CN102631379B - 红豆杉活性提取物的制备方法及其抗真菌的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种红豆杉活性提取物的制备方法及其抗真菌的应用，属于药用天然产物领域或保健食品、日化用品制造业。提取物为红豆杉脂溶性活性成分，制备方法包括50～95％乙醇提取，低极性溶剂萃取，离心，大孔树脂，得到总黄酮类含量为30～90％的红豆杉活性提取物。本发明采用制备药品、保健品及日化用品的常规方法，将红豆杉活性成分制备成各种制剂，例如片剂、喷雾剂、洗手液、沐浴露、浴足剂、洗发乳及按摩膏等。本发明制备得到的红豆杉活性成分在抑菌方面有显著的效果。本发明所述的红豆杉活性成分的制备方法，方法简单，生产成本低，产品中有效成分含量较高，质量稳定、易于控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Tasus)植物中提取红豆杉活性提取物(精制品)的方法，以及该红豆杉活性提取物在制备抗真菌药品、保健食品或日化用品的用途，属于药用天然产物领域或保健食品、日化用品制造业。
背景技术
红豆杉是一种珍贵的药用植物，为世界珍稀濒危树种，国家一级保护植物，被誉为“植物黄金”。南方红豆杉枝叶的次生代谢代谢产物中，其药用价值中除含有极少量的紫杉醇成分已在临床上广泛用于治疗各种恶性肿瘤，被认为是最好的抗癌药之一。红豆杉枝叶中的非紫杉烷类成分具有抗菌、消炎、止痒、驱虫等功效，可用于开发治疗粉刺、皮肤瘙痒等发病率高的顽固性皮肤疾病。随着人工种植面积的不断扩大，其生物量也在大幅增加，为了进一步发掘人工种植红豆杉枝叶的内在功效，合理、可持续利用资源，提升综合利用附加值以达到创品牌、增效益的目的，本发明通过多种活性筛选实验发现红豆杉活性提取物具有很好的抗菌作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种红豆杉活性提取物的制备方法及其抗真菌的应用，从红豆杉中提取具有生物活性的提取物，制备的红豆杉活性提取物成分含量明确。
本发明提供了一种红豆杉活性提取物抗真菌的应用，该红豆杉活性提取物作为抗菌的药物、保健品和日化用品的添加剂，并给出了有效剂量，用于抑制真菌时更为安全、稳定。
按照本发明提供的技术方案，所述红豆杉活性提取物的制备方法，特征是，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎置于提取釜中，加入3～10倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为30～70℃，提取时间为6～12小时，过滤得到滤液；反复提取1～4次，每次提取的温度为30～70℃，提取时间为6～12小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为C1～C5的醇类，质量百分浓度为50～95％；
(2)将粗提取液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩得到粗浸膏，减压浓缩的压力为7～10kPa，温度为50～60℃，时间为3～5小时；将粗浸膏溶于30～70℃的热水中，粗浸膏与热水的体积比为1∶2～3；再加入石油醚萃取，除去亲脂性杂质得到浸膏，粗浸膏与石油醚的体积比为1∶1～3；
(3)向浸膏中加入乙酸乙酯进行萃取，浸膏与乙酸乙酯的体积比为1∶1～3，萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取液；将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏，减压浓缩的压力为7～10kPa，温度为40～50℃，时间为1～2小时；
(4)向乙酸乙酯浸膏中加入水中进行溶解，乙酸乙酯浸膏与水的比例为15～25mg∶1mL；溶解后进行抽滤，滤去不溶于水的固体；抽滤后再进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7～10kPa，温度为50～60℃，时间为2～3小时，即得到红豆杉活性提取物，该红豆杉活性物的得率为0.8％～3％，总黄酮类的含量为30～50％。
本发明还保护一种红豆杉活性提取物的制备方法，特征是，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎置于提取釜中，加入3～10倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为30～70℃，提取时间为6～12小时，过滤得到滤液；反复提取1～4次，每次提取的温度为30～70℃，提取时间为6～12小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为C1～C5的醇类，质量百分浓度为50～95％；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7～10kPa，温度为50～60℃，时间为3～5小时；将减压浓缩后得到的粗提液在大孔吸附树脂上进行吸附，先用水洗去粗提液中的水溶性杂质，再用浓度为30％～90％的乙醇依次从低浓度到高浓度进行梯度洗脱，收集洗脱液；洗脱时，大孔吸附树脂的用量是粗提液体积的2～3倍，水的用量是粗提液体积的1～2倍，乙醇的用量是粗提液体积的3～5倍；
