CN102250170A

CN102250170A - 黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN102250170A
Application number: CN2011101297098A
Authority: CN
Inventors: 袁珂; 廖海兵; 殷明文; 林晓春
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-05-19
Also published as: CN102250170B

Abstract

黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法及其用途,属于提取分离技术领域。以黄秋葵果实为原料，采用渗漉提取、闪蒸浓缩、萃取脱色、醇沉转移出多糖及果胶，继续真空浓缩、通过大孔吸附树脂柱分离富集、再结合凝胶树脂柱色谱技术从中分离得到5,7,3′,4′-四羟基-4′′-O-甲基-3-O-β-D-葡萄糖黄酮苷和5,7,3′,4′-四羟基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷两个单体化合物，提取率分别为3.62％~8.66%和8.01％～12.98%，纯度均达到95％以上。本发明工艺简单、生产成本低，制得的两个黄酮苷具有很好抗氧化及抑菌活性。

Description

黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于提取分离技术领域，具体为黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法及其用途。

背景技术

黄秋葵为锦葵科秋葵属植物，在我国南北方地区均有栽培。黄秋葵被许多国家定为运动员的首选蔬菜及老年人的保健食物，在美国和日本等国家被称为“植物伟哥”及“绿色人参”，是一种具有较高营养价值的优良的食疗保健蔬菜。

黄秋葵中含有黄酮、多糖、果胶、微量元素、氨基酸等多种功效成分，具有抗疲劳、增强人体免疫力，保肝强肾，抗衰老、降低血糖、帮助消化、清火明目、健胃润肠等方面的作用。黄秋葵因其良好的功能和保健作用越来越受到人们的喜爱。对黄秋葵进行深加工可以提高其附加值。但黄秋葵果实的采收具有一定的季节性，嫩果作为保健蔬菜存在保质期短，不便长期保存的弊端。因此需要将黄秋葵嫩果进行精深加工、以提高其附加值及资源利用率。

黄秋葵果实中含有大量的黄酮类成分，已知黄酮类化合物是一类存在于植物界的重要的生物活性物质，据研究报道，它不仅能作为防治心脑血管疾病的药物，而且有明显的抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基，降血脂、降低胆固醇、降血糖，抗癌防癌、免疫调节等生理活性，是一种在人类的营养、健康和防治疾病方面有着广阔应用前景的药物，也是应用广泛的天然抗氧剂和防腐剂，可用于保健食品和化妆品，因此具有很好的开发应用价值。目前未见有对黄秋葵果实进行其黄酮苷类化合物的分离鉴定及生物活性研究的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法及其用途的技术方案，具有工艺操作简单、生产成本低、收得率及纯度高，无污染、易于产业化生产等优点，制得的两个黄酮苷具有很好抗氧化及抑菌活性，适合用做中药化学对照品、医药原料，也可用做保健品、食品添加剂等。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）原料的处理：取黄秋葵嫩果，以横段面切片后晒干或风干，备用；

2）渗漉提取：将干燥的片状黄秋葵果实装入渗漉筒中，用折合黄秋葵干燥果实1～2倍量的40％～70％含水乙醇浸润4~6小时后装入渗漉桶中，用折合黄秋葵干燥果实10～18倍量的50％～70％含水乙醇进行渗漉提取，调节流速，以8~15 mL/min流速收集渗漉提取液；

3）闪蒸浓缩：将渗漉提取液在水浴温度60～70℃，真空度为0.090 Mpa～0.095 Mpa的条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，调节待浓缩液的进液速度，以150～350 mL · min^-1的流量反复浓缩，得到折合每毫升浓缩液含0.5～1.0克原药材的浓缩液；

4）脱色除杂处理：将浓缩液用石油醚萃取脱色除杂3～4次，每次用量为浓缩液与石油醚的体积比为1:1～1:3，将石油醚萃取液合并后进行真空浓缩，回收石油醚，萃取脱色后得到的浓缩液备用；

