CN109999062A - 茶藨子果实有机酸提取物 - Google Patents

Abstract

茶藨子果实有机酸提取物。本发明提供了一种狭果茶藨子果实提取物，有机酸含量为3.5～5.0％w/w，黄酮含量在0.5％w/w以下。本发明研究发现，上述提取物具有良好的抗菌活性，尤其针对白色念珠菌和铜绿假单胞菌的抑制活性较为突出。

Description

茶藨子果实有机酸提取物

技术领域

本发明属于涉及一种茶藨子果实提取物及其制备方法。

技术背景

茶藨子属植物形态变异较大，类型复杂，全世界约有160种，主要分布于欧洲和北美气候温暖地区，在亚洲、南美和北非也分布广泛，中国境内有59种30个变种，仅青海省就分布有11种1个变种。

狭果茶藨子(Ribes stenocarpum Maxim.)属虎耳草科茶藨子属植物，为落叶灌木，生于海拔2800米以下的山坡灌丛、杂木林下或山沟中。《凉山州中草药资源普查名录》记载狭果茶藨子的茎和枝可用于肝炎的治疗，《晶珠本草》中记载茶藨子有敛毒、除黄水并能收敛各种脉管病的作用。狭果茶藨子的果实为多汁浆果，风味独特多样，从苦、酸到酸甜可口，老百姓通常将茶藨子的果实生食用于防治感冒。

发明内容

本发明的目的在于对茶藨子果实的进一步研究开发。

具体地，本发明提供了一种茶藨子果实提取物，该提取物中，以干燥品计，有机酸含量为3.5～5.0％w/w，黄酮含量在0.5％w/w以下。

本发明所述“w/w”为质量比，可以是g/g，也可以是kg/kg、mg/mg等。

本发明一个具体实施方式中，所提供的提取物中有机酸含量为4.0～4.5％，黄酮含量为0％。

上述提取物实际为茶藨子果实的乙醇提取物。进一步地，所述提取物的制备方法包括如下内容：

(1)取除去乙醇后的茶藨子果实乙醇提取物；

(2)水相调节pH至10～12，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；

(3)水相调节pH至1～3，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；

(4)合并水相，除去溶剂后，即得茶藨子果实提取物。

可以根据需求，制备出干燥提取物或者含水提取物。

本发明研究发现，上述提取物具有良好的抗菌活性，尤其针对白色念珠菌和铜绿假单胞菌的抑制活性较为突出。

其中，其提取物的制备过程中，所述乙醇浓度为60～85％v/v。

本发明一个具体实施方式中，乙醇浓度选自70～80％v/v，可以是70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％。

其中，内容(2)中使用碱调节pH，为水溶性碱，多使用无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾。

其中，内容(3)中使用酸调节pH，多使用无机酸，例如盐酸、氢溴酸。

本发明还提供了一种茶藨子果实提取物的制备方法，包括如下内容：

(1)取除去乙醇后的茶藨子果实乙醇提取物；

(2)水相调节pH至10～12，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；

(3)水相调节pH至1～3，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；

(4)合并水相，除去溶剂后，即得茶藨子果实提取物。

本发明还提供了上述方法制备得到的茶藨子果实提取物。该提取物中的有机酸、黄酮以及其他成分的含量，依据具体检测而得。

本发明中，所述茶藨子果实为茶藨子属植物的果实。本发明一个具体实施方式中，所述茶藨子属植物选自狭果茶藨子。

本发明中，乙醇提取物的制备方法，采用常规的方法即可，例如加热提取、常温提取、加压提取、常压提取，具体表现可以是回流提取、浸渍提取、渗渌提取、微波辅助提取、超声提取、闪式提取等等。

本发明中，乙酸乙酯提取，主要是使用乙酸乙酯从水相中提取分离物质，利用了相似相容原理，通过溶解度差异、乙酸乙酯和水的不溶性质，将不同的成分分离。

本发明中“除去乙醇”是指，尽量将提取液中的乙醇除去。当然，在本领域常用的操作方法中，乙醇往往难以尽去，可能会出现有乙醇残留的情况，但少量的乙醇残留也属于本发明的保护范畴。常用的方法多为减压回收，当然也可以常压加热挥发乙醇。

