CN101508711B

CN101508711B - 从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法

Info

Publication number: CN101508711B
Application number: CN2009100969673A
Authority: CN
Inventors: 袁珂; 薛月芹
Original assignee: Zhejiang Forestry College
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2029-03-26
Also published as: CN101508711A

Abstract

从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，属于中药技术领域。所采取的技术方案是：以含羞草为原料，采用超声提取、浓缩后醇沉除杂、再浓缩后大孔吸附树脂柱色谱分离富集、再结合凝胶树脂柱色谱技术、硅胶柱色谱技术从中分离得到牡荆苷、荭草苷、异荭草苷3个单体化合物，三者的提取率分别为1.12％、2.62％和2.21％，纯度均达到95％以上。该方法具有操作简单、成本低、纯度好、收率高、大孔树脂和溶剂可反复回收使用、工艺中不用有毒溶剂、无环境污染、易于产业化生产等优点。

Description

从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体为从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法。

背景技术

含羞草为豆科(Leguminosae)含羞草属植物含羞草(Mimosa pudica)的全草，又名知羞草、怕羞草等，主要分布在我国华东、华南、西南等地的山坡丛林、湿地、路旁，在海南多有分布。含羞草具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛、凉血止血之功效，临床多用于急性肝炎、神经衰弱、失眠、肺结核咳血、血尿、带状疱疹等症。含羞草中主要含有黄酮类、酚酸类等成分，在含羞草的较多成分中尤以牡荆苷、荭草苷、异荭草苷的含量较高且活性突出，三种化合物均属于黄酮苷类。研究表明，以上黄酮苷具有抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基、降低血脂及血胆固醇、抗菌消炎、抗病毒、增强免疫功能等多方面的作用。

从含羞草中提取分离上述黄酮苷单体的方法一般是采用一定浓度的含水乙醇进行渗漉提取，得到的提取液经减压浓缩，活性炭脱色，再浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取，然后将乙酸乙酯及正丁醇萃取部位再通过大孔吸附树脂Diaion HP-20柱色谱、Toyopearl HW-40、MCI-Gel CHP-20、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、硅胶柱色谱等反复柱色谱分离纯化后得到，且在提取分离工艺过程中常要用到乙酸乙酯或正丁醇、甲醇、氯仿等有毒溶剂。传统的从中草药中提取纯化牡荆苷、荭草苷、异荭草苷的方法也多是采用醇提取、有机溶剂多次萃取、柱色谱分离或制备、半制备高效液相色谱分离、高速逆流色谱分离制备得到。以上方法均存在操作步骤繁多，工艺复杂、时间长，效率低，设备要求较高，溶剂用量大、价格高且毒性较强，操作安全性低，生产成本较高等缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种操作步骤简单的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法的技术方案，其成本较低、分离效率高、不用有毒溶剂，无环境污染。

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)原料处理：将含羞草全草粉碎成粗粉，过20～40目筛；

2)提取：将含羞草粗粉放入提取容器中，并将其置入超声波提取器中，在50～60℃的条件下每次用6～8倍量的40％～60％含水乙醇做溶剂超声提取2～3次，每次30～60min，抽滤，合并滤液；

3)减压浓缩：将步骤2)的滤液在水浴温度60℃以下真空薄膜浓缩至滤液无醇味，回收乙醇，得到浓缩液；

4)醇沉除杂：在步骤3)的浓缩液中加入等体积的乙醇，搅拌后放置过夜，析出多糖等水溶性杂质沉淀，抽滤，除去沉淀物，滤液备用；

5)减压浓缩：将步骤4)的滤液继续在60℃以下真空薄膜浓缩，得到浓缩液；

6)大孔树脂纯化：将步骤5)的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，先用H₂O洗脱，再依次用10％～70％的含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为5～15mL·min^-1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20～60％含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在60℃以下真空浓缩成膏状物；

7)凝胶柱色谱分离：将步骤6)的膏状物通过凝胶柱色谱分离，先用H₂O洗脱，再依次用10％～70％的含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为3～5mL·min^-1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并30～50％含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在60℃以下真空浓缩成膏状物；

8)硅胶柱色谱分离：将步骤7)的膏状物通过硅胶柱色谱分离，以体积比6∶2∶1～7∶2∶3的乙酸乙酯-乙醇-水进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，通过TLC检识，合并相同流分，分别得到牡荆苷、荭草苷及异荭草苷单体。

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤2)中：超声提取的时间为40～50min。

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤6)中：依次用10％、20％、40％、60％、70％的含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为6～12mL·min^-1，优选8～10mL·min^-1。

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤6)中：所述的大孔吸附树脂为Diaion HP-20大孔吸附树脂，色谱柱的径高比为1∶10～15，优选1∶10～12