5）醇沉转移出多糖与果胶：在上述浓缩液中加入95％的工业酒精调整至浓缩液中乙醇浓度达到70％～80％，放置过夜，析出多糖与果胶沉淀，将沉淀物转移出去另行利用，得到除糖后的浓缩液；

6）继续真空浓缩：得到除糖后的浓缩液继续在50℃以下真空闪蒸浓缩，得到折合每毫升浓缩液含1.5～2.0克原药材的浓缩液；

7）大孔树脂分离富集：得到的浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离富集，然后先用H₂O洗脱，再依次用10%～70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%~60%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液，将合并的洗脱液在50℃以下真空闪蒸浓缩，得到洗脱浓缩液；

8）凝胶树脂分离纯化：将上述合并的洗脱浓缩液继续通过Toyopearl HW-40柱色谱，以H₂O、20% 含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇、70%丙酮梯度洗脱；

9）步骤8）中20% 含水甲醇或含水乙醇洗脱部位减压浓缩干燥后，溶于少量水后通过MCI gel CHP-20 P柱色谱，以H₂O及不同浓度的含水甲醇或含水乙醇梯度洗脱，TLC检识，相同流分合并，得化合物2的浅黄色结晶；

10）步骤8）中40% 含水甲醇或含水乙醇部位通过Sephadex LH-20柱色谱，以水及不同浓度的含水甲醇梯度洗脱，TLC检识，相同流分合并，得化合物1的的浅黄色粗品。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于所述的化合物1为5,7,3′,4′-四羟基-4′′-O -甲基-3-O-β-D-葡萄糖黄酮苷，其结构式为：

。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于所述的化合物2为5,7,3′,4′-四羟基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→6)]-β-D-葡萄糖黄酮苷，其结构式为：

。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤2）中：浸润所用的含水乙醇浓度为45％～65％，优选50％～60％；渗漉提取时所用的含水乙醇浓度为55％～65％，优选58％～60％；渗漉提取时流速为10~14mL/min，优选11~12 mL/min。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤3）中：进液速度为200～300 mL · min^-1，220～260 mL · min^-1。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤4）中：浓缩液与石油醚的体积比为1:1～1:2。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水甲醇或含水乙醇、20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水甲醇或含水乙醇、25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用15%含水甲醇或含水乙醇、30%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、55%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并15%含水甲醇或含水乙醇、30%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。

所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷在制备防治抗氧化试验、抑菌制剂中的应用。

上述黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，具有如下有益效果：黄秋葵果实原料来源丰富、价廉易得，制备工艺简单，加工制备的成本低、收得率及纯度高；制备工艺中用不到有毒溶剂、无环境污染，具有经济安全、绿色环保、易于产业化生产的特点；提取后采用石油醚萃取脱色处理，排除了色素对后续分离纯化的干扰，采用醇沉法处理，避免了提取物中大量多糖和果胶的干扰；得到的单体化合物收率较高，化合物5,7,3′,4′-四羟基-4′′-O -甲基-3-O-β-D-葡萄糖黄酮苷的提取率为3.62％~8.66%，化合物5,7,3′,4′-四羟基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷的提取率为8.01％～12.98%，纯度均达到95％以上；制备的单体化合物具有显著的抗氧化及抑菌活性，具有很好的开发应用前景，可用作中药化学对照品、医药原料、保健品、食品添加剂等。