本发明中“除去溶剂”，与“除去乙醇”相似。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的各种材料信息如下。

狭果茶藨子果实于2017年9月采自青海省互助县，由青海大学农牧学院孙海群教授鉴定为狭果茶藨子(Ribes stenocarpum Maxim.)果实，烘干粉碎备用。大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Monilia albican)、铜绿芽孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)购自杭州百思生物技术有限公司。

实验动物：健康昆明小鼠50只，体重(20±2g)，SPF级，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

KC-130小型粉碎机北京开创同和科技发展有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器河南予华仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；250B生化培养箱常州国华电器有限公司；YM-75立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；UV－2600紫外可见分光光度计岛津企业管理有限公司；SC2201匀浆机上海小岩工贸发展有限公司；XW-80A旋涡混匀器上海驰唐电子有限公司；H/T16MM-台式高速离心机湖南赫西装备仪器有限公司；SM600酶标仪上海永创医疗器械有限公司；DHG-9240A电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；14-0807超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司；ESJ110-4B电子天平沈阳龙腾电子有限公司。

MH琼脂培养基、MH肉汤培养基等生物试剂购自杭州百思生物技术有限公司；肌糖原(MG)试剂盒、肝糖原(LG)试剂盒、血清尿素氮(BUN)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯。

实施例1本发明提取物的制备(即有机酸提取物I)

称取100g狭果茶藨子果实样品，加入75％乙醇浸泡1h，于索氏提取器中加热回流提取两次，每次2-3h，冷却后抽滤，收集滤液并浓缩至无醇味后加入5％氢氧化钠溶液调PH至11，用乙酸乙酯反复萃取溶液至无色，收集碱水层，5％盐酸调PH至2，再用乙酸乙酯反复萃取至无色，合并萃取液，减压回收溶剂，得有机酸提取物Ⅰ。

实施例2本发明提取物的制备(即有机酸提取物I)

称取1000g狭果茶藨子果实样品，加入70％乙醇浸泡2h，在40～50℃下浸渍提取3次，每次4-12小时，收集提取液并浓缩至无醇味后加入10％氢氧化钾溶液调PH至12，用乙酸乙酯反复萃取溶液至无色，收集碱水层，5％氢溴酸调PH至3，再用乙酸乙酯反复萃取至无色，合并萃取液，减压回收溶剂，得有机酸提取物Ⅰ。

本发明后续试验中，将提取物制备成干浸膏，便于计算。

总有机酸含量测定 分别称取狭果茶藨子果实不同提取物0.5g，50％乙醇溶解并定容至50mL，吸取10mL于250mL锥形瓶中，加1％酚酞指示剂2滴，用0.1mol/L的氢氧化钠标准液滴定至中性，记录氢氧化钠溶液用量，根据下列公式计算总有机酸含量，重复三次取平均值。

总有机酸含量(％)＝(C×V×40×K)/(m×10/50)×100％ (公式1)

式中：V-滴定消耗氢氧化钠溶液体积(mL)；C-氢氧化钠标准液浓度(mol/L)；m-样品质量(g)；K-换算成主要酸的系数(即1毫摩尔氢氧化钠相当于主要酸的系数，核果类采用酒石酸，茶藨子为核果，K＝0.075)。

总有机酸含量的测定结果

表1不同提取物的有机酸含量测定结果

由表1可知，狭果茶藨子果实不同极性部位中总有机酸的含量有差异，有机酸提取物Ⅰ中有机酸含量最高，为4.18％，正丁醇提取物Ⅳ的有机酸含量最少，为0.66％，两种乙酸乙酯提取物中有机酸含量差异不大，说明乙酸乙酯提取物Ⅱ在大孔吸附树脂柱层析过程中有机酸主要吸附于聚酰胺大孔吸附树脂，且后期通过碱水洗脱可有效回收大部分有机酸，达到有机酸初步富集纯化的目的。