(3)将洗脱液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7～10kPa，温度为50～60℃，时间为7～8小时，得到红豆杉活性提取物；该红豆杉活性提取物的得率为0.2～2％，总黄酮类的含量为70～90％。
所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101、大孔吸附树脂SA-3或大孔吸附树脂AB-8。
本发明还保护一种红豆杉活性提取物的制备方法，特征是，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎置于提取釜中，加入3～10倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为30～70℃，提取时间为6～12小时，过滤得到滤液；反复提取1～4次，每次提取的温度为30～70℃，提取时间为6～12小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为C1～C5的醇类，质量百分浓度为50～95％；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7～10kPa，温度为80～60℃，时间为3～5小时；向减压浓缩后得到的粗提液中加入30℃～70℃的热水，粗提液与热水的体积比为1∶2～3，在2000～3000转/分钟的条件下离心20～30min，得到沉淀物和上清液；
(3)向步骤(2)得到的沉淀物中加入浓度为50～95％的乙醇进行回流提取，回流提取的温度为75～80℃，回流时间为2～3小时；将回流提取后得到的液体进行过滤；将过滤得到的滤液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7～10kPa，温度为50～60℃，时间为1～2小时；将减压浓缩后得到的浓缩液进行干燥，干燥温度为70～80℃，干燥时间为2～3小时，即得到所述的红豆杉活性提取物，该红豆杉活性提取物的得率为0.3％～4％，总黄酮类的含量为65～75％。
本发明还保护一种红豆杉活性提取物抗真菌的应用，特征是：所述红豆杉活性提取物作为抗菌物质或消炎物质添加到洗化用品中，红豆杉活性提取物的添加量为0.01～15％。
本发明采用制备药品、保健品及日化用品的常规方法，将红豆杉活性成分制备成各种制剂，例如片剂、喷雾剂、洗手液、沐浴露、浴足剂、洗发乳及按摩膏等。本发明制备得到的红豆杉活性成分在抑菌方面有显著的效果。本发明所述的红豆杉活性成分的制备方法，方法简单，生产成本低，产品中有效成分含量较高，质量稳定、易于控制。
附图说明
图1为实施例6得到的样品在360nm下的HPLC检测图。
图2为实施例9得到的样品在360nm下的HPLC检测图。
图3为实施例6得到的样品在272nm下的HPLC检测图。
图4为实施例9得到的样品在272nm下的HPLC检测图。
图5为红豆杉活性提取物抑制细菌实验照片。
其中图5中左侧为红豆杉活性提取物样品抑制金黄色葡萄球菌实验照片；图5中间为红豆杉活性提取物样品抑制沙门氏菌实验照片；图5中右侧为红豆杉活性提取物样品抑制大肠杆菌实验照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明得到的红豆杉活性提取物中总黄酮类的含量为30～90％，总黄酮类中的主要成分为槲皮素(quercetin)、紫杉双黄酮(sciadopitysin)和银杏黄酮(Ginkgetin)，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
槲皮素(quercetin)的结构式如式(I)所示，紫杉双黄酮(sciadopitysin)的结构式如式(II)所示，银杏黄酮(Ginkgetin)的结构式如式(III)所示：
实施例1：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成3公分每段置于提取釜中，加入3倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为70℃，提取时间为12小时，过滤得到滤液；重复提取1次，提取的温度为30℃，提取时间为12小时，提取后过滤，合并两次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为50％的甲醇；
(2)将粗提取液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩得到粗浸膏，减压浓缩的压力为7kPa，温度为50℃，时间为5小时；将粗浸膏溶于30℃的热水中，粗浸膏与热水的体积比为1∶2；再加入石油醚萃取，除去亲脂性杂质得到浸膏，粗浸膏与石油醚的体积比为1∶1；
(3)向浸膏中加入乙酸乙酯进行萃取，浸膏与乙酸乙酯的体积比为1∶1，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液；将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏，减压浓缩的压力为7kPa，温度为40℃，时间为2小时；