本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，均指重量百分含量。

附图说明

图1为化合物1的¹H NMR(400 MHz) 图谱；

图2为化合物1的¹³C NMR(100 MHz) 图谱；

图3为化合物1的 DEPT图谱；

图4为化合物1的HSQC 图谱；

图5为化合物1的HMBC图谱；

图6为化合物2的¹H NMR(400 MHz) 图谱；

图7为化合物2的¹³C NMR(100 MHz) 图谱；

图8为化合物2的 DEPT图谱；

图9为化合物2的 ¹H-¹H COSY图谱；

图10为化合物2的HSQC 图谱；

图11为化合物2的HMBC图谱。

具体实施方式

现结合本发明的实施例和相关试验，对本发明作进一步说明。

实施例1

2）渗漉提取：将干燥的片状黄秋葵果实装入渗漉筒中，用折合黄秋葵干燥果实1～2倍量的70％含水乙醇浸润5小时后装入渗漉桶中，用折合黄秋葵干燥果实14倍量的70％含水乙醇进行渗漉提取，调节流速，以10 mL/min流速收集渗漉提取液；

3）闪蒸浓缩：将渗漉提取液在水浴温度65℃，真空度为0.095 Mpa的条件下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，调节待浓缩液的进液速度，以250 mL · min^-1的流量反复浓缩，得到折合每毫升浓缩液含0.5～1.0克原药材的浓缩液；

4）脱色除杂处理：将浓缩液用石油醚萃取脱色除杂3次，每次用量为浓缩液与石油醚的体积比为1:2，将石油醚萃取液合并后进行真空浓缩，回收石油醚，萃取脱色后得到的浓缩液备用；

5）醇沉转移出多糖与果胶：在上述浓缩液中加入95％的工业酒精调整至浓缩液中乙醇浓度达到75％，放置过夜，析出多糖与果胶沉淀，将沉淀物转移出去另行利用，得到除糖后的浓缩液；

6）继续真空浓缩：得到除糖后的浓缩液继续在50℃以下真空闪蒸浓缩，得到折合每毫升浓缩液含2.0克原药材的浓缩液；

7）大孔树脂分离富集：得到的浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离富集，然后先用H₂O洗脱，再依次用10%含水甲醇或含水乙醇、20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液，将合并的洗脱液在50℃以下真空闪蒸浓缩，得到洗脱浓缩液；其中用H₂O洗脱继续除去水溶性杂质；最后用70%丙酮洗脱除掉全部杂质，再生大孔吸附树脂；

上述步骤2）中：浸润4小时、6小时，浸润所用的含水乙醇浓度为45％、65％、50％、60％；渗漉提取时所用的含水乙醇浓度为55％、65％、58％、60％；渗漉提取时流速为8 mL/min、14mL/min、11 mL/min、12 mL/min。用折合黄秋葵干燥果实10、11、13、15、16、18倍量含水乙醇进行渗漉提取。步骤3）中：水浴温度60℃、70℃，真空度为0.090 Mpa，进液速度为200 mL/min、300 mL · min^-1、220 mL/min、260 mL · min^-1、350mL · min^-1。步骤4）中：浓缩液与石油醚的体积比为1:1、1:3。步骤5）中在上述浓缩液中加入95％的工业酒精调整至浓缩液中乙醇浓度达到70％、80％。步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用15%含水甲醇或含水乙醇、25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用15%含水甲醇或含水乙醇、25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。步骤同实施例1，也可以取得本发明所述的有益效果。

所述的“用折合黄秋葵干燥果实1～2倍量的40％～70％含水乙醇”意思是指：若黄秋葵干燥果实重量为1kg则40％～70％含水乙醇的用量为1～2升；所述的“用折合黄秋葵干燥果实10～18倍量的50％～70％含水乙醇” 意思是指：若黄秋葵干燥果实重量为1kg则50％～70％含水乙醇的用量为10～18升。

所述的真空薄膜浓缩装置为自行设计组装，所有部件均可从市场上直接购得，具体的组装结构也已经公开过。所述的Diaion HP-20大孔吸附树脂由日本三菱公司生产，可直接购得。所述的Toyopearl HW-40、MCI gel CHP-20 P柱色谱填料由日本三菱公司生产，可直接购得。所述的Sephadex LH-20（葡聚糖凝胶）柱色谱填料为Parmacia Bioteck 产品，可直接购得。