总黄酮含量测定绘制芦丁标准曲线：用80％乙醇溶解芦丁对照品10mg，定容至25ml，准确吸取对照品0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL分别置于10mL容量瓶中，采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法测定各溶液的吸光度值，以芦丁标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品中总黄酮含量测定：分别称取狭果茶藨子果实不同提取物0.1g，80％乙醇溶解后定容至50mL，吸取0.5mL样品于10mL容量瓶中，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL静置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL静置6min，再加入4％氢氧化钠溶液4mL，待充分反应后蒸馏水定容，于356nm处测定样品溶液的吸光值，根据标准曲线方程及下列公式计算样品的总黄酮含量。

总黄酮含量(％)＝(C×K×V)/M×100％ (公式2)

式中：C-测定的不同吸光度值所对应的样品总黄酮浓度(mg/mL)；K-稀释倍数；V-移取稀释后的样品溶液体积(mL)；M-称取的样品质量(g)。

标准曲线及总黄酮化合物含量测定芦丁标准曲线与回归方程

芦丁标准曲线回归方程：y＝30.421x+0.1623，R²＝0.9952，符合线性关系。

总黄酮化合物含量测定结果

表2不同提取物中总黄酮化合物含量测定结果

由表2可知，黄酮化合物主要存在于乙酸乙酯提取物Ⅱ、乙酸乙酯提取物Ⅲ和正丁醇提取物Ⅳ中，且三种提取物中总黄酮化合物含量较为接近，说明分布于狭果茶藨子果实中的黄酮化合物极性差异较大。

其他不同提取物的制备方法如下：

乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的制备称取一定量的狭果茶藨子果实样品，90％乙醇加热回流提取三次，收集滤液，滤渣再用70％乙醇提取三次，过滤合并所有滤液，浓缩后用石油醚萃取，弃去石油醚层，用乙酸乙酯萃取水相，浓缩有机相，得乙酸乙酯提取物Ⅱ，水相再用正丁醇萃取，浓缩正丁醇层，得正丁醇提取物Ⅳ。乙酸乙酯提取物Ⅱ过聚酰胺大孔吸附树脂，依次用2倍柱体积的蒸馏水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和无水乙醇洗脱，然后将树脂倒出，用2％盐酸浸泡树脂2h，蒸馏水洗至中性，再加入2％氢氧化钠溶液浸泡2h，过滤收集滤液，浓缩得到乙酸乙酯提取物Ⅲ。

狭果茶藨子果实提取物的抑菌活性研究

1菌悬液的制备选取大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿芽孢杆菌作为受试菌种，斜面活化后接种至肉汤培养基制备菌悬液，37℃恒温培养4h，灭菌生理盐水稀释培养液，用麦氏比浊管比浊至0.5麦氏单位。

2药敏片的制备称取5g提取物，50％乙醇水浴加热使溶解，调整药液浓度分别为100mg/mL、200mg/mL、300mg/mL，将灭菌空白药敏片浸入不同浓度药液中，浸泡12h后烘干备用。

3K-B纸片扩散法测定不同提取物的抑菌作用将熔化并灭菌的琼脂培养基冷却至50℃倒平板备用，棉签蘸取菌悬液均匀涂布培养基，反复几次，每次将平板旋转60度。用镊子将浸有不同浓度提取物的药敏片分别贴于培养基表面，用镊尖压平，以50％乙醇浸泡过的药敏片作为空白对照，以氨苄西林(10IU/片)、庆大霉素(10IU/片)、青霉素(10IU/片)药敏片为阳性对照，37℃恒温培养24h，游标卡尺测量菌落直径，十字交叉测量，取平均值。

4二倍稀释法测定最小抑菌浓度和最低杀菌浓度配制200mg/mL的狭果茶藨子果实提取物，分别取1体积的不同提取物和已灭菌的液体培养基于试管中，混合均匀，以对倍稀释法逐管稀释药液，再加入等体积的稀释级菌液至各抑菌管，摇匀，使不同提取物终浓度为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56mg/mL，并设置空白对照，将各试管置于37℃培养箱中培养24h。