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤7)中：依次用10％、30％、50％、70％的含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为4～5mL·min^-1。

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤7)中：所述的凝胶为Toyopearl HW-40凝胶，色谱柱的径高比为1∶15～18，优选1∶16～17。

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤8)中：以体积比6∶2∶1、7∶2∶2、7∶2∶3的乙酸乙酯-乙醇-水进行梯度洗脱。

所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤8)中：硅胶为160-200目。

上述从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，有操作简单、成本低、纯度好、收率高、大孔树脂和溶剂可反复回收使用、工艺中不用有毒溶剂、无环境污染、易于产业化生产等优点，从中分离得到牡荆苷、荭草苷、异荭草苷3个单体化合物，三者的提取率分别为1.12％、2.62％和2.21％，纯度均达到95％以上，适合做药用化学对照品、医药原料，也可制成各种制剂用做保健品、食品添加剂等。本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，液体的百分含量为体积比，固体的百分含量为重量比。

具体实施方式

现结合本发明的实施例和活性试验，进一步说明本发明的有益效果。

本发明的方法是：1)原料处理：将含羞草全草粉碎成粗粉，过20-40目筛；2)提取：将含羞草粗粉放入提取容器中，并将其置入超声波提取器中，在50～60℃的条件下每次用6～8倍量40％～60％的含水乙醇做溶剂超声提取2～3次，每次30～60min，抽滤，合并滤液。3)减压浓缩：将步骤2)的滤液在水浴温度60℃以下真空薄膜浓缩至滤液无醇味，回收乙醇，得到浓缩液，浓度折合含1mL浓缩液/每g药材粗粉；4)醇沉除杂：在步骤3)的浓缩液中加入等体积的乙醇，搅拌后放置过夜，析出多糖等水溶性杂质沉淀，抽滤，除去沉淀物，滤液备用；5)减压浓缩：将步骤4)的滤液继续在60℃以下真空薄膜浓缩，得到浓缩液，浓度折合含1mL浓缩液/每g药材粗粉；6)大孔树脂纯化：将步骤5)的浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1∶10～15，先用H₂0洗脱，再依次用10％含水乙醇、20％含水乙醇、40％含水乙醇、60％含水乙醇、70％含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为5～15mL·min^-1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20～60％含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在60℃以下真空浓缩成膏状物；7)凝胶柱色谱分离：将步骤6)的膏状物通过Toyopearl HW-40凝胶柱色谱分离，色谱柱的径高比为1∶15～18，先用H₂O洗脱，再依次用10％含水乙醇、30％含水乙醇、50％含水乙醇、70％含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为3～5mL·min^-1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并30～50％含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在60℃以下真空浓缩成膏状物；8)硅胶柱色谱分离：将步骤7)的膏状物通过160-200目硅胶柱色谱分离，以体积比6∶2∶1、7∶2∶2、7∶2∶3的乙酸乙酯-乙醇-水进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，每份20mL，通过TLC检识，合并相同流分，分别得到淡黄色的牡荆苷、荭草苷及异荭草苷单体。

上述步骤2)中：超声提取的时间为35min、40min、45min、55min；步骤6)中：色谱柱的径高比为1∶12、1∶14，依次用35％、45％、55％、65％的含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为6mL·min^-1、8mL·min^-1、10mL·min^-1、12mL·min^-1，合并25～55％含水乙醇各部位的洗脱液；步骤7)中：色谱柱的径高比为1∶16、1∶17，依次用15％含水乙醇、20％含水乙醇、25％含水乙醇、35％含水乙醇、45％含水乙醇、55％含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为4mL·min^-1、6mL·min^-1，合并35～55％含水乙醇各部位的洗脱液；其它步骤与上述实施例相同，均能取得相同的技术效果。

上述步骤2)中含羞草粗粉每次用6～8倍量的含水乙醇做溶剂的意思是：若含羞草粗粉为1kg，则溶剂用量为6～8升。步骤3)、5)中含1mL浓缩液/每g药材粗粉的意思是：浓缩液的浓缩程度由含羞草粗粉重量来决定，若含羞草粗粉为1g，则浓缩液体积为1毫升。

通过本发明方法分离制得的牡荆苷收率达1.12％左右，荭草苷收率达2.62％左右，异荭草苷收率达2.21％左右；三者含量均在95％以上。

以上进行TLC检识的条件：薄层板为0.3％CMC-Na-硅胶GF₂₅₄板，展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水(7∶2∶3)，显色剂：(1)5％茴香醛-硫酸溶液喷洒，105℃烘烤2～5分钟；(2)紫外灯(254nm)下观察荧光；(3)2％FeCl₃-2％K₃Fe(CN)₆喷洒，105℃烘烤2～5分钟(4)自然光观察，黄酮类化合物自身显淡黄色(4)在碘缸中通过碘熏后观察。