(4)向乙酸乙酯浸膏中加入水中进行溶解，乙酸乙酯浸膏与水的比例为15mg∶1mL；溶解后进行抽滤，滤去不溶于水的固体；抽滤后再进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7kPa，温度为50℃，时间为3小时，即得到红豆杉活性物，该红豆杉活性提取物的得率为0.8％，总黄酮类的含量为30％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例2：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成10公分每段置于提取釜中，加入10倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为70℃，提取时间为6小时，过滤得到滤液；反复提取4次，每次提取的温度为70℃，提取时间为6小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为95％的乙醇；
(2)将粗提取液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩得到粗浸膏，减压浓缩的压力为10kPa，温度为60℃，时间为3小时；将粗浸膏溶于70℃的热水中，粗浸膏与热水的体积比为1∶3；再加入石油醚萃取，除去亲脂性杂质得到浸膏，粗浸膏与石油醚的体积比为1∶3；
(3)向浸膏中加入乙酸乙酯进行萃取，浸膏与乙酸乙酯的体积比为1∶3，萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液；将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏，减压浓缩的压力为10kPa，温度为50℃，时间为1小时；
(4)向乙酸乙酯浸膏中加入水中进行溶解，乙酸乙酯浸膏与水的比例为25mg∶1mL；溶解后进行抽滤，滤去不溶于水的固体；抽滤后再进行减压浓缩，减压浓缩的压力为10kPa，温度为60℃，时间为2小时，即得到红豆杉活性物，该红豆杉活性提取物的得率为3％，总黄酮类的含量为50％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例3：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成4公分每段置于提取釜中，加入4倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为40℃，提取时间为7小时，过滤得到滤液；反复提取2次，每次提取的温度为40℃，提取时间为7小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为55％的丙醇；
(2)将粗提取液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩得到粗浸膏，减压浓缩的压力为8kPa，温度为55℃，时间为4小时；将粗浸膏溶于40℃的热水中，粗浸膏与热水的体积比为1∶2.5；再加入石油醚萃取，除去亲脂性杂质得到浸膏，粗浸膏与石油醚的体积比为1∶2；
(3)向浸膏中加入乙酸乙酯进行萃取，浸膏与乙酸乙酯的体积比为1∶2，萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液；将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏，减压浓缩的压力为8kPa，温度为45℃，时间为1.5小时；
(4)向乙酸乙酯浸膏中加入水中进行溶解，乙酸乙酯浸膏与水的比例为20mg∶1mL；溶解后进行抽滤，滤去不溶于水的固体；抽滤后再进行减压浓缩，减压浓缩的压力为8kPa，温度为55℃，时间为2.5小时，即得到红豆杉活性物，该红豆杉活性提取物的得率为1％，总黄酮类的含量为35％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例4：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成5公分每段置于提取釜中，加入5倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为50℃，提取时间为8小时，过滤得到滤液；反复提取3次，每次提取的温度为50℃，提取时间为8小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为60％的丁醇；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为9kPa，温度为50℃，时间为5小时；将减压浓缩后得到的粗提液在大孔吸附树脂上进行吸附，先用水洗去粗提液中的水溶性杂质，再用浓度为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇依次从低浓度到高浓度进行梯度洗脱，收集洗脱液；洗脱时，大孔吸附树脂的用量是粗提液体积的2倍，水的用量是粗提液体积的1倍，乙醇的用量是粗提液体积的3倍；所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101；