本发明进行TLC检识的条件：薄层板为0.5％CMC-Na－硅胶GF₂₅₄板，展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水，显色剂a：紫外灯（254 nm）下观察荧光；显色剂b：2％FeCl₃-2%K₃Fe(CN)₆ 喷洒，105℃烘烤至显色，显色剂c：自然光观察，黄酮类化合物自身显淡黄色。

结构鉴定：主要利用光谱技术，包括核磁共振谱(¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC)和质谱分析（ESI-MS）鉴定化合物1和2的结构。

化合物1：分子式为：C₂₂H₂₂O₁₂，ESI-MS m/z 479[M+H]⁺，浅黄色结晶，遇三氯化铁-铁氰化钾试剂显蓝色，与盐酸-镁粉试剂反应显粉红色，Molish反应显阳性。通过光谱技术确定化合物1为5,7,3′,4′-四羟基-4′′-O -甲基-3-O-β-D-葡萄糖黄酮苷。其¹H NMR(400 MHz)、¹³C NMR(100 MHz)数据见表1。

化合物 2：分子式为：C₂₇H₃₀O₁₇，ESI-MS m/z 625[M-H]^-，浅黄色无定型粉末，遇三氯化铁-铁氰化钾试剂显蓝色，与盐酸-镁粉试剂反应显粉红色，Molish反应显阳性。通过光谱技术，并与文献数据对照，确定化合物2为5,7,3′,4′-四羟基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷。其¹H NMR(400 MHz)、¹³C NMR(100 MHz)数据见表1。

表1 化合物1和2的¹³C-NMR与¹H-NMR光谱数据(MeOH-d₄, TMS, δ ppm , J, Hz)

经过高效液相色谱峰面积归一化法标定纯度，两种单体化合物的含量均在95％以上，经含量测定，原料中化合物5,7,3′,4′-四羟基-4′′-O -甲基-3-O-β-D-葡萄糖黄酮苷的提取率为3.62％~8.66%，化合物5,7,3′,4′-四羟基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷的提取率为8.01％～12.98%。

图1-11中符号说明如下：ESI-MS为电喷雾电离质谱；¹H-NMR为核磁共振氢谱；¹³C-NMR为核磁共振碳谱；DEPT为无畸变极化转移增强法；¹H-¹H COSY为二维氢氢相关谱，HSQC为二维碳氢直接相关谱；HMBC为二维碳氢远程相关谱；δ为化学位移，单位为ppm；J为偶合常数，单位为Hz；TMS 为内标物；MeOH-d₄为氘代甲醇；Molish试剂为浓硫酸-2％的α-萘酚的乙醇溶液。

为进一步说明本发明在医药及食品领域中的作用，下面通过部分抗氧化及抑菌试验来加以说明。

1、抗氧化试验

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH ) 是一种稳定的有机自由基, 通过检测生物试剂对DPPH 自由基的清除能力可以体现其抗氧化性的强弱。近年来，国内外学者利用DPPH 溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定，并被证明是一种灵敏、简单易行的有效方法。本试验采用DPPH分光光度法用以评价本发明得到的两个黄酮苷单体的抗氧化能力。

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在溶液中可生成具有典型紫色的稳定溶液，其孤对电子在517 nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清除剂存在时，由于清除剂与DPPH孤对电子配对而使其在517nm处的吸光度减小，使溶液的典型紫色变浅，其吸光度的变化与其所接受的电子成定量关系。即吸光度越小，自由基清除剂清除自由基的能力越强，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性，因而可用分光光度法进行定量分析。在200μL不同浓度的样品溶液中分别加入100 μL的DPPH乙醇溶液，24℃混匀放置20分钟后，用酶标仪测定517nm处的吸光度，用下面的公式计算DPPH 自由基清除率：Scavenging %= 1- (Ap-Ac) /Amax ×100%。式中，Ap为200μL的DPPH溶液和100μL待测液的吸光度，Ac为200μL待测液和100μL70%乙醇的吸光度，Amax为100μLDPPH溶液和200μL70%乙醇的吸光度。