最低抑菌浓度(MIC)的判定：观察培养后各试管的浑浊情况，试管澄清且摇匀后仍澄清者，认为该管无菌生长，若试管内呈浑浊状态则表明有菌生长，从无菌生长试管中找出最低浓度试管，其所对应的药液浓度即为最低抑菌浓度。

最低杀菌浓度(MBC)的判定：依次将未见细菌生长的各管移取适量液体均匀涂布于固体培养基平板上，37℃培养24h，以平板上菌落数少于5个的最小药液浓度作为最低杀菌浓度(MBC)。

5提取物的抑菌活性结果

5.1K-B纸片扩散法实验结果与分析

表3提取物浓度为100mg/mL时抑菌圈直径

注：抑菌圈直径大于20mm为极敏；15-20mm为高敏；10-15mm为中敏；7-9mm为低敏；小于6mm为不敏感。

表4提取物浓度为200mg/mL时的抑菌圈大小

注：抑菌圈直径大于20mm为极敏；15-20mm为高敏；10-15mm为中敏；7-9mm为低敏；小于6mm为不敏感。

表5提取物浓度为300mg/mL时的抑菌圈大小

注：抑菌圈直径大于20mm为极敏；15-20mm为高敏；10-15mm为中敏；7-9mm为低敏；小于6mm为不敏感。

由表3、表4、表5可知，不同提取物对不同细菌的抑制活性有差异。有机酸提取物Ⅰ对白色念珠菌和铜绿假单胞菌抑制效果也不错，浓度为300mg/mL时优于阳性对照药青霉素(10IU/片)，浓度为100mg/mL、200mg/mL时分别与氨苄西林(10IU/片)和庆大霉素(10IU/片)相当。

5.2最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)

表6不同提取物对白色念珠菌MIC和MBC值测定结果

表7不同提取物对铜绿假单胞菌MIC和MBC值测定结果

由表6、表7可知，狭果茶藨子果实中不同提取物对不同菌种的MIC和MBC值有差异，其中有机酸提取物Ⅰ和乙酸乙酯提取物Ⅱ对白色念球菌和铜绿假单胞菌抗菌活性最好，且MIC值均为1.56mg/mL，MBC值均为3.13mg/mL。

Claims (10)

1.一种茶藨子果实提取物，其特征在于：有机酸含量为3.5～5.0％w/w，黄酮含量在0.5％w/w以下。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：有机酸含量为4.0～4.5％，黄酮含量为0。

3.根据权利要求1或2所述的提取物，其特征在于：所述提取物为茶藨子果实的乙醇提取物。

4.根据权利要求1或2所述的提取物，其特征在于：所述提取物的制备方法包括如下内容：

(1)取除去乙醇后的茶藨子果实乙醇提取物；

(2)水相调节pH至10～12，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；进一步地，pH选自11；

(3)水相调节pH至1～3，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；进一步地，pH选自2；

(4)合并水相，除去溶剂后，即得茶藨子果实提取物。

5.根据权利要求3或4所述的提取物，其特征在于：所述乙醇浓度为60～85％v/v。

6.根据权利要求5所述的提取物，其特征在于：所述乙醇浓度为70～80％v/v。

7.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于：内容(2)中使用无机碱调节pH；进一步选自氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种。

8.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于：内容(3)中使用无机酸调节pH；进一步选自盐酸、氢溴酸中的一种或多种。

9.一种茶藨子果实提取物的制备方法，其特征在于：包括如下内容：

(1)取除去乙醇后的茶藨子果实乙醇提取物；

(2)水相调节pH至10～12，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；

(3)水相调节pH至1～3，用乙酸乙酯提取至水相无色或接近无色；

(4)合并水相，除去溶剂后，即得茶藨子果实提取物。

10.根据权利要求1～8任意一项所述的提取物或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述茶藨子果实为茶藨子属植物的果实；进一步地，所述茶藨子属植物选自狭果茶藨子。