(3)将洗脱液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为9kPa，温度为50℃，时间为8小时，得到红豆杉活性提取物；该红豆杉活性提取物的得率为0.2％，总黄酮类的含量为70％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例5：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成6公分每段置于提取釜中，加入6倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为60℃，提取时间为9小时，过滤得到滤液；反复提取4次，每次提取的温度为60℃，提取时间为9小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为65％的正戊醇；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为10kPa，温度为60℃，时间为3小时；将减压浓缩后得到的粗提液在大孔吸附树脂上进行吸附，先用水洗去粗提液中的水溶性杂质，再用浓度为35％、45％、55％、65％、75％、85％的乙醇依次从低浓度到高浓度进行梯度洗脱，收集洗脱液；洗脱时，大孔吸附树脂的用量是粗提液体积的3倍，水的用量是粗提液体积的2倍，乙醇的用量是粗提液体积的5倍；所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂SA-3；
(3)将洗脱液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为10kPa，温度为60℃，时间为7小时，得到红豆杉活性提取物；该红豆杉活性提取物的得率为2％，总黄酮类的含量为90％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例6：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成7公分每段置于提取釜中，加入7倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为35℃，提取时间为10小时，过滤得到滤液；反复提取2次，每次提取的温度为35℃，提取时间为10小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为70％的异戊醇；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为9kPa，温度为55℃，时间为4小时；将减压浓缩后得到的粗提液在大孔吸附树脂上进行吸附，先用水洗去粗提液中的水溶性杂质，再用浓度为30％、45％、50％、65％、70％、85％的乙醇依次从低浓度到高浓度进行梯度洗脱，收集洗脱液；洗脱时，大孔吸附树脂的用量是粗提液体积的2.5倍，水的用量是粗提液体积的1.5倍，乙醇的用量是粗提液体积的4倍；所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂AB-8；
(3)将洗脱液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为9kPa，温度为55℃，时间为7.5小时，得到红豆杉活性提取物；该红豆杉活性提取物的得率为1.2％，总黄酮类的含量为54.52％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例7：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成3公分每段置于提取釜中，加入3倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为30℃，提取时间为12小时，过滤得到滤液；反复提取2次，每次提取的温度为30℃，提取时间为12小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为75％的正丁醇；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7kPa，温度为60℃，时间为5小时；向减压浓缩后得到的粗提液中加入30℃的热水，粗提液与热水的体积比为1∶2，在2000转/分钟的条件下离心30min，得到沉淀物和上清液；
(3)向步骤(2)得到的沉淀物中加入浓度为50％的乙醇进行回流提取，回流提取的温度为75℃，回流时间为3小时；将回流提取后得到的液体进行过滤；将过滤得到的滤液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7kPa，温度为50℃，时间为2小时；将减压浓缩后得到的浓缩液进行干燥，干燥温度为70℃，干燥时间为3小时，即得到所述的红豆杉活性提取物，该红豆杉活性提取物的得率为0.3％，总黄酮类的含量为65％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例8：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成10公分每段置于提取釜中，加入10倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为70℃，提取时间为6小时，过滤得到滤液；反复提取4次，每次提取的温度为70℃，提取时间为6小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为80％的异丁醇；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为10kPa，温度为80℃，时间为3小时；向减压浓缩后得到的粗提液中加入70℃的热水，粗提液与热水的体积比为1∶3，在3000转/分钟的条件下离心20min，得到沉淀物和上清液；
