样品(125μL)加入0.5mL蒸馏水和125μL福林酚试剂，静置6min后加入1.25mL Na2CO3(m：v7％)溶液和1.0mL蒸馏水，振荡充分混匀，室温下暗室(避光)反应90min后，用紫外可见分光光度计测定其760nm吸光度。每个样品进行3次重复，求平均值，根据所得吸光值，在标准曲线上求得相应浓度，其值越大，抗氧化活性越强。
表2
| 组别 | 总酚含量(μg/g) |
| 实施例1 | 465 |
| 实施例2 | 424 |
| 实施例3 | 435 |
| 实施例4 | 452 |
| 实施例5 | 426 |
| 实施例6 | 398 |
| 实施例7 | 355 |
| 对比例1 | 346 |
| 对比例2 | 432 |
| 对比例3 | 436 |
| 对比例4 | 405 |
| 对比例5 | 354 |
| 对比例6 | 324 |
实验结果如表2所示，从表中可以看出，将红曲霉在添加有金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛和红芪的培养基发酵培养后，多酚含量大幅提升。
3、抗氧化活性测定
采用ABTS自由基清除实验、DPPH自由基清除实验，对石斛发酵制品提取物的抗氧化活性进行分析。
(1)样品制备
分别称取实施例1-7制备的石斛发酵制品1g，加入70％乙醇40mL，超声提取3次，每次30min，合并滤液，浓缩定容至100mL为样品提取液。
1)ABTS自由基清除实验
将2.5mL的ABTS(7mmol/L)和44μL的K2S2O8(140mmol/L)溶液充分混合，在室温、避光条件下静置过夜(12h-16h)，得到ABTS+储备液。将ABTS+储备液用PBS缓冲液(20mmol/L，pH值为7.4)稀释，用紫外分光光度计测量，使其在波长734nm处的吸光度值为0.700±0.002，得到ABTS+工作液。取30μL样品提取液与3.0mL ABTS+工作液混合，充分反应6min，常温条件下在波长734nm处测定吸光度值。计算公式为：
清除率＝(A空白-A对照品)/A空白×100％
式中：A空白为3.0mL ABTS+工作液加30μL甲醇，测得的吸光度值；A对照品为30μL VC溶液与3.0mL ABTS+工作液反应6min后，测得的吸光度值；检测样品时，将A对照品换成A样品即可。得到的结果如表4所示。
同时，同样的方法测定金钗石斛汁以及不添加金钗石斛的发酵液与金钗石斛汁1:1(v/v)的混合物中的ABTS自由基清除率。结果如表4所示。
表4ABTS自由基清除率
从表4可以看出，将红曲霉在添加有金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛和红芪的培养基发酵培养后，红曲霉将有效活性成分进行了转化利用，ABTS自由基清除率明显提升。
2)DPPH自由基清除实验
取lmL DPPH(0.1mmol/L，乙醇为溶剂)，0.95mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH值为7.4)，1mL乙醇和50μL样品混合30min后在波长517nm处常温条件下测定吸光度值，吸光度值越小，其对自由基的清除能力越强。计算公式为：
清除率(％)＝(A空白组-A对照品)/A空白×l00％
式中：A空白指以50μL甲醇代替样品测得的吸光度值；A对照品指50μL VC与DPPH反应2min后测得的吸光度值；检测样品时，将A对照品换成A样品即可。
同时，同样的方法测定金钗石斛汁以及不添加金钗石斛的发酵液与金钗石斛汁1:1(v/v)的混合物中的DPPH自由基清除率。结果如表5所示。
表5DPPH自由基清除率
| 组别 | DPPH自由基清除率(％) |
| 实施例1 | 42.51 |
| 实施例2 | 38.45 |
| 实施例3 | 39.69 |
| 实施例4 | 40.47 |
| 实施例5 | 35.14 |
| 实施例6 | 29.31 |
| 实施例7 | 27.37 |
从表5可以看出，将红曲霉在添加有金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛和红芪，培养基发酵培养后，红曲霉将其中的有效活性成分进行了转化利用，DPPH自由基清除率显著提升，达到了预料不到的抗氧化效果。
(3)脂质过氧化抑制实验
使用10％鸡蛋黄匀浆液(体积分数)作为反应的脂质媒介。取0.1mL待测样品提取液同0.5mL鸡蛋黄匀浆液、0.4mL纯水及50μL硫酸亚铁溶液(FeSO4·7H2O，70mmol/L)混合，于37℃下孵育30min，迅速加入1.5mL乙酸溶液(20％，体积分数，PH为3.5)及1.5mL硫代巴比妥酸溶液(0.8％，质量浓度，用1.1％十二烷基硫酸钠溶液配制)，高速混匀后于95℃下水浴60min。待反应物冷却至室温后，再加入5mL正丁醇，充分摇匀，混合物在5000r/min下离心15min，取上清液测定其在532nm处的吸光度，纯水做空白对照。计算公式为：
脂质过氧化抑制率(％)＝(1-实验组吸光度/空白组吸光度)×100％。
表6
| 组别 | 脂质过氧化抑制率(％) |
| 实施例1 | 87.76 |
| 实施例2 | 81.84 |
| 实施例3 | 82.78 |
| 实施例3 | 84.46 |
| 实施例4 | 76.34 |
| 实施例5 | 64.21 |
| 实施例6 | 58.37 |
实验结果如表6所示，从表中可以看出，本发明方案通过金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、刺梨、黄芪和红芪的配比，再通过红曲霉发酵将其中的有效活性成分进行了转化利用，脂质过氧化抑制率非常显著的提升。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (5)
1.一种石斛发酵制品的制备方法，其特征在于，先将红曲霉培养成发酵种子液，再将红曲霉发酵种子液在添加有金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨、蜂蜜的培养基中发酵即得，所述金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、红芪、黄芪、刺梨和蜂蜜的添加质量比为(3～5)：(2～4)：(2～3)：(3～4)：(1～3)：(2～3)：(1～2)。
2.根据权利要求1所述的一种石斛发酵制品的制备方法，其特征在于，所述红曲霉在培养基中的发酵过程，包括以下步骤：
（1）原料预处理：分别称取干燥的金钗石斛花、铁皮石斛花、铁皮石斛、黄芪、刺梨和红芪，粉碎后过200目筛；
（2）向步骤(1)所得的预处理后的原料中加入米粉100份、蛋白胨20份和酵母膏10份混合，搅拌均匀，调节含水量到40％，装入发酵瓶，厚度不超过5cm，置于121℃下，灭菌30分钟，冷却至室温，加入经巴氏杀菌的蜂蜜，得到发酵培养基；
（3）在所述发酵培养基中加入制备的发酵种子液，接种量为发酵培养基总体积的10％，摇匀；在33℃下，180rpm振荡培养3天，转入25℃-27℃静置培养7天后，倒出物料干燥得到石斛发酵制品。
3.根据权利要求1或2所述的一种石斛发酵制品的制备方法，其特征在于，所述发酵种子液的制备方法为：
（1）种子培养基：称取麦芽糖4g、蛋白胨9g、酵母膏4g和葡萄糖21g，加水定容至1000mL，121℃灭菌20min，冷却待用；
（2）将红曲霉孢子悬液按体积百分比10％接种于装有200mL所述种子培养基的500mL摇瓶中，30℃，180r/min振荡培养48～72h至菌体浓度为5×106cfu/mL，制备得到发酵种子液。
4.一种石斛发酵制品，其特征在于，所述石斛发酵制品采用权利要求1-3任一项所述的制备方法制得。
5.如权利要求4所述的石斛发酵制品在制备抗氧化食品或药品中的应用。
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