供试样品测定过程中用Trolox作阳性对照，并以此换算出被测供试样品总的抗氧化能力。测定结果表示为达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox浓度。IC₅₀值是一个常用于评价抗氧化能力的参数，它是指抗氧化剂清除50%的DPPH自由基时所需的浓度。其值越小，表示达到50%清除率时，所用的自由基清除剂的浓度剂量越小，其自由基清除效果也就越好，对应的参试样品抗氧化活性越强。

（1）实验条件：Tecan Infinite M200酶标仪；UV-2102 PCS紫外可见分光光度计；101-3电热鼓风恒温干燥箱；KQ-250B型超声波清洗器；旋转蒸发仪；DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基自由基）；酶标板为96微孔板，其他试剂均为分析纯。

（2）DPPH溶液、Trolox阳性对照溶液及供试品溶液的配制：DPPH溶液的配制：准确称取DPPH试剂11.83 mg，用70%乙醇溶解，并定量转入100 mL容量瓶中，用70 %乙醇定容，摇匀得质量浓度为118.3 μg · mL^-1 的DPPH 贮备液，置于冰箱中冷藏备用,实验前适当稀释DPPH·溶液。

称取Trolox对照品21.45 mg，用70%乙醇溶解于100 mL的量瓶中，定容至刻度后得到浓度为0.1056 mg · mL ^-1 的Trolox 阳性对照溶液。取适量Trolox 阳性对照溶液，逐级稀释成浓度为0.00212、0.006336、0.01056、0.014784、0.019008 mg · mL ^-1的梯度溶液。

供试品溶液的制备：分别精确称取通过本发明方法提取纯化得到的两个黄酮苷单体136 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中。然后分别取1 mL，2 mL，3 mL，4 mL用70%乙醇定容于5 mL量瓶中，配置成不同浓度的供试品溶液，将得到的供试品溶液置于4℃冰箱中保存待用。

（3）测定方法与测定结果：用点样用移液枪在96孔酶标板中分别加入不同浓度的供试品溶液200 μL和DPPH试液100 μL。样品加入后震荡30s， 28℃保温20 min后，用Infinite M 200酶标仪在517 nm波长下测定其吸光值(Ap)，同时测定不加DPPH的样品空白吸光值 (Ac) 和加DPPH但不加样品的吸光值(Amax)。用Trolox作阳性对照，以Trolox (X)浓度为横坐标，以测得的自由基清除率(Y)为纵坐标绘制标准曲线，结果表明Trolox溶液浓度在 0.002112～0.019008 mg · mL^-1 范围内与其对DPPH· 的清除率呈良好的线性关系，y=0.1023x+0.0845，r=0.9939。样品抗氧化能力用TEAC表示。TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)，即每克抗氧化物质的自由基清除能力相当于Trolox的自由基清除能力的微摩尔数，依此来评价被测物质的总抗氧化能力。

取适量待测供试品溶液，按标准曲线制备项下操作，测定供试品溶液在510 nm下的吸光度，计算供试品溶液对DPPH· 自由基的清除率及TEAC值。

计算结果供试样品化合物1对DPPH清除率的TEAC值为207.5318 mg Trolox /g DW；供试样品化合物2对DPPH清除率的TEAC值为234.7465 mg Trolox /g DW

实验结果表明，供试样品化合物1和2对DPPH自由基具有一定的清除率，且清除率随供试样品溶液浓度的增大而提高。表明本发明制备的两个黄酮苷单体对DPPH自由基的清除率均较高，即两者均具有较强的抗氧化活性，且在配制浓度范围内随浓度升高抗氧化能力增强。