(3)向步骤(2)得到的沉淀物中加入浓度为95％的乙醇进行回流提取，回流提取的温度为80℃，回流时间为2小时；将回流提取后得到的液体进行过滤；将过滤得到的滤液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为10kPa，温度为60℃，时间为1小时；将减压浓缩后得到的浓缩液进行干燥，干燥温度为80℃，干燥时间为3小时，即得到所述的红豆杉活性提取物，该红豆杉活性提取物的得率为4％，总黄酮类的含量为75％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
实施例9：一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将红豆杉枝叶切碎成8公分每段置于提取釜中，加入8倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为50℃，提取时间为8小时，过滤得到滤液；反复提取3次，每次提取的温度为50℃，提取时间为8小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为质量百分浓度为85％的乙醇；
(2)将粗提液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为8kPa，温度为70℃，时间为4小时；向减压浓缩后得到的粗提液中加入60℃的热水，粗提液与热水的体积比为1∶2.5，在2500转/分钟的条件下离心25min，得到沉淀物和上清液；
(3)向步骤(2)得到的沉淀物中加入浓度为65％的乙醇进行回流提取，回流提取的温度为76℃，回流时间为2.5小时；将回流提取后得到的液体进行过滤；将过滤得到的滤液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩，减压浓缩的压力为8kPa，温度为55℃，时间为1.5小时；将减压浓缩后得到的浓缩液进行干燥，干燥温度为75℃，干燥时间为2.5小时，即得到所述的红豆杉活性提取物，该红豆杉活性提取物的得率为2.6％，总黄酮类的含量为59.40％，其中槲皮素(quercetin)含量不低于1％，紫杉双黄酮(sciadopitysin)含量不低于3％，银杏黄酮(Ginkgetin)含量不低于5％。
测试例一：对制备得到的红豆极活性提取物进行测试，测试红豆极活性提取物中总黄酮的含量。
仪器：UV-2501型紫外可见光分光光度计(岛沣公司)；METTLER AE 240十万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；1000μL移液枪。
试药：芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100080-200702)；红豆杉活性物；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为化学纯，乙醇为分析纯。
对照品溶液的制备：准确称取干燥至恒重的芦丁对照品0.2000g，置于100ml容量瓶中，加入乙醇使之溶解，摇匀并定容至100mL，冷藏，备用。
测试样品溶液的制备：准确称取于红外灯下干燥至恒重的红豆杉活性提取物粉末(实施例6和实施例9制备得到的样品)0.0500g，置于50mL容量瓶中，加入60％乙醇溶液溶解，摇匀并定容至50mL。
标准曲线的绘制：分别准确量取芦丁对照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL各置于25mL容量瓶中，分别准确加入5％亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，静置6min；准确加入10％硝酸铝溶液1.0mL，混匀，静置6min；准确加入4％氢氧化钠溶液10.0mL，用60％乙醇溶液定容至刻度，摇匀并静置15min，分别于501nm波长处测定吸收度，以吸收度值(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程：C＝82.19A-2.407(r＝0.9995)。结果表明，芦丁检测浓度在0.008～0.08mg/mL范围内线性关系良好。
样品含量测定：分别准确量取红豆杉活性提取物样品溶液0.500、0.625、0.750mL，置于25mL容量瓶中，分别准确加入5％亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，静置6min；准确加入10％硝酸铝溶液1.0mL，混匀，静置6min；准确加入4％氢氧化钠溶液10.0mL，用60％乙醇溶液定容至刻度，摇匀并静置15min，分别于501nm波长处测定吸收度，由回归方程计算总黄酮的质量分数，如表1所示，总黄酮的平均含量为57.68％。
表1
测试例二：HPLC法测定红豆杉活性提取物中主要黄酮的含量
仪器与试剂：高效液相色谱仪Aglient 1100系列，四元泵，自动进样器，检测器：Aglient 1100UV，272nm，360nm下检测，色谱柱：Aglient Zorbax SB-C18柱(250×4.6mm，5.0μm)，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，自制超纯水，红豆杉乙酸乙酯提取物由本药研中心提供。