通过本发明方法分离制得的牡荆苷、荭草苷及异荭草苷单体化合物，经核磁共振光谱鉴定并与参考文献对照，波谱数据一致，且在薄层板上与对照品进行TLC检识对照均显示同一斑点，Rf值相同，混合熔点测定不下降。经过高效液相色谱峰面积归一化法标定纯度，三者含量均在95％以上。由该方法分离纯化的黄酮苷单体，具有操作简单、成本低、纯度好、收率高、大孔树脂和溶剂可反复回收使用、无环境污染、易于产业化生产等优点，适合做药用化学对照品、医药原料，也可制成各种制剂用做保健品、食品添加剂等。

本试验中所用到的对照品牡荆苷、荭草苷、异荭草苷均采用上述方法制备，经纯化后通过光谱技术鉴定结构，并经高效液相色谱峰面积归一化法标定纯度均大于98％。以高效液相进行定量测定所用的色谱条件：色谱柱为Waters XBridge C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.05％冰醋酸(35∶65)流速为1.0mL·min^-1；柱温为25℃；灵敏度为0.2AUFS；检测波长为340nm。

下面通过部分活性试验说明通过本发明方法分离制得的牡荆苷、荭草苷及异荭草苷单体在医药领域中的作用。

1、抑菌活性试验结果：

(1)溶液的配制：分别称取10mg分离得到的牡荆苷、荭草苷、异荭草苷单体，加蒸馏水定容至5mL容量瓶中得质量浓度为2.0mg·mL^-1的水溶液，依次稀释为浓度分别为1000、500、200、100、50μg·mL^-1的样品溶液，以消毒蒸馏水做空白对照。供细菌实验用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

(2)材料的灭菌及菌种的活化：将实验所需的培养皿及其他器材置160℃烘箱中灭菌3h；培养基及试管置高压蒸汽灭菌锅中灭菌3h备用。将所有供试的菌种移接入相应的试管斜面培养基上，每种重复接2支，置37℃恒温培养箱内培养24h后，置0℃～4℃冰箱中冷藏。

(3)抑菌实验：采用琼脂扩散平板滤纸片法进行抑菌活性测定，根据抑菌环直径大小判断抑菌能力。滤纸片直径6.0mm，灭菌干燥后备用。用无菌移液管吸取0.1mL各种菌悬液加入无菌培养皿中，夹取浸透有化合物样品溶液的滤纸片，将其放在培养基表面。将放好滤纸片的含菌培养皿分别在恒温箱中在37℃下、培养24h。取出后测量并记录抑菌圈的直径。数据采用SPSS 10.0进行分析。

(4)MIC测定结果：采用二倍稀释法。将1000、500、200、100、50μg·mL^-1系列浓度的样品溶液分别用2mL移液管移入各个平皿内，每个浓度重复3次，倒入约10mL已经高温灭菌的培养基中充分混匀，冷却凝固后，每皿加入0.1mL菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀进行培养。取出，观察结果，以不长菌的溶液浓度为最小，结果见表1。

表1抑菌试验结果

实验菌种	牡荆苷MIC(μg·mL^-1)	荭草苷MIC(μg·mL^-1)	异荭草苷MIC(μg·mL^-1)
				金黄色葡萄球菌	25	25	50
大肠杆菌	50	25	50

由表1可知，牡荆苷、荭草苷、异荭草苷的水溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有较强的抑制作用，且随浓度的增加抑菌效果增强。

2、抗氧化试验结果：

1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)是一种稳定的有机自由基，可以通过检测供试品溶液对DPPH自由基的清除能力表达其抗氧化性的强弱。利用DPPH溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定，是一种灵敏、简单易行的有效方法。

(1)实验条件：测定温度为37℃；震动：30s震动方向水平；DPPH溶液的配制：将DPPH溶于无水乙醇中配制成浓度为150μmol·L^-1的溶液，冷冻保存；Tecan InfiniteM200酶标仪(瑞士)；酶标板：96孔板。

(2)供试品溶液的配制：分别取牡荆苷、荭草苷、异荭草苷各25mg，用无水乙醇溶解并定容于25mL量瓶中。然后分别用无水乙醇稀释定容于量瓶中，配置成浓度分别为100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、12.5μg·mL^-1、6.25μg·mL^-1的供试品溶液。

(3)测定结果：用点样用移液枪在96孔板上等体积加入DPPH的乙醇溶液，不同浓度的供试品乙醇溶液，不同浓度供试品溶液与DPPH溶液的混合液(20μL的供试品溶液与180μL的DPPH溶液)分别点样，平行点样三次。30min后用Infinite M 200酶标仪测定吸光度，测定波长为517nm，测定结果见表2。