2、抑菌试验

抑菌活性的测定采用琼脂扩散滤纸片法，根据抑菌环直径判断抑菌能力。滤纸片直径6.0 mm，灭菌干燥后备用。每个样品做3 次重复实验，数据采用SPSS1010进行分析，组间比较采用t 检验。

（1）供试样品溶液的配制：分别称取一定量由本发明制备的黄酮苷单体，平行称取3份，加蒸馏水定容至容量瓶中，然后依次稀释为不同浓度的水溶液，并以消毒蒸馏水做空白对照。

（2）菌种活化与灭菌处理：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌冷藏菌种分别接入2支营养琼脂斜面培养基活化，28℃培养24 h。培养基、其他实验所用器材和试剂均在120℃下湿热高压灭菌2 h。

（3）供试菌株悬液与含菌平板的制备：将盛有无菌水的试管排在试管架上，将预先进行过斜面活化的2个菌种各挑出两环，分别溶解在无菌水试管中，制成菌株悬液，稀释菌液，使含菌体为10⁷-10⁸ cfu·l^-1 , 即得菌株悬液。再将融化的灭菌培养基倾入无菌培养皿中，待凝固后滴入0.1 ml 菌悬液，用无菌涂布环将菌悬液涂布均匀即成含菌平板，待用。

（4）抑菌实验及抑菌圈的测定：抑菌圈测量是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂培养基内成球形立体状扩散，抑制试验菌的繁殖，在抑菌物质的周围形成的透明圈。将无菌小滤纸片高温蒸汽灭菌干燥后备用。用无菌移液管吸取各种菌悬液加入无菌培养皿中，用镊子夹取浸透样品溶液的滤纸片，将其放在培养基表面。将放好滤纸片的含菌培养皿分别在恒温箱中培养，到时取出，测量并记录形成的抑菌环的直径。每组实验重复3次，实验结果取平均值。

（4）最小抑菌浓度(MIC)测定结果：MIC的测定采用二倍稀释法。将不同浓度的样品溶液分别用移液管移入各个平皿内，倒入已经高温灭菌的培养基中充分混匀，冷却凝固后，每皿中加入菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀进行培养。取出，观察结果，以不长菌的溶液浓度做为最低抑菌浓度MIC，结果见下表。

样品的抑菌试验结果

该试验结果表明，供试样品的水溶液对供试菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有较强的抑制作用,且随浓度的增加抑菌效果增强。在相同浓度条件下供试样品对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显大于大肠杆菌，该试验结果表明本发明制备的两个黄酮苷单体均具有一定的抑菌活性。

以上试验结果表明，由黄秋葵果实中分离得到的2个黄酮苷单体具有一定的抗氧化及抑菌作用，因此在医药及食品行业可用作中药化学对照品、医药原料，也可用做保健品、食品添加剂等。

Claims

1.黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于所述的化合物1为5,7,3′,4′-四羟基-4′′-O -甲基-3-O-β-D-葡萄糖黄酮苷，其结构式为：

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3.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于所述的化合物2为5,7,3′,4′-四羟基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→6)]-β-D-葡萄糖黄酮苷，其结构式为：

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4.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤2）中：浸润所用的含水乙醇浓度为45％～65％，优选50％～60％；渗漉提取时所用的含水乙醇浓度为55％～65％，优选58％～60％；渗漉提取时流速为10~14mL/min，优选11~12 mL/min。

5.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤3）中：进液速度为200～300 mL · min^-1，220～260 mL · min^-1。

6.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤4）中：浓缩液与石油醚的体积比为1:1～1:2。

7.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水甲醇或含水乙醇、20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。

8.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水甲醇或含水乙醇、25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。

9.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法，其特征在于步骤7）中：先用H₂O洗脱，再依次用15%含水甲醇或含水乙醇、30%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、55%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并15%含水甲醇或含水乙醇、30%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脱液。

10.如权利要求1所述的黄秋葵果实中两个活性黄酮苷在制备防治抗氧化试验、抑菌制剂中的应用。