色谱条件：流动相：0min，甲醇∶0.4％磷酸溶液维持比例(40∶60)，1～40min，流动相比例由(40∶60)线形改变到(80∶20)。柱温30℃，流速0.8mL/min。
对照品溶液的制备：分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、紫杉双黄酮、银杏黄酮对照品，各加甲醇制成每1mL分别含0.05mg的溶液，作为对照溶液。
测试样品溶液的制备：分别取0.1008g和0.1001g红豆杉活性提取物(实施例6和实施例9制备得到的样品)加入到100mL圆底烧瓶中，分别加入5mL25％盐酸溶液和25mL甲醇，各加入止暴剂2粒，于80℃水浴锅上冷凝回流2小时；2小时后停止加热，待冷却后过滤转移至50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。
测试结果如图1～图4所示，图1为实施例6得到的样品在360nm下的HPLC检测图，图2为实施例9得到的样品在360nm下的HPLC检测图，图3为实施例6得到的样品在272nm下的HPLC检测图，图4为实施例9得到的样品在272nm下的HPLC检测图。
测试例三：琼脂扩散法测定抑菌圈
供试病原菌：G+：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus allreus)，沙门氏菌，G-：大肠杆菌(Escherichia coli)。菌株活化后，用无菌水校正至0.5麦氏比浊单位，作为供试菌液。用灭菌棉签蘸取供试菌液，均匀涂布于MH琼脂平板上，用记号笔在平板底部将平板划分成四等分，用直径6mm打孔器在每份中央打孔，去除孔内琼脂，将红豆杉活性提取物样品用少量二甲基亚砜溶解后加于孔中，以满而不溢为宜并作好标记；同时以金银花提取物作为阳性对照，MH肉汤作为阴性对照；37℃培养18～24小时，观察有无抑菌圈。
如图5所示，图5中左侧为红豆杉活性提取物样品抑制金黄色葡萄球菌实验照片；图5中间为红豆杉活性提取物样品抑制沙门氏菌实验照片；图5中右侧为红豆杉活性提取物样品抑制大肠杆菌实验照片。
结果表明，红豆杉活性提取物对3种供试病原菌均表现出一定程度的抑菌效果，抑菌谱广，其中对金黄色葡萄球菌效果最好，抑菌斑最大。
测试例四：微量液体稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)
供试病原菌：G+：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus allreus)，沙门氏菌，G-：大肠杆菌(Escherichia coli)。菌株活化后，用无菌水校正至0.5麦氏比浊单位，1∶200稀释，使菌液浓度为105CFU·mL-1。红豆杉活性提取物样品经二甲基亚砜溶解后，用MH液体培养基进行适当稀释。在微量聚乙烯孔板中加入各种不同浓度的红豆杉活性提取物样品100μL，并接种100μL稀释好的各菌液，同时设立菌液对照和红豆杉活性提取物样品对照，37℃培养24小时，观察各孔中培养液的浊度，将孔底部不出现细菌沉淀的最低浓度作为该样品对细菌的最小抑菌浓度。
结果表明，红豆杉活性提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别达到4.5mg/mL和7.5mg/mL。
测试例五：
实验菌：所有实验用菌均为卫生部医学微生物菌(毒)种保藏管理中心真菌中心提供的标准菌株，其中包括：质控株：白念珠菌(Candida albicans)ATCC90028；曲霉属：熏烟色曲霉(Aspergillus fumigatus)ATCC 3626；毛癣菌属：红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)ATCC 4438；计3属3种3株常见致病真菌。
培养基：以不含任何抗生素的含2％葡萄糖RMPI-1640液体培养基作为基础培养基。
实验研究方法：具体参照美国临床和实验室标准化研究所(Clinical andLaboratory Standards Institute，US，CLSI)颁布的酵母菌M27-A3和丝状真菌M38-A2的标准方法进行实验。
实验步骤与结果：用分析天平精确称取植物红豆杉等7种提取物的样品，先用适量DMSO溶解，配制成10mg/ml的原液，再各取一份分别用灭菌蒸馏水作5倍稀释，再将0.3ml加入2.7ml的灭菌蒸馏水中作10倍稀释得200μg/ml的工作液，再依次倍比稀释形成10个浓度梯度，溶媒DMSO浓度≤2％。第11孔为2％DMSO溶媒对照，第12孔为生长对照。96孔培养板每孔分别加入不同药物及不同浓度的0.1ml药液，置于-20℃冰箱冻存。第2批次的配制方法与第1批完全一致。
上述实验菌先活化，酵母菌在沙堡弱琼脂培养基(SDA)上，30℃培养48小时；丝状真菌在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，26℃培养7-10天；用无菌生理盐水配成菌悬液，用比浊计比浊，浊度为0.5麦氏单位；上述配好的菌液，用RPMI-1640培养基做50倍稀释，再取0.1ml菌液，加入到放置室温2小时后的包被药物的培养板中。药液和菌液混匀后，放置培养箱中孵育。
植物红豆杉提取物的样品分别为：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、2％DMSO溶媒对照、生长对照。