表2清除率试验结果

由表2可以看出，牡荆苷、荭草苷、异荭草苷对DPPH有很好的清除作用。开始时随着供试品溶液用量的增大清除作用呈现明显增强趋势，当用量达到一定量时，对DPPH的清除作用变化减小。试验结果表明，3个化合物均具有较强的抗氧化活性。

3、抗肿瘤试验结果

本试验通过细胞毒性试验分析牡荆苷、荭草苷、异荭草苷对人乳腺癌细胞(MCF-7)、胚胎绒毛膜癌细胞(JAR)和神经母细胞瘤细胞(N-2A)的增殖抑制率，以判断抗肿瘤活性大小。

(1)实验条件：试验用试药：Cell counting kit/CCK-8试剂盒、培养基、胎牛血清、霉素和链霉素、胰蛋白酶，实验用肿瘤细胞；Tecan Infinite M200酶标仪(瑞士)；酶标板：96孔板。

(2)样品溶液的配制：精密称取一定量牡荆苷、荭草苷、异荭草苷干粉，用含5％DMSO的无菌水稀释成6个浓度梯度。

(3)肿瘤细胞的培养：试验选用的人乳腺癌细胞、胚胎绒毛膜癌细胞和神经母细胞瘤细胞用RPMI-1640培养基+10％胎牛血清常规传代培养。

(4)抑制率测定：将3种肿瘤细胞胰蛋白酶消化后接种在96孔板上。37℃、5％CO₂温箱培养24h后更换新的培基，并加入样品溶液，使样品的最后浓度为：10.12、20.24、40.48、75.15、150.30、300.60μmol·L^-1。温箱继续培养48h。吸出培基，每孔加入一定量含有10％CCK-8的培基，温箱继续培养8h，然后在酶标仪450nm处测量各孔的吸光值，同时设置调零孔(培养基、0.5％DMSO生理盐水)，对照孔(细胞、培养基、0.5％DMSO生理盐水)。测定样品在不同浓度下对3种肿瘤细胞的增殖抑制率，试验结果见表3。

表3牡荆苷、荭草苷、异荭草苷对肿瘤细胞的增殖抑制率(％)试验结果

样品浓度(μmol·L^-1)	10.12	20.24	40.48	75.15	150.3	300.6
							牡荆苷对MCF-7的增殖抑制率	10.12	21.23	46.15	65.36	76.26	77.35
牡荆苷对JAR的增殖抑制率	10.45	26.87	38.34	68.67	78.56	81.08
							牡荆苷对N-2A的增殖扣制率	31.23	54.89	67.67	74.32	78.54	82.12
荭草苷对MCF-7的增殖抑制率	14.35	39.64	56.15	72.35	78.78	81.56
							荭草苷对JAR的增殖抑制率	16.76	31.47	48.39	66.84	79.56	82.56
荭草苷对N-2A的增殖抑制率	35.36	54.49	70.64	76.68	80.98	83.04
							异荭草苷对MCF-7的增殖抑制率	12.34	28.58	58.76	75.75	79.83	83.65
异荭草苷对JAR的增殖抑制率	17.33	31.56	47.47	61.67	78..75	81.55
							异荭草苷对N-2A的增殖抑制率	33.27	56.77	71.89	77.66	81.50	83.32

由表3可以看出，牡荆苷、荭草苷、异荭草苷对人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的增殖均具有一定的抑制作用，抑制强度随化合物浓度的增大而增强，且这种增长趋势随浓度的不断增加趋于平缓。经初步活性试验显示，含羞草中的牡荆苷、荭草苷、异荭草苷均具有不同程度的抑菌、抗氧化及抗肿瘤活性。

Claims

1.从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)原料处理：将含羞草全草粉碎成粗粉，过20～40目筛；

2.如权利要求1所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤2)中：超声提取的时间为40～50min。

3.如权利要求1所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤6)中：依次用10％、20％、40％、60％、70％的含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为6～12mL·min^-1。

4.如权利要求1所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤6)中：所述的大孔吸附树脂为Diaion HP-20大孔吸附树脂，色谱柱的径高比为1∶10～15。

5.如权利要求1所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤7)中：依次用10％、30％、50％、70％的含水乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为4～5mL·min^-1。

6.如权利要求1所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤7)中：所述的凝胶为Toyopearl HW-40凝胶，色谱柱的径高比为1∶15～18。

7.如权利要求1所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤8)中：以体积比6∶2∶1、7∶2∶2、7∶2∶3的乙酸乙酯-乙醇-水进行梯度洗脱。

8.如权利要求1所述的从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法，其特征在于步骤8)中：硅胶为160-200目。