接种菌量：酵母菌：1.0～5.0×103cfu/mL；丝状真菌：0.4～5×104cfu/mL。
培养条件：酵母菌：30℃、48～72小时；丝状真菌：26℃、7天。
结果判定方法：
最低抑菌浓度(MIC)：以空白对照和溶媒对照孔菌已生长为参照，药基孔中菌未生长表示有抑菌作用，菌已生长表示无抑菌作用；菌未生长的最低药物浓度即为MIC，用μg/mL表示。
最低杀菌浓度(MFC)：将药基孔被抑菌的菌液，用吸头反复吹打后，取出0.1mL加至不含抗生素的沙堡液基2mL中，混匀，在26℃培养7天。如果有菌生长为仅有抑菌作用，无杀菌作用；如仍未生长表示有杀菌作用，菌未生长的最低药物浓度即为MFC，用μg/mL表示。
每次试验按规定设3个平行孔，用完全一样的方法试验前后计做2遍。以保证实验的准确性和真实性。
试验结果：
植物红豆杉提取物2个样品对3属3种3株常见致病真菌最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)测定结果见表2、表3。
表2植物红豆杉提取物的样品体外对3属3种3株常见致病菌MIC测定结果
表3物红豆杉提取物的样品体外对3属3种3株常见致病菌MFC测定结果
实验结果分析：
植物红豆杉的2个提取物样品采用美国国家临床和实验室标准化研究所推荐的抗真菌药效试验方法，按照酵母菌M27-A3和丝状真菌M38-A2方案进行了初筛试验。结果表明，对白念珠菌标准株(ATCC90028)，红豆杉样品2MIC＝79.37μg/ml，MFC＞100μg/ml。对熏烟色曲霉标准株(ATCC3626)，红豆杉样品2MIC＝12.5μg/ml，MFC＞100μg/ml。对红色毛癣菌标准株(ATCC4438)，红豆杉样品2MIC＝0.36μg/ml，MFC＝5.57μg/ml。
以上结果显示，红豆杉样品2较好，对三属真菌的抗真菌作用强弱依次为毛癣菌属的红色毛癣菌(ATCC90028)、曲霉属熏烟色曲霉(ATCC3626)，对白念珠菌(ATCC90028)抗菌作用较差。MIC和MFC测定结果显示，具有良好的抑菌作用，但杀菌作用不强，是较强的抑真菌剂。
测试例六：抗真菌活性检测
供试病原菌：须癣毛癣菌。
SDA琼脂平板涂板法测抑菌活性：将试验所用的真菌菌种接种至SDA平面，提取物样品用少量二甲基亚砜溶解后，滴加在滤纸，置于平板上，28℃培养72小时，观察有无抑菌圈。
实验结果：结果表明，红豆杉提取物对皮肤癣菌均表现出一定程度的抑菌效果，其中乙酸乙酯提取物活性最高，可以进一步研究其制剂并用于临床，以治疗常见的皮肤真菌。
实施例10：一种红豆杉活性提取物抗真菌的应用
将去离子水，矿物油，香精，蜂蜜，吐温-40，司盘80，甘油或羊毛脂中的一种或几种混匀制成混合液，再将红豆杉活性提取物溶于混合液中，混匀，过滤，制成日化用品；红豆杉活性提取物的添加量为0.01％。
实施例11：一种红豆杉活性提取物抗真菌的应用
将去离子水，矿物油，香精，蜂蜜，吐温-40，司盘80，甘油或羊毛脂中的一种或几种混匀制成混合液，再将红豆杉活性提取物溶于混合液中，混匀，过滤，制成日化用品；红豆杉活性提取物的添加量为15％。
实施例12：一种红豆杉活性提取物抗真菌的应用
将去离子水，矿物油，香精，蜂蜜，吐温-40，司盘80，甘油或羊毛脂中的一种或几种混匀制成混合液，再将红豆杉活性提取物溶于混合液中，混匀，过滤，制成日化用品；红豆杉活性提取物的添加量为5％。
本发明的优点在于，提供了红豆杉活性提取物的新用途。以红豆杉活性提取物为原料制备成洗面奶，沐浴露，浴足剂，洗发乳，按摩膏等，具有滋润，营养肌肤，收缩毛孔，抗衰老，养颜以及香体，促进微循环的作用。
Claims (1)
1.一种红豆杉活性提取物的制备方法，其特征是，包括以下工艺步骤：
（1）将红豆杉枝叶切碎置于提取釜中，加入3~10倍红豆杉枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为30~70℃，提取时间为6~12小时，过滤得到滤液；反复提取1~4次，每次提取的温度为30~70℃，提取时间为6~12小时，每次提取后过滤，合并每次过滤的滤液得到粗提取液；所述低级醇为C1~C5的醇类，质量百分浓度为50~95%；
（2）将粗提取液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩得到粗浸膏，减压浓缩的压力为7~10kPa，温度为50~60℃，时间为3~5小时；将粗浸膏溶于30~70℃的热水中，粗浸膏与热水的体积比为1:2~3；再加入石油醚萃取，除去亲脂性杂质得到浸膏，粗浸膏与石油醚的体积比为1:1~3；
（3）向浸膏中加入乙酸乙酯进行萃取，浸膏与乙酸乙酯的体积比为1:1~3，萃取3~5次，合并乙酸乙酯萃取液；将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏，减压浓缩的压力为7~10kPa，温度为40~50℃，时间为1~2小时；
（4）向乙酸乙酯浸膏中加入水中进行溶解，乙酸乙酯浸膏与水的比例为15~25mg:1mL；溶解后进行抽滤，滤去不溶于水的固体；抽滤后再进行减压浓缩，减压浓缩的压力为7~10kPa，温度为50~60℃，时间为2~3小时，即得到红豆杉活性物，该红豆杉活性提取物的得率为0.8%~3%，总黄酮类的含量为30~50